一种用于抗CTLA-4单克隆抗体生物学活性检测的RGA方法及其应用

摘要

本发明公开了一种用于抗CTLA‑4单克隆抗体生物学活性检测的RGA方法及其应用。所述方法包括构建得到稳定表达CD3scFv的靶细胞，以及稳定表达CTLA‑4基因和报告基因的效应细胞，将靶细胞和效应细胞按照一定的比例进行混合后，加入抗CTLA‑4单克隆抗体药物样品及参比品激活信号通路，根据测定的报告基因信号值拟合四参数曲线确定抗体的生物学活性。本发明针对抗CTLA‑4单克隆抗体生物学活性检测建立了准确、灵敏、快速、专属性强、耐用性高的定量检测方法，对抗CTLA‑4单克隆抗体的质量控制和临床应用具有重要的意义。

权利要求

1.一种用于抗CTLA‑4单克隆抗体生物学活性检测的RGA方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1) 构建靶细胞和效应细胞；

(2) 将靶细胞悬液和效应细胞悬液按照一定的比例进行混合得到混合液；

(3) 将抗CTLA‑4单克隆抗体药物样品及参比品等比例稀释，将稀释后的抗体分别转移至步骤(2)中的混合液中，孵育培养；

(4) 向步骤(3)中加入荧光素酶底物，根据信号值拟合四参数曲线确定抗体的生物学活性；

所述构建的靶细胞为稳定表达CD3 scFv的Raji细胞；

所述构建的效应细胞为稳定表达CTLA‑4基因和报告基因的Jurkat细胞。

5

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，制备的靶细胞悬液的细胞密度为6×10 个/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述报告基因为荧光素酶报告基因。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述荧光素酶报告基因为由NFAT应答元件驱动表达的荧光素酶报告基因。

6

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，制备的效应细胞悬液的细胞密度为6×10个/mL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，抗CTLA‑4单克隆抗体等比例稀释的比例为

1:3‑1:5。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，抗CTLA‑4单克隆抗体等比例稀释的比例为

1:4。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，孵育培养时间为4‑7h。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，孵育培养时间为6h。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述效应细胞和靶细胞的比例为2:1‑25:

1。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述效应细胞和靶细胞的比例为10:1。

12.一种用于抗CTLA‑4单克隆抗体药物生物学活性评价的组合物，其特征在于，所述组合物包括如下组分：

(1) 稳定表达CD3 scFv的Raji靶细胞，稳定表达CTLA‑4基因和报告基因的Jurkat效应细胞；

(2) 抗CTLA‑4单克隆抗体药物样品和参比品；

(3) 荧光素酶底物。

13.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述报告基因为荧光素酶报告基因。

14.根据权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述荧光素酶报告基因为由NFAT应答元件驱动表达的荧光素酶报告基因。

15.权利要求1‑11任一项所述的方法在制备评价抗CTLA‑4单克隆抗体药物生物学活性的工具中的应用；

所述工具包括产品、装置。

16.权利要求12‑14任一项所述的组合物在制备评价抗CTLA‑4单克隆抗体药物生物学活性的工具中的应用；

所述工具包括产品、装置。

说明书

一种用于抗CTLA‑4单克隆抗体生物学活性检测的RGA方法及

其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，涉及一种生物活性的检测方法，具体而言，涉及一种用于抗CTLA‑4单克隆抗体生物学活性检测的RGA方法及其应用。

背景技术

[0002] 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原‑4(cytotoxic T‑Lymphocyte‑associated antigen‑4,CTLA‑4)，又名CD152，基因位于2号染色体长臂3区3带(2q33)，编码233个氨基
酸，是免疫球蛋白相关受体家族成员之一。CTLA‑4表达于活化的T细胞的表面，其在T细胞中
高表达能显著抑制T细胞活性，进而削弱T细胞杀伤癌细胞的能力，是T细胞免疫应答的重要
负调节因子，同时，CTLA‑4也是第一个发现的作为肿瘤免疫疗法中具有治疗潜力的免疫检
查点。T细胞的活化同时依赖于两种信号：一种为抗原信号，另一种为共刺激信号。抗原信号
主要由T细胞表面的T细胞受体(TCR)识别并结合抗原呈递细胞(APC)表面的的主要组织相
容性复合物(MHC)分子而产生，共刺激信号主要由T细胞表面的协同刺激分子CD28与抗原呈
递细胞表面的的B7分子结合而产生。

[0003] 以往针对肿瘤的免疫治疗，主要包括开发小分子靶点药物、抗肿瘤疫苗和过继性细胞免疫治疗等手段，近年来，开发靶向肿瘤免疫检查点的抑制剂，成为一种新型的免疫疗
法。例如，通过设计靶向CTLA‑4的阻断剂，降低其对T细胞活化的抑制作用，从而达到抗肿瘤
的目的。开发靶向CTLA‑4的抗体药物用于肿瘤的免疫治疗是目前的研究热点之一。当前市
场上具有代表性的CTLA‑4单抗药物主要有Ipilimumab(伊匹木单抗)和Tremelimumab，临床
上主要用于黑色素瘤等实体瘤的治疗，相对于传统的化疗取得了更好的疗效。

[0004] 目前，仍然缺乏基于细胞的生物学活性测定方法来检测抗CTLA‑4单克隆抗体的生物学活性，本发明开发并验证了一种报告基因测定方法(RGA)，通过构建两种细胞株以测定
CTLA‑4单克隆抗体的生物学活性，分别是稳定表达抗CD3单链抗体片段(scFv)的靶细胞，称
为Raji‑CD3scFv细胞株，以及稳定表达CTLA‑4基因和由NFAT应答元件驱动表达的荧光素酶
报告基因的效应细胞，称为Jurkat‑CTLA‑4‑NFAT‑luc细胞株，该方法显示出良好的专属性、
准确性、精密度和耐用性，同时，该方法对抗CTLA‑4单克隆抗体药物的结构变化敏感，不仅
能用于批次质量放行和稳定性的检测，还可以用于新的抗CTLA‑4单克隆抗体的开发和表征
中。

发明内容

[0005] 针对现有的抗CTLA‑4单克隆抗体的生物学活性检测方法的不足，本发明的目的在于提供用于抗CTLA‑4单克隆抗体生物学活性检测的RGA方法，所述方法包括构建得到稳定
表达CD3 scFv的Raji靶细胞，以及稳定表达CTLA‑4基因和荧光素酶报告基因的Jurkat效应
细胞，将靶细胞和效应细胞按照一定比例混合后，加入抗CTLA‑4单克隆抗体药物样品进行
检测。通过对所述方法的优化、验证和实际应用，证明了该方法能够用于抗CTLA‑4单克隆抗
体的稳定性测试，以及抗CTLA‑4单克隆抗体药物的活性评价和批次质量放行。

[0006] 本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：

[0007] 本发明的第一方面提供了一种用于抗CTLA‑4单克隆抗体生物学活性检测的RGA方法。

[0008] 本发明通过在Jurkat细胞中共转染表达CTLA‑4和NFAT‑luc报告基因，构建转基因细胞Jurkat‑CTLA‑4‑NFAT‑luc(抗CTLA‑4单抗转基因测活效应细胞)，在Raji细胞中转染表
达CD3scFv(CD3单链抗体)，构建转基因细胞Raji‑CD3scFv(抗CTLA‑4单抗转基因测活靶细
胞)，当Raji细胞表达的CD3scFv与Jurkat细胞上TCR复合物中的CD3分子结合，激活信号通
路，而Jurkat细胞上表达的CTLA‑4分子结合于Raji细胞表面组成性表达的CD80/86分子时，
则将抑制这一信号通路，当抗CTLA‑4单克隆抗体与CTLA‑4结合，可以抑制CTLA‑4与CD80/86
的结合，从而阻断该抑制作用，恢复转录因子NFAT启动荧光素酶报告基因的表达，加入底物
后产生化学放光，测定其化学发光值并绘制剂量‑效应曲线，以测定抗CTLA‑4单克隆抗体的
生物学活性。

[0009] 进一步，所述方法包括如下步骤：

[0010] (1)构建靶细胞和效应细胞；

[0011] (2)将靶细胞悬液和效应细胞悬液按照一定的比例进行混合得到混合液；

[0012] (3)将抗CTLA‑4单克隆抗体药物样品及参比品等比例稀释，将稀释后的抗体分别转移至步骤(2)中的混合液中，孵育培养；

[0013] (4)向步骤(3)中加入荧光素酶底物，根据信号值拟合四参数曲线确定抗体的生物学活性。

[0014] 进一步，所述构建的靶细胞为稳定表达CD3 scFv的Raji细胞。

[0015] 进一步，所述构建的效应细胞为稳定表达CTLA‑4基因和酶报告基因的Jurkat细胞。

[0016] 进一步，所述报告基因为荧光素酶报告基因。

[0017] 进一步，所述荧光素酶报告基因为由NFAT应答元件驱动表达的荧光素酶报告基因；

[0018] 进一步，制备的靶细胞悬液的细胞密度为6×105个/mL，制备的效应细胞悬液的细6
胞密度为6×10个/mL。

[0019] 进一步，抗CTLA‑4单克隆抗体等比例稀释的比例为1:3‑1:5，优选为1:4。

[0020] 进一步，孵育培养时间为4‑7h，优选为6h。

[0021] 进一步，孵育培养的条件优选为37℃、5％CO2。

[0022] 进一步，所述效应细胞和靶细胞的比例为2:1‑25:1，优选为10:1。

[0023] 在本发明的实施例中，稳定表达CD3 scFv的Raji细胞，即靶细胞Raji‑CD3scFv，其制备方法包括将含有CD3scFv序列的载体转染Raji细胞；稳定表达CTLA‑4基因和由NFAT应
答元件驱动表达的荧光素酶报告基因的Jurkat细胞，即效应细胞Jurkat‑CTLA‑4‑NFAT‑
luc，其制备方法包括将含有CTLA‑4‑NFAT序列的荧光素酶报告基因载体转染Jurkat细胞。

[0024] 在本发明的实施例中，在酶标仪上使用化学发光读取相对化学发光单位值(relative light unit,RLU)，通过数据处理拟合四参数曲线，四参数曲线，可反映出上下
渐近线、半数有效浓度值(EC50值)和斜率等指标。

[0025] 本发明的第二方面提供了一种用于抗CTLA‑4单克隆抗体药物生物学活性评价的体系。

[0026] 进一步，所述体系包括如下组分：

[0027] (1)稳定表达CD3 scFv的Raji靶细胞，稳定表达CTLA‑4基因和报告基因的Jurkat效应细胞；

[0028] (2)抗CTLA‑4单克隆抗体药物样品和参比品；

[0029] (3)荧光素酶底物。

[0030] 进一步，所述报告基因为荧光素酶报告基因。

[0031] 进一步，所述荧光素酶报告基因为由NFAT应答元件驱动表达的荧光素酶报告基因。

[0032] 进一步，所述的体系的生物学活性评价指标为相对效价。

[0033] 进一步，所述相对效价是通过比较样品与参比品四参数曲线的半数有效浓度值得到的。

[0034] 进一步，所述半数有效浓度值是通过对相对化学发光单位值进行数据处理拟合四参数曲线得到的。

[0035] 在本发明的实施例中，稳定表达CD3 scFv的Raji细胞，即靶细胞Raji‑CD3scFv，其制备方法包括将含有CD3scFv序列的载体转染Raji细胞；稳定表达CTLA‑4基因和由NFAT应
答元件驱动表达的荧光素酶报告基因的Jurkat细胞，即效应细胞Jurkat‑CTLA‑4‑NFAT‑
luc，其制备方法包括将含有CTLA‑4‑NFAT序列的荧光素酶报告基因载体转染Jurkat细胞。

[0036] 进一步，所述对CTLA‑4为CTLA‑4进行突变后得到的CTLA‑4‑Y165F。

[0037] 在本发明的实施例中，在酶标仪上使用化学发光读取相对化学发光单位值(relative light unit,RLU)，通过数据处理拟合四参数曲线，四参数曲线，可反映出上下
渐近线、半数有效浓度值(EC50值)和斜率等指标。

[0038] 本发明的第三方面提供了本发明第一方面所述的方法在制备评价抗CTLA‑4单克隆抗体药物生物学活性的工具中的应用。

[0039] 优选地，所述工具包括产品、装置、试剂盒和平台。

[0040] 本发明的第四方面提供了本发明第二方面所述的体系在制备评价抗CTLA‑4单克隆抗体药物生物学活性的工具中的应用。

[0041] 优选地，所述工具包括产品、装置、试剂盒和平台。

[0042] 本发明的优点和有益效果：

[0043] (1)本发明首次将构建的稳定表达CD3scFv的Raji细胞株用作靶细胞，和构建的稳定表达CTLA‑4基因和荧光素酶报告基因的Jurkat效应细胞同时应用于抗CTLA‑4单克隆抗
体药物生物学活性的检测中。

[0044] (2)与现有技术相比，本发明提供的用于抗CTLA‑4单克隆抗体生物学活性检测的RGA方法具有操作简单、实验周期短的优点，实验当天即可获得结果，并且避免了长时间孵
育导致细胞污染的可能性等问题。

[0045] (3)本发明提供的用于抗CTLA‑4单克隆抗体生物学活性检测的RGA方法专属性强，准确度高，精密度高，耐用性好，可用于测定抗CTLA‑4单克隆抗体的生物学活性，以及抗
CTLA‑4单克隆抗体的快速评价和筛选。

[0046] (4)本发明提供的用于抗CTLA‑4单克隆抗体生物学活性检测的RGA方法对抗CTLA‑4单抗的结构变化比较敏感，能够用于抗CTLA‑4单抗的稳定性测试，以及单抗药物活性评价
和批次质量放行。

附图说明

[0047] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

[0048] 图1是流式分析转染CD3scFv的Raji细胞Raji‑CD3scFv的结果图；

[0049] 图2是流式分析转染CTLA‑4的Jurkat细胞Jurkat‑CTLA‑4‑NFAT‑luc的结果图；

[0050] 图3是抗CTLA‑4单抗生物学活性检测的剂量‑效应曲线图；

[0051] 图4是抗CTLA‑4单抗生物学活性检测中不同的单抗稀释比例的对比结果图；

[0052] 图5是抗CTLA‑4单抗生物学活性检测中不同的效靶比和诱导时间的对比结果图，其中，A图：效靶比，B图：诱导时间；

[0053] 图6是抗CTLA‑4单抗生物学活性检测中不同的效靶比和诱导时间对应的信噪比的结果统计图；

[0054] 图7是抗CTLA‑4单抗生物学活性检测方法的专属性验证的结果图；

[0055] 图8是样品的相对效价的理论值与实测值拟合得到的回归直线结果图；

[0056] 图9是靶细胞和效应细胞代次稳定性验证的结果图，其中，A图：靶细胞，B图：效应细胞；

[0057] 图10是不同的抗CTLA‑4单抗生物学活性检测得到的剂量‑效应曲线结果图；

[0058] 图11是不同变性程度的抗CTLA‑4单抗的生物学活性检测得到的剂量‑效应曲线结果图。

具体实施方式

[0059] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下
可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物
限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的
条件实施检测。

[0060] 实施例1 Raji‑CD3scFv细胞株和Jurkat‑CTLA‑4‑NFAT‑luc细胞株的构建

[0061] 1、稳定表达CD3scFv的Raji细胞株的构建

[0062] 采用NEONTM电穿孔转染系统(Invitrogen)对Raji细胞进行CD3scFv质粒转染。转染后48h，加入Hygromycin B进行加压筛选。待细胞密度和活力恢复后，按照0.5个/孔铺5块96
孔板。当孔内细胞克隆汇合度长至30％以上时，利用流式筛选得到稳定表达CD3scFv的细胞
系，并命名为Raji‑CD3scFv细胞。

[0063] 2、稳定表达CTLA‑4基因和由NFAT应答元件驱动表达的荧光素酶报告基因的Jurkat细胞株的构建

[0064] (1)Jurkat细胞稳定转染NFAT应答元件驱动表达的荧光素酶报告基因

[0065] 采用NEONTM电穿孔转染系统(Invitrogen)对Jurkat细胞进行NFAT应答元件驱动表达的荧光素酶报告基因质粒转染。转染后48h，加入Hygromycin B进行加压筛选。待细胞密
度和活力恢复后，按照0.5个/孔铺5块96孔板。当孔内细胞克隆汇合度长至30％以上时，利
用20ng/mL PMA筛选细胞克隆，筛选得到稳定表达NFAT应答元件驱动表达的荧光素酶报告
基因的单克隆细胞系，命名为Jurkat‑NFAT‑luc细胞。

[0066] (2)Jurkat‑NFAT‑luc细胞稳定转染CTLA‑4‑Y165F基因

[0067] 由于野生型的CTLA‑4不容易停留在细胞表面，而突变后的CTLA‑4(CTLA‑4‑Y165F)可以稳定停留在细胞表面，因此，本实施例中转染的为突变型的CTLA‑4，即CTLA‑4‑Y165F，
根据文献(Leung H T,Bradshaw J,Cleaveland J S,et al.Cytotoxic T lymphocyte‑
associated molecule‑4,a high avidity receptor for CD80 and CD86,contains an 
intracellular localization motif in its cytoplasmic tail[J].Journal of 
Biological Chemistry,1995,270(42):25107‑25114.)中的方法对CTLA‑4进行突变后得到
的CTLA‑4‑Y165F。

[0068] 采用NEONTM电穿孔转染系统(Invitrogen)对Jurkat细胞进行NFAT应答元件驱动表达的荧光素酶报告基因质粒转染。转染后48h，加入G418进行加压筛选。待细胞密度和活力
恢复后，按照0.5个/孔铺5块96孔板。当孔内细胞克隆汇合度长至30％以上时，利用Raji‑
5
CD3scFv筛选细胞克隆。将Raji‑CD3scFv细胞离心用基础培养液重悬至密度为5×10个/
mL，将96孔板内细胞克隆取150μL细胞悬液，离心，用上述Raji‑CD3scFv细胞悬液重悬到40μ
L，20μL/孔加入384孔板的左右复孔中；左复孔补充20μL基础培养液，右复孔补充10μg/mL的
CTLA‑4抗体20μL(用基础培养液稀释)；37℃，5％CO2培养6‑16h。加入ONE‑Glo，40μL/孔，检
测化学发光值筛选得到稳定表达CTLA‑4基因和由NFAT应答元件驱动表达的荧光素酶报告
基因的Jurkat单克隆细胞系，命名为Jurkat‑CTLA‑4‑NFAT‑luc细胞。

[0069] 通过流式细胞仪对构建得到的稳定表达CD3scFv的Raji细胞Raji‑CD3scFv、稳定表达CTLA‑4基因和由NFAT应答元件驱动表达的荧光素酶报告基因的Jurkat细胞Jurkat‑
CTLA‑4‑NFAT‑luc的表达情况进行分析。

[0070] 3、实验结果

[0071] 流式分析的结果显示，稳定表达CD3scFv的Raji细胞、稳定表达CTLA‑4基因和由NFAT应答元件驱动表达的荧光素酶报告基因的Jurkat细胞的成功构建(见图1和图2)。

[0072] 实施例2抗CTLA‑4单抗生物学活性检测的RGA方法的建立

[0073] 1、实验方法

[0074] (1)样品制备：抗CTLA‑4单抗用稀释液稀释至200μg/mL，再按照1：4的稀释比例系列稀释，设置10个浓度梯度，每个浓度2‑3个复孔，50μL/孔加入96孔白板中。

[0075] (2)制备Jurkat‑CTLA‑4‑NFAT‑luc效应细胞悬液：收集生长状态良好的效应细胞，6
离心弃上清，用稀释液重悬细胞后计数，将细胞密度调整为6×10个/mL，备用。

[0076] (3)制备Raji‑CD3scFv靶细胞悬液：收集生长状态良好的靶细胞，离心弃上清，用5
稀释液重悬细胞后计数，将细胞密度调整为6×10个/mL，备用。

[0077] (4)细胞铺板：将稀释后的效应细胞和靶细胞按1:1混合均匀，50μL/孔加入96孔白板中。

[0078] (5)细胞孵育：37℃、5％CO2培养箱中孵育6h。

[0079] (6)读板：取出细胞板，置于室温下平衡，加入荧光底物100μL/孔，室温5min后，用多功能酶标仪测定各孔荧光强度。以抗体浓度为横坐标，以荧光信号值为纵坐标，拟合四参
数S形曲线。

[0080] 2、统计学分析

[0081] 按照下列公式计算诱导倍数(Fold of induction，FI)：FI＝RLU(反应孔均值‑背景孔均值)/RLU(阴性对照孔均值‑背景孔均值)。利用GraphPad Prism软件分析实验数据，
以抗CTLA‑4单抗浓度对数为x轴，对应的FI值为y轴，选用四参数方程回归模型，拟合抗
CTLA‑4单抗的剂量‑效应曲线。相对效价(％)表示为参比品的EC50与样品的EC50之比，其中，
EC50为半数有效浓度。以四参数曲线中D值与A值的比值(D/A)来计算信噪比(Signal noise 
ratio,S/N)。

[0082] 3、实验结果

[0083] 以抗CTLA‑4单抗浓度对数为x轴，对应的FI值为y轴，选用四参数方程回归模型，拟合抗CTLA‑4单抗的剂量‑效应曲线，所得的数据经分析后，符合四参数方程式：y＝(A－D)/
B 2
[1+(x/C) ]+D，在半对数坐标轴上呈典型的S型曲线(见图3)，R>0.99。

[0084] 实施例3RGA检测方法的优化

[0085] 1、抗体量效范围的优化

[0086] 以200μg/mL作为抗CTLA‑4单抗稀释起始点进行系列稀释，系列稀释液的稀释比例分别设置为1:3、1:4和1:5，设置10个浓度点，根据测定的化学发光值拟合的四参数曲线确
定抗CTLA‑4单抗的作用范围。

[0087] 实验方法：按照实施例2所述的方法分别进行实验，最后比较不同的稀释方案的剂量‑效应曲线，根据四参数曲线是否包含上、下平台以及分布在上、下平台和线性部分上的
点是否均匀来选取最优的稀释比例。

[0088] 实验结果：实验结果见图4，结果显示稀释比例为1:4时，分布在上下平台和线性部分上的点更加均匀，因此，确定最优的稀释比例为1:4，工作浓度范围为0.01～200μg/mL。

[0089] 2、效靶比(E:T)和诱导时间的优化

[0090] 将设定的6个效靶比组和4个诱导时间组进行6×4析因设计实验，分别进行了24组实验，对不同的效靶比和诱导时间进行了分析，以四参数曲线中的D值和A值的比值来计算
信噪比(S/N)，选择S/N最高组作为最佳的实验条件。

[0091] 实验方法：以固定Jurkat‑CTLA‑4‑NFAT‑luc效应细胞数量为15×104个/孔，设置4 4 4 4
Raji‑CD3scFv靶细胞数量分别为7.5×10个/孔，3×10 个/孔，1.5×10 个/孔，1×10个/
3 3
孔，7.5×10个/孔，6×10个/孔的方式，分别设定效靶比为2:1，5:1，10:1，15:1，20:1，25:
1，设定的诱导时间分别为4h、5h、6h和7h，即将上述所有以不同的效靶比设置的平板分别在
37℃，5％CO2培养箱中孵育4、5、6和7h，然后进行抗CTLA‑4单抗生物学活性检测，具体检测
方法按照实施例2所述的方法进行。

[0092] 实验结果：实验结果见图5A和B，信噪比的结果图见图6，结果显示，效靶比E:T为10:1，诱导时间为6h时，信噪比最高，且呈现出的剂量‑效应曲线也较好，因此，选择10:1作
为最佳的E:T，选择6h作为最佳的诱导时间。

[0093] 实施例4 RGA检测方法的验证

[0094] 1、专属性验证

[0095] 在该实施例中，分别对靶细胞的专属性、效应细胞的专属性和抗体的专属性进行了验证(见表1)。

[0096] 表1专属性验证

[0097]

[0098] 实验方法：

[0099] (1)靶细胞专属性的验证，以未转染CD3scFv的Raji细胞以及稀释液作为阴性对照组，代替Raji‑CD3scFv细胞进行抗CTLA‑4单抗生物学活性检测实验；

[0100] (2)效应细胞专属性的验证：以未转染CTLA‑4‑NFAT‑luc的Jurkat细胞以及稀释液作为阴性对照组，代替Jurkat‑CTLA‑4‑NFAT‑luc细胞进行抗CTLA‑4单抗生物学活性检测实
验；

[0101] (3)抗体专属性的验证，以无关单抗及稀释液作为阴性对照代替伊匹木单抗(Ipilimumab，靶点为CTLA‑4)进行生物学活性检测实验，其中，所述的无关单抗包括不同靶
点的单抗药物：纳武单抗(Nivolumab，靶点为PD‑1)、利妥昔单抗(Rituximab，靶点为CD20)。

[0102] 具体检测方法按照实施例2所述的方法进行。

[0103] 实验结果：结果见图7，本发明建立的RGA方法是基于特定的靶细胞和效应细胞，以及特定的抗CTLA‑4单抗，一旦将靶细胞或效应细胞替换为未经转染任何质粒的天然细胞或
稀释液，均没有任何剂量‑效应曲线，当用稀释液或针对其他靶点的单抗药物代替伊匹木单
抗时，结果也不会显示出剂量‑效应曲线，只有靶细胞Raji‑CD3scFv、效应细胞Jurkat‑
CTLA‑4‑NFAT‑luc、和靶点为CTLA‑4的伊匹木单抗同时存在时，才能获得良好的剂量‑效应
曲线，证明本发明建立的RGA方法的专属性较好。

[0104] 2、准确度验证

[0105] 回收率表示为样品相对效价的实测值和其相对效价的理论值的比值，即回收率＝相对效价的实测值/相对效价的理论值×100％，为能用于表示检测方法准确性的参数。

[0106] 实验方法：用稀释培养基将伊匹木单抗稀释至不同的初始浓度，制备5个不同效价水平的样品，分别为50％、75％、100％、125％和150％共5组回收率样品，每个样品进行3次
重复检测，检测方法如实施例2所述，以100％样品作为参比品，计算相对效价。统计各组样
品的相对效价的平均值以及相对标准偏差(RSD)，进而根据上述5组回收率样品的3次重复
检测结果按照回收率的公式计算回收率，以验证该方法的准确性。

[0107] 实验结果：统计的实验结果见表2，结果显示回收率在92.12％～103.44％之间，RSD均小于7％，表明了本发明建立的RGA方法具有较好的准确性。

[0108] 表2准确度验证

[0109]

[0110] 3、线性度验证

[0111] 实验方法：根据本实施例准确度验证中的五组样品的相对效价理论值与其实测值拟合回归直线。

[0112] 实验结果：实验结果见图8，理论值和实测值回归直线的R2＝0.9985，表明线性拟合较好，具有较好的线性关系。

[0113] 4、精密度验证

[0114] 分别对重复性和中间精密度进行了验证。

[0115] 实验方法：两名实验员在不同的3天中，分别对100％效价水平的样品进行实验，每次平行实验3块板，按照实施例2所述的方法进行实验。

[0116] 实验结果：实验结果见表3，实验结果显示18次重复实验的RSD＜10％，板间/日间/实验员间RSD＜10％，证明了本发明建立的RGA方法具有较好的精密度。

[0117] 表3精密度验证

[0118]

[0119] 5、耐用性验证

[0120] 分别采用孵育时间±1h，靶细胞数±15％，效应细胞数±15％，靶细胞和效应细胞的不同代次(靶细胞分别为12代、27代和42代，效应细胞分别为21代、33代和53代)，以评价
对本发明建立的方法稳定性的影响。每次只改变一个参数，其他实验条件均不变。

[0121] 实验方法：按照实施例2所述的方法进行检测。

[0122] 实验结果：实验结果显示孵育时间±1h时，绝对偏差＜20％，靶细胞数±15％时，绝对偏差＜10％，效应细胞数±15％时，绝对偏差＜10％(见表4)，图9A的结果显示靶细胞
Raji‑CD3scFv具有较好的代次稳定性，图9B的结果显示效应细胞Jurkat‑CTLA‑4‑NFAT‑luc
具有较好的代次稳定性，以上结果均表明了本发明建立的RGA方法具有较好的耐用性。

[0123] 表4耐用性验证

[0124]

[0125] 实施例5抗CTLA‑4单抗生物学活性检测的RGA方法的实际应用

[0126] 1、检测不同类型的抗CTLA‑4单抗的生物学活性

[0127] 以原抗CTLA‑4单抗伊匹木单抗为参比品，选取不同类型的抗CTLA‑4单抗1、单抗2，采用优化并验证后的本发明建立的RGA方法，测定不同类型的抗CTLA‑4单抗样品的生物学
活性。

[0128] 实验方法：按照实施例2所述的实验方法进行检测，每个样品进行3次重复检测。

[0129] 实验结果：实验结果见图10，结果显示不同类型的抗CTLA‑4单抗均呈现出较好的剂量‑效应曲线，表明本发明建立的RGA方法可应用于不同类型的抗CTLA‑4单抗生物学活性
的检测与比较中。

[0130] 2、检测不同变性程度的抗CTLA‑4单抗的生物学活性

[0131] 实验方法：将伊匹木单抗在70℃的水浴中分别加热1.5h和2.5h，以制备不同变性程度的伊匹木单抗样品，然后分别对变性的伊匹木单抗样品与天然的伊匹木单抗进行检
测，检测方法如实施例2所述。

[0132] 实验结果：实验结果见图11，结果显示，随着加热时间的延长，变性的伊匹木单抗的效价也相应降低，表明本发明建立的RGA方法对抗CTLA‑4单抗的结构变化比较敏感，能够
用于抗CTLA‑4单抗的稳定性测试，以及单抗药物活性评价和批次质量放行中。

[0133] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进
和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。