一种一级优质长重粒、广谱抗稻瘟病常恢兼用型水稻恢复系的分子育种方法

摘要

本发明公开了一种一级优质长重粒、广谱抗稻瘟病常恢兼用型水稻恢复系的分子育种方法，属于作物遗传育种技术领域。该方法以低直链淀粉含量、抗稻瘟病(Pi2、Pib、Pita、pi55(t))、综合农艺性状优良、不具恢复力的籼型优质常规稻粤晶丝苗2号作母本，以长重粒、低直链淀粉含量、抗稻瘟病(Pi5、Pita)、优势强、配合力好的籼稻恢复系蜀恢527作为父本，杂交，利用分子标记对遗传分离群体单株中的恢复基因Rf3、Rf4、抗稻瘟病基因Pi2、Pi5、Pita、Pib、pi55(t)进行选择，综合稻瘟病抗性鉴定结果、外观品质鉴定结果和农艺性状选择，选育出新的优质长重粒、广谱抗稻瘟病常恢兼用型水稻恢复系。

权利要求

1.一种一级优质长重粒、广谱抗稻瘟病常恢兼用型水稻恢复系的分子育种方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以籼型优质常规稻粤晶丝苗2号作母本，以籼稻恢复系蜀恢527作为父本进行杂交，获得F1代种子；种植F1代，成熟后全部单株混收获得F2代种子；

(2)种植F2代种子获得遗传分离大群体，分单株提取DNA，利用分子标记对恢复基因Rf3和Rf4进行检测，以恢复系蜀恢527为对照，筛选双基因均纯合Rf3Rf3Rf4Rf4和基因型单纯单杂Rf3rf3Rf4Rf4和Rf3Rf3Rf4rf4的单株，然后从这些单株中选择穗瘟达到抗和高抗且农艺性状优良的单株作为目标单株，分单株收获种子形成F3株系；

(3)分株系种植F3代种子，利用分子标记对广谱抗性基因Pi2和Pi5基因型进行检测，选择双基因型均纯合Pi2 Pi2 Pi5 Pi5和基因型单纯单杂Pi2pi2Pi5 Pi5、Pi2 Pi2 Pi5 pi5且农艺性状优良的单株做为备选单株，对照选育系谱，恢复基因Rf3和Rf4双基因均纯合Rf3Rf3Rf4Rf4的备选单株直接入选；基因型为单纯单杂Rf3rf3Rf4Rf4和Rf3Rf3Rf4rf4的备选单株继续进行分子标记检测，筛选出双基因均纯合Rf3Rf3Rf4Rf4的单株，以上单株均分单株收获种子，形成F4株系；

(4)分株系种植F4代种子，对照选育系谱，对广谱抗性基因Pi2和Pi5双基因型均纯合Pi2 Pi2 Pi5 Pi5的株系直接选择农艺性状优良的单株；基因型为单纯单杂Pi2pi2Pi5 Pi5和Pi2 Pi2 Pi5 pi5的株系继续进行分子标记检测，筛选双基因型均纯合Pi2 Pi2 Pi5 Pi5且农艺性状优良的单株，以上单株均分单株收获种子，形成F5株系；

(5)分株系种植F5代种子，选择农艺性状优良的单株与那丰A进行测交，收获测交种以及对应测交单株形成F6株系；

(6)种植测交种以及对应测交单株形成F6代种子，选取杂种优势强、结实率和产量高以及小区植株整齐度好的对应单株，分单株收获种子形成F7株系；

(7)利用稻瘟病菌株分别对每个F7代株系进行室内苗期抗性鉴定和田间稻瘟病穗瘟抗性鉴定，根据抗性鉴定结果，选取抗谱广且达到高抗的单株，分单株收获种子，形成F8株系；

(8)分株系种植F8代种子，按株系混合提取每个株系的DNA，利用与Pib和pi55(t)紧密连锁的分子标记进行检测，筛选出携带有Pib和pi55(t)基因型纯合的株系；

所述步骤(2)中使用的分子标记序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示；

所述步骤(3)中Pi2和Pi5基因型进行检测使用的分子标记序列如SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.8所示；

所述步骤(4)中使用的分子标记序列如SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.8所示；

所述步骤(8)中使用的分子标记序列如SEQ ID NO.9至SEQ ID NO.14所示。

2.根据权利要求1所述的分子育种方法，其特征在于，所述步骤(2)中F2代遗传分离大群体种植株数在3000株以上。

3.根据权利要求1所述的分子育种方法，其特征在于，所述步骤(2)中农艺形状优良是指千粒重≥32.0g，谷粒长≥10.5mm。

4.根据权利要求1所述的分子育种方法，其特征在于，所述步骤(7)中利用稻瘟病菌株5

进行抗性鉴定时使用的稻瘟菌孢子的浓度为2×10个/mL。

5.根据权利要求1所述的分子育种方法，其特征在于，所述步骤(7)中室内苗期抗性鉴定和田间稻瘟病穗瘟抗性鉴定是按照中国农业部行业标准《水稻品种试验稻瘟病抗性鉴定与评价技术规程》(NY/T2426‑2014)进行抗性评价。

说明书

一种一级优质长重粒、广谱抗稻瘟病常恢兼用型水稻恢复系

的分子育种方法

技术领域

[0001] 本发明属于作物遗传育种技术领域，尤其涉及一种一级优质长重粒、广谱抗稻瘟病常恢兼用型水稻恢复系的分子育种方法。

背景技术

[0002] 水稻是世界主要粮食作物之一，我国60％以上的人口以稻米为主食，水稻消费占到世界总量的30％以上。70年代末杂交水稻育种(杂种优势利用)和90年代的超级稻育种，
使水稻单产提高20％以上，目前水稻产量已基本满足人们生活的需求。但随着生活水平和
生活质量的不断提高，人们对优质米的需求日益增强；同时由于病虫害常年频繁发生，生产
上急需大量推广抗病虫水稻品种。过去杂交水稻育种追求高产，现如今杂交水稻的育种目
标是高产、优质和抗病，但如何协调发展是杂交水稻育种面临的重大挑战。

[0003] 常恢兼用型水稻恢复系指该恢复系既能做优质常规稻品种使用，又能做恢复系利用。其不仅具有对水稻光温敏型核雄性不育系和野败型胞质雄性不育系的恢复能力；同时
因为米质优，抗性好，又可以作为优质常规稻进行品种审定推广应用，大大提高了新品种的
使用效率。目前，已经有越来越多此类型的水稻品种，如粤农丝苗和粤禾丝苗等。

[0004] 稻米品质主要是由遗传特性和环境条件综合作用的结果，但杂交水稻双亲的品质特性是影响稻米品质的决定因素。因此，要培育优质杂交水稻品种，必须选用父母本双方均
优质的材料来配制组合，或至少双亲之一为优质亲本，另一亲本品质也应具备中等偏上品
质。

[0005] 稻瘟病是由病原菌Magnaporthe grisea Barr.引起的世界性水稻病害之一，严重影响水稻的产量和品质。稻瘟病危害造成全球水稻年产量损失18％左右，我国南北稻区每
年均受到不同程度的危害，在流行年份的重病地区一般减产10％～20％，严重的达40％～
50％，局部田块甚至颗粒无收。如2014年安徽曾出现杂交水稻“两优0293”因感染稻瘟病而
出现大面积减产、绝收的情况。广西是稻瘟病的重灾区，近年来稻瘟病年发生面积约53.3万
公顷，约占水稻种植面积的1/4。因此，亟需挖掘和利用稻瘟病抗性(等位)基因培育抗病品
种(组合)来提高抗性育种水平。

[0006] 相较于不育系，水稻恢复系更容易选育。因此，加强优质抗稻瘟病强优势恢复系选育，进而配制优质抗稻瘟病高产杂交稻新组合，是提高杂交水稻稻米品质和减轻稻瘟病危
害的主要途径之一。何秀英等通过对粤晶丝苗2号抗性分离分析以及BSA分析,推定粤晶丝
苗2号的广谱稻瘟病抗性是由3个与已知基因Pib,Pi2,Pita的等位显性基因和1个新的隐性
基因pi55(t)控制(参考文献：何秀英,刘新琼,王丽,王玲,林菲,程永盛,陈钊明,廖耀平,潘
庆华.稻瘟病新隐性抗病基因pi55(t)的遗传及定位.中国科学:生命科学,2012,42(2):
125‑134)。此外，其米质达国标、省标优质2级，但其并没有对野败型不育系的恢复能力(即
不携带Rf3和Rf4基因)。高利军等通过重穗长粒型恢复系蜀恢527的抗稻瘟病基因分析，发
现其有2个稻瘟病抗性基因Pi5和Pita(参考文献：高利军，高汉亮，颜群，周萌，周维永，张
晋，邓国富.4个抗稻瘟病基因分子标记的建立及在水稻亲本中的分布杂交水稻.杂交水稻，
2010，(S1)：294‑298)。本研究团队利用已定位或克隆的抗稻瘟病基因和恢复基因的分子标
记，对杂交分离群体后代单株进行稻瘟病基因Pib、Pi2、Pi5、Pita、pi55(t)以及恢复基因
Rf3和Rf4进行标记辅助选择(MAS)，将这些基因快速聚合在一起培育广谱抗稻瘟病恢复系。
标记辅助选择已广泛应用到水稻育种工作中，其能加快对目标基因的选择，减轻育种工作
量和育种成本。

发明内容

[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种一级优质长重粒、广谱抗稻瘟病常恢兼用型水稻恢复系的分子育种方法。

[0008] 该方法以低直链淀粉含量、抗稻瘟病(Pi2、Pib、Pita、pi55)、综合农艺性状优良、不具恢复力的籼型优质常规稻粤晶丝苗2号作母本，以长重粒、低直链淀粉含量、抗稻瘟病
(Pi5、Pita)、优势强、配合力好的籼稻恢复系蜀恢527作为父本，杂交，利用分子标记对遗传
分离群体单株中的恢复基因Rf3、Rf4、抗稻瘟病基因Pi2、Pi5、Pita、Pib、pi55进行选择，综
合稻瘟病抗性鉴定结果、外观品质鉴定结果和农艺性状选择，选育出新的优质抗稻瘟病强
优势恢复系。

[0009] 为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：

[0010] 一种一级优质长重粒、广谱抗稻瘟病常恢兼用型水稻恢复系的分子育种方法，其特征在于，包括以下步骤：

[0011] (1)以籼型优质常规稻粤晶丝苗2号作母本，以籼稻恢复系蜀恢527作为父本进行杂交，获得F1代种子；种植F1代，成熟后全部单株混收获得F2代种子；

[0012] (2)种植F2代种子获得遗传分离大群体，分单株提取DNA，利用分子标记分别对恢复基因Rf3和Rf4进行检测，以恢复系蜀恢527为对照，筛选双基因均纯合Rf3Rf3Rf4Rf4和基
因型单纯单杂Rf3rf3Rf4Rf4以及Rf3Rf3Rf4rf4的单株，然后从这些单株中选择穗瘟达到抗
和高抗(穗瘟分级标准按中国农业部行业标准《水稻品种试验稻瘟病抗性鉴定与评价技术
规程》(NY/T2426‑2014)进行抗性评价)且主要农艺性状优良的单株(千粒重≥32.0g，谷粒
长≥10.5mm，以及株叶形态、剑叶、株高、分蘖力、穗粒数、结实率和生育期等)作为目标单
株，分单株收获种子形成F3株系；

[0013] (3)分株系种植F3代种子，利用分子标记对广谱抗性基因Pi2和Pi5基因型进行检测，选择双基因型均纯合Pi2 Pi2 Pi5 Pi5和基因型单纯单杂Pi2pi2Pi5 Pi5、Pi2 Pi2 
Pi5pi5且主要农艺性状优良(千粒重≥32.0g，谷粒长≥10.5mm，以及株叶形态、剑叶、株高、
分蘖力、穗粒数、结实率和生育期等)的单株做为备选单株，对照选育系谱，恢复基因Rf3和
Rf4双基因均纯合Rf3Rf3Rf4Rf4的备选单株直接入选；基因型为单纯单杂Rf3rf3Rf4Rf4和
Rf3Rf3Rf4rf4的备选单株继续进行分子标记检测，筛选出双基因均纯合Rf3Rf3Rf4Rf4的单
株，以上单株均分单株收获种子，形成F4株系；

[0014] (4)分株系种植F4代种子，对照选育系谱，对广谱抗性基因Pi2和Pi5双基因型均纯合Pi2 Pi2 Pi5 Pi5的株系直接选择主要农艺性状优良(千粒重≥32.0g，谷粒长≥10.5mm，
以及株叶形态、剑叶、株高、分蘖力、穗粒数、结实率和生育期等)的单株；基因型为单纯单杂
Pi2pi2Pi5 Pi5和Pi2 Pi2 Pi5 pi5的株系继续进行分子标记检测，筛选双基因型均纯合
Pi2 Pi2 Pi5 Pi5且主要农艺性状优良(千粒重≥32.0g，谷粒长≥10.5mm，以及株叶形态、
剑叶、株高、分蘖力、穗粒数、结实率和生育期等)的单株，以上单株均分单株收获种子，形成
F5株系；

[0015] (5)分株系种植F5代种子，选择农艺性状优良(千粒重≥32.0g，谷粒长≥10.5mm，以及株叶形态、剑叶、株高、分蘖力、穗粒数、结实率和生育期等)的单株与三系不育系那丰A
进行测交，收获测交种以及对应测交单株形成F6株系；

[0016] (6)种植测交种以及对应测交单株形成F6代种子，选取杂种优势强、结实率和产量高以及小区植株株叶型整齐一致的对应单株，分单株收获种子形成F7株系；

[0017] (7)利用稻瘟病菌株分别对每个F7代株系进行室内苗期抗性鉴定和田间稻瘟病穗瘟抗性鉴定，根据抗性鉴定结果，选取抗谱广且达到高抗的单株，分单株收获种子，形成F8
株系；

[0018] (8)分株系种植F8代种子，提取每个株系单株的DNA，利用与Pib和pi55(t)紧密连锁的分子标记进行检测，筛选出携带有Pib和pi55(t)基因型均分布纯合的植株。

[0019] 进一步的，所述步骤(2)中F2代遗传分离大群体种植株数在3000株以上。

[0020] 进一步的，所述步骤(2)中使用的分子标记序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示。

[0021] 进一步的，所述步骤(3)中Pi2和Pi5基因型进行检测使用的分子标记序列如SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.8所示。

[0022] 进一步的，所述步骤(4)中使用的分子标记序列如SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.8所示。

[0023] 进一步的，所述步骤(7)中利用稻瘟病菌株进行抗性鉴定时使用的稻瘟菌孢子的5
浓度为2×10个/mL。

[0024] 进一步的，所述步骤(8)中使用的分子标记序列如SEQ ID NO.9至SEQ ID NO.14所示。

[0025] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0026] 通过本发明的分子育种方法选育出一级优质长重粒、广谱抗稻瘟病常恢兼用型水稻恢复系，既可作优质广谱抗稻瘟病的常规稻审定推广，又可与不同不育系配组，选育出优
质抗稻瘟病高产杂交籼稻新组合，提高杂种一代的稻米品质、稻瘟病抗性，使其满足当前水
稻生产的需求。

附图说明

[0027] 图1为实施例1中分子育种流程图。

[0028] 图2为实施例1中23个菌株对13个F7株系苗期稻瘟病抗性鉴定结果图。

[0029] 图3为实施例1中米质检测结果图。

具体实施方式

[0030] 本发明中所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。

[0031] 以下实施例中所使用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购得，所使用的各作物品种(品系)均为育种领域中常规使用的品种(品系)，通过国家审定认定或
者技术鉴定，可在品种资源库获得或者市场采购得到。以下实施例中所述的主要农艺形状
包括千粒重≥32.0g，谷粒长≥10.5mm，以及株叶形态、剑叶、株高、分蘖力、穗粒数、结实率
和生育期等。

[0032] 实施例1

[0033] 本实施例提供一种一级优质长重粒、广谱抗稻瘟病常恢兼用型水稻恢复系的分子育种方法，步骤如下：

[0034] (1)以低直链淀粉含量、抗稻瘟病(Pi2、Pib、Pita、pi55)、综合农艺性状优良、不具恢复力的籼型优质常规稻粤晶丝苗2号作母本，以长重粒、低直链淀粉含量、抗稻瘟病(Pi5、
Pita)、优势强、配合力好的籼稻恢复系蜀恢527作为父本进行杂交，获得F1代种子；种植F1
代，成熟后全部单株混收获得F2种子；

[0035] (2)在岑溪梨木镇稻瘟病自然诱发抗性鉴定圃种植3000株以上F2代遗传分离大群体，分单株提取DNA，利用分子标记SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID 
NO.4对恢复基因Rf3和Rf4进行检测(以恢复系蜀恢527为对照)，筛选双基因均纯合
(Rf3Rf3Rf4Rf4)和基因型单纯单杂(Rf3rf3Rf4Rf4和Rf3Rf3Rf4rf4)的单株，然后从这些单
株中选择穗瘟达到抗和高抗(穗瘟分级标准按中国农业部行业标准《水稻品种试验稻瘟病
抗性鉴定与评价技术规程》(NY/T2426‑2014)进行抗性评价)且主要农艺性状优良的单株
(千粒重≥32.0g，谷粒长≥10.5mm)作为目标单株(共分离出47个单株)，分单株收获种子形
成F3株系；

[0036] (3)分株系种植F3代种子，每个株系种植50个单株。因为父母本均携带有抗稻瘟病基因Pita，同时由于Pib和pi55(t)的抗性效应比较小，所以不对这三个基因进行标记检测，
待获得主要农艺性状稳定的品系后才对Pib和pi55(t)基因进行标记分析。因此，只需利用
分子标记SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8对广谱抗性基因Pi2和
Pi5基因型进行检测，选择双基因型均纯合(Pi2  Pi2 Pi5 Pi5)和基因型单纯单杂
(Pi2pi2Pi5 Pi5、Pi2 Pi2 Pi5 pi5)且主要农艺性状优良的单株做为备选单株。对照选育
系谱，恢复基因Rf3和Rf4双基因均纯合(Rf3Rf3Rf4Rf4)的备选单株直接入选；基因型为单
纯单杂(Rf3rf3Rf4Rf4和Rf3Rf3Rf4rf4)的备选单株继续进行分子标记SEQ ID NO.1和SEQ 
ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4检测，筛选出双基因均纯合(Rf3Rf3Rf4Rf4)的单株，
以上单株(共32个单株)均分单株收获种子，形成F4株系；

[0037] (4)分株系种植F4代种子，每个株系种植50个单株。对照选育系谱，对广谱抗性基因Pi2和Pi5双基因型均纯合(Pi2 Pi2 Pi5 Pi5)的株系直接选择主要农艺性状优良的单
株；基因型为单纯单杂(Pi2pi2Pi5 Pi5、Pi2 Pi2 Pi5 pi5)的株系继续进行分子标记SEQ 
ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8检测，筛选双基因型均纯合(Pi2 Pi2 
Pi5 Pi5)且农艺性状优良的单株，以上单株(共个26单株)均分单株收获种子，形成F5株系。
至此世代，所有入选的株系单株均携带有恢复基因Rf3和Rf4、广谱抗性基因Pi2和Pi5；

[0038] (5)分株系种植F5代种子，每个株系种植50个单株。选择农艺性状优良的单株与三系不育系那丰A进行测交，收获测交种以及对应测交单株(26个单株)形成F6株系；

[0039] (6)小区种植测交种以及对应测交单株形成F6代种子，每个小区种植50个单株。综合考察测交种小区农艺性状、结实率、产量等杂种优势，选取杂种优势强、结实率和产量高
以及小区植株整齐度好的对应单株，分单株(15个单株)收获种子形成F7株系；

[0040] (7)利用从广西不同生态区稻瘟病田间重发病区采集分离的23个毒性强的单孢菌5
株，扩大培养后洗脱稻瘟菌孢子，调节浓度至2×10个/mL，分别对F7代株系进行室内苗期
抗性鉴定和田间稻瘟病穗瘟抗性鉴定(按中国农业部行业标准《水稻品种试验稻瘟病抗性
鉴定与评价技术规程》(NY/T2426‑2014)的方法进行苗期和田间穗瘟抗性鉴定)。根据抗性
鉴定结果，选取抗谱广且达到高抗的单株(13个单株)，分单株收获种子，形成F8株系；

[0041] 其中，室内苗期抗性鉴定步骤为：试验品种子浸种、催芽后,按顺序分别播种在带孔、装有细土、穴间隔3cm的塑料盘中,每个品种10粒—15粒，浇水盖土，保证正常出苗生长，
接种前3d—5d酌施氮肥，保持稻苗嫩绿，秧苗3叶—4叶期时，选择当地致病性较强和致病频
率较高的23个菌株(广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所提供)分单菌株喷雾接种
5
每个株系，孢子浓度约为2×10 个孢子/mL，接种量以所有叶片上布满孢子液为限，接种后
置于25℃‑28℃的恒温室内，遮光保湿24h，然后去除遮光条件，并定时喷雾保湿，试验设2次
重复。苗叶瘟在感病对照品种发病达7级或以上时调查，每个品种以发病最重的10株为调查
对象，每株调查发病最重的叶片，取发病最重的3株作为品种评价的依据(室内苗期抗性鉴
定及调查方法、分级标准参照中国农业部行业标准《水稻品种试验稻瘟病抗性鉴定与评价
技术规程》(NY/T2426‑2014)的方法并稍作调整)；

[0042] 其中，田间穗瘟抗性鉴定步骤为：田间穗瘟病鉴定圃设置在广西岑溪梨木镇(广西水稻品种区域试验稻瘟病抗性鉴定点)雾多、结露时间长的常发病稻区，选择土地平整、土
质肥沃、排灌方便的重病田块。采用育苗移栽、自然诱发，育秧方式参照NY/T1300‑2007。本
田每个品种栽5行，每行6穴，每穴2棵‑4棵基本苗，株行距为13.3cm×20cm，品种按顺序排
列，每幅试验品种四周种植2行诱发品种，每个熟组栽插1个感病对照品种。施肥量高于当地
生产水平，并在水稻抽穗前5d增施一次氮肥，鉴定圃治虫不治病(纹枯病严重田块需用井岗
霉素进行防治)，试验设2次重复。穗瘟在水稻黄熟初期(80％稻穗尖端谷粒成熟时)每个品
种调查发病最重的稻穗，不少于100穗(穗瘟抗性鉴定及调查方法、分级标准参照中国农业
部行业标准《水稻品种试验稻瘟病抗性鉴定与评价技术规程》(NY/T2426‑2014))。

[0043] (8)分株系种植F8代种子，每个株系种植50个单株，分别提取每个株系单株的DNA，利用与Pib和pi55(t)紧密连锁的分子标记SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和
SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14进行检测，筛选其基因型均分别纯合的单株，
综合步骤(4)，检测到的广谱抗性基因Pi2和Pi5，本发明共选育到聚合了4个稻瘟病抗性基
因(Pib、Pi2、Pi5、Pita)和(Pi2、Pi5、Pita、pi55(t))的株系分别共有4和2个单株，没有聚合
到5个抗性基因(Pib、Pi2、Pi5、Pita、pi55(t))的单株，分单株收获种子形成F9株系。

[0044] (9)分株系种植F9代种子，每个株系种植50个单株，按株系混合收获种子，送农业农村部稻米及制品质量监督检验测试中心进行米质分析，其中有5个株系的米质达到部标2
级，1个株系米质达到部标1级。

[0045] 上述分子标记的具体序列如表1所示。

[0046] 表1

[0047]

[0048]

[0049] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出
的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。