一种基于趋磁细菌的高效肿瘤靶向性T1-T2双模成像造影剂的制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种基于趋磁细菌的高效肿瘤靶向性T1‑T2双模成像造影剂的制备方法，该方法包括如下步骤：将趋磁细菌离心水洗后重悬浮于PBS缓冲溶液中，加入多巴胺盐酸盐，恒温振荡条件下，多巴胺在趋磁细菌表面发生缓慢聚合，之后将反应中间产物离心收集后重悬浮于金属离子盐溶液中，金属离子与细菌表面聚合的多巴胺鳌合后，离心水洗去除未鳌合的金属离子，重悬浮于PBS中，即得。此造影剂不仅具备了趋磁细菌特有的趋磁性和趋氧性等趋性运动行为，也具备了金属离子显著的T1驰豫效果，最终得到的产物具备磁靶向性的T1‑T2双模成像，并在体外和体内得到了验证。为开发新的MRI多模态成像造影剂提供了新的研究方向和可能性。

权利要求

1.一种T1‑T2双模成像造影剂的制备方法，包括如下步骤：

1）将趋磁细菌离心水洗后重悬浮于PBS缓冲溶液中，加入多巴胺盐酸盐，使多巴胺在所述趋磁细菌表面发生缓慢聚合反应；

2）将步骤1）反应结束后的反应液离心，收集固体产物后重悬浮于金属离子盐溶液中，使所述金属离子与趋磁细菌表面聚合的多巴胺发生鳌合反应；反应结束后，离心水洗去除未鳌合的金属离子，产物重悬浮于PBS缓冲溶液中，即得到所述T1‑T2双模成像的造影剂；

所述趋磁细菌为AMB‑1；

所述PBS缓冲溶液的pH值为6.0 10.0；

~

所述步骤1）中，所述聚合反应在恒温振荡的条件下进行；所述恒温振荡条件为20 37~

℃，10 500rpm/min，反应0.5 4小时；

~ ~

3+

所述步骤2）中，所述的金属离子选自Fe ；

所述步骤2）中，所述螯合反应在恒温振荡的条件下进行；所述恒温振荡的条件为：20~

37℃，10 500rpm/min，反应0.5 6小时。

~ ~

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述离心水洗的条件为：转速3000~

8000r/min；离心时间5 20min；离心水洗1 5次。

~ ~

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中，将趋磁细菌离心水洗

4 10

后重悬浮于PBS缓冲溶液中得到的重悬浮液中趋磁细菌的密度为10 10  CFU/mL；

~

所述多巴胺盐酸盐的反应浓度为0.1 100mg/mL。

~

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中，所述金属离子的反应浓度为1mmol 200mmol/mL；

~

所述金属离子盐溶液的溶剂为0.05 0.1M、pH4.0 8.0的Tris缓冲溶液。

~ ~

5.权利要求1‑4中任一项所述方法制备得到的T1‑T2双模成像造影剂。

6.权利要求5所述的T1‑T2双模成像造影剂在下述至少一方面中的应用：

1）制备临床诊断的产品；

2）制备可视化追踪的产品；

3）制备靶向治疗的产品。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述产品为药物或药物制剂或试剂。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述靶向治疗是指肿瘤的靶向治疗。

说明书

一种基于趋磁细菌的高效肿瘤靶向性T1‑T2双模成像造影剂

的制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于医学影像学领域，具体涉及一种以趋磁细菌为基础的高效肿瘤靶向性T1‑T2双模成像造影剂的制备方法和应用。

背景技术

[0002] 磁共振成像是用于解剖学和生理学成像的常规诊断工具。与其他成像技术相比，磁共振成像的优势包括优越的(亚毫米级)空间分辨率，无辐射负担和无限的组织穿透力。
然而，常规磁共振成像难以灵敏的区分病变组织(如肿瘤部位)和正常组织间的差异。为了
提高MRI组织分辨率，MRI造影剂被开发出来，并广泛应用于临床疾病诊断。这些化合物通过
局部改变磁场来影响磁共振成像信号强度。效果是缩短了周围水质子的纵向(T1)和横向
(T2)弛豫行为，这分别改变了正(亮)和负(暗)对比度。具备靶向病变部位能力的造影剂可
以提高磁共振成像在诊断和治疗评估中的实用性。当前使用的造影剂，例如顺磁性离子造
影剂，超顺磁性氧化铁纳米颗粒等通常无法有效的到达病变组织，它们主要的靶向限制是
对全身循环的依赖以及缺乏超越其扩散极限的推进力和对病变组织的感知。由于许多细菌
在全身递送后能够主动在特定组织(如肿瘤)中富集，因此，可以考虑使用细菌作为具有适
当特性和靶向功能的生物造影剂。

[0003] 一个例子是趋磁细菌。趋磁细菌体内生物矿化形成的磁小体(主要成分为Fe3O4或FeS)排列在细胞内链中，使细胞能够排列并沿着外部磁场游动，这种行为称为“磁趋向性”。
磁趋向性可以促进细菌在化学物质底部有利于其生长的微氧化区内滞留。例如趋磁细菌可
以利用趋磁性在有氧‑缺氧过渡区(OATZ)处以优选的低氧浓度有效迁移并保持其位置。利
用这一特性，趋磁细菌被用作药物载体，增强药物靶向肿瘤乏氧区域的能力，并用作T2造影
剂实现细菌载体的可视化。

[0004] 对于体内成像，明亮信号的增强可以很容易的使感兴趣区域与其他组织区分，然而临床使用的T1造影剂(例如Gd‑DTPA，Magnevist)由于分子量低而遭受体内循环周期短的
困扰；而T2造影剂造成的磁化伪影和负面的造影效果(即深色MR图像)限制了T2造影剂的临
床应用。多种成像模式的组合可以产生互补的诊断信息，并提供优于单一模式的协同优势。
因此引入T1‑T2双模成像策略可以最大程度地减少不利影响，但保持每种模式造影剂的互
补优势。

[0005] 综上分析，结合多模态成像策略和细菌天然靶向行为的优势，以趋磁细菌为基础，开发出一种具备T1‑T2双模成像的高效肿瘤靶向性造影剂，有望为临床前和转化研究中的
磁共振成像可视化提供积极的意义。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种基于趋磁细菌的高效肿瘤靶向性T1‑T2双模成像造影剂的制备方法及其应用。所述造影剂能够在梯度磁场中沿着磁场梯度在肿瘤组织中定值，并
提供积极的T1‑T2对比度。简便且可重现的合成方法，高度潜在的生物相容性以及在体外和
体内显示增强的T1和T 2MR信号的能力，使此造影剂在MRI中展示出巨大的生物医学和临床
应用潜力。

[0007] 本发明所提供的造影剂的制备方法，包括如下步骤：

[0008] 1)将趋磁细菌离心水洗后重悬浮于PBS缓冲溶液中，加入多巴胺盐酸盐，使多巴胺在所述趋磁细菌表面发生缓慢聚合反应；

[0009] 2)将步骤1)反应结束后的反应液离心，收集固体产物后重悬浮于一定浓度的金属离子盐溶液中，使所述金属离子与趋磁细菌表面聚合的多巴胺发生鳌合反应；反应结束后，
离心水洗去除未鳌合的金属离子，产物重悬浮于PBS缓冲溶液中，即可得到具备T1‑T2双模
成像的造影剂。

[0010] 上述的制备方法中，所述趋磁细菌为实验室常用菌种MSR‑1、MC‑1、MO‑1或AMB‑1。

[0011] 上述的制备方法中，所述离心水洗的条件为：转速3000～8000r/min，具体可为5000r/min或8000r/min；离心时间5～20min；离心水洗1～5次。

[0012] 上述的制备方法中，将趋磁细菌离心水洗后重悬浮于PBS缓冲溶液中得到的重悬4 10 5 7
浮液中趋磁细菌的密度为10 ～10 CFU/mL，具体可为2×10 CFU/mL、2×10 CFU/mL、2×
9
10CFU/mL。

[0013] 上述的制备方法中，所述PBS缓冲溶液的pH值可为6.0～10.0。

[0014] 上述的制备方法中，所述多巴胺盐酸盐的反应浓度可为0.1～100mg/mL，具体可为0.3mg/mL、3mg/mL、10mg/mL、30mg/mL或50mg/mL。

[0015] 上述的制备方法中，所述聚合反应在恒温振荡的条件下进行；所述恒温振荡条件为20～37℃(具体如28℃)，10～500rpm/min，反应0.5～4小时(具体如1小时、2小时或3小
时)。

[0016] 上述的制备方法中，所述的金属离子选自Fe3+、Mn2+、Cu2+、Gd3+中的任意一种；所述金属离子的反应浓度可为1mmol～200mmol/mL，具体可为50mmol/mL；

[0017] 所述金属离子盐溶液的溶剂(或用于重悬固体产物的分散相)为0.05M～0.5M、pH4.0～8.0的Tris缓冲溶液。

[0018] 上述的制备方法中，所述螯合反应在恒温振荡的条件下进行；所述恒温振荡的条件为：20～37℃(具体如28℃)，10～500rpm/min，反应0.5～6小时(具体如0.5小时、1小时或
6小时)。

[0019] 上述方法制备得到的T1‑T2双模成像造影剂也属于本发明的保护范围。

[0020] 本发明还提供了上述T1‑T2双模成像造影剂的应用。

[0021] 本发明所得的T1‑T2双模成像造影剂可用于临床诊断，可视化追踪，靶向治疗等领域。

[0022] 现有技术中还没有报道过在趋磁细菌表面自聚合多巴胺的技术，更没有对表面聚合过程的调控，同时也没有文献研究趋磁细菌在T1‑T2双模成像中的应用。本发明提供的
T1‑T2造影剂为基于趋磁细菌的生物制剂，采用具有靶向肿瘤乏氧区域能力的趋磁细菌用
作T2造影剂，细菌表面自聚合形成一层聚多巴胺，并实现了对表面多巴胺聚合结果的调控，
然后络合了具有T1成像效果的金属离子，可以作为T1‑T2双模成像造影剂用于靶向治疗，可
视化追踪等领域。

附图说明

[0023] 图1为实施例中的趋磁细菌AMB‑1的TEM表征。

[0024] 图2为实施例1基于AMB‑1制备的T1‑T2双模成像造影剂TEM表征。

[0025] 图3为实施例2基于AMB‑1制备的T1‑T2双模成像造影剂TEM表征。

[0026] 图4为实施例3基于AMB‑1制备的T1‑T2双模成像造影剂TEM表征。

[0027] 图5为对比例1基于AMB‑1制备的T1‑T2双模成像造影剂TEM表征。

[0028] 图6为实施例2基于AMB‑1制备的T1‑T2双模成像造影剂元素扫描图。

[0029] 图7为实施例2基于AMB‑1制备的T1‑T2双模成像造影剂的体外成像图弛豫速率。

[0030] 图8为实施例2基于AMB‑1制备的T1‑T2双模成像造影剂在小鼠体内的成像效果。

具体实施方式

[0031] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

[0032] 下述实施例中使用的趋磁细菌AMB‑1购自ATCC，菌种编号为700264。

[0033] 实施例1：

[0034] 1)使用ATCC提供的标准培养基，28℃恒温培养箱培养72h，将100mL的趋磁细菌6
AMB‑1(其中，趋磁细菌AMB‑1的密度为2×10CFU/mL)分装于50mL离心管，5000r/min，离心
10min，去除上清液，得到富集后的细菌；

[0035] 2)将富集的趋磁细菌AMB‑1重悬浮于10mL去离子水中，8000r/min，离心10min，去除上清液，重新悬浮于10mL去离子水中，重复操作三遍；

[0036] 3)称取300mg的多巴胺盐酸盐，溶解于1mL PH为6.0的PBS缓冲液中，充分溶解；

[0037] 4)将最后一次离心富集的趋磁细菌AMB‑1悬浮于9mL pH值为6.0的PBS缓冲液中，用移液枪轻轻吹匀，然后加入3)配制的多巴胺盐酸盐溶液，混合均匀后，将反应液置于28
℃，100rpm的恒温震荡箱中震荡反应2h；

[0038] 5)称取5.406g的FeCl3·6H2O，溶解于100mL 0.1M PH为8.0的Tris缓冲溶液中，得到浓度为200mmol/L的原液；

[0039] 6)将4)中反应结束的反应液5000r/min，离心10min，去除上清液，重复步骤2)，去除未反应完全的多巴胺盐酸盐；

[0040] 7)将产物分散于7.5mL 0.1M PH为8.0的Tris缓冲溶液，吹匀，加入2.5mL步骤5)配制的FeCl3溶液，混合均匀后，将反应液置于28℃，100rpm的恒温震荡箱中震荡反应1h；

[0041] 8)反应结束后，5000r/min，离心10min，去除上清液，重复步骤2)，去除未反应的3+
Fe ，然后重悬浮于10mL pH值为7.2的PBS中，保存于4℃。所得造影剂TEM图如图2所示。

[0042] 实施例2：

[0043] 1)使用ATCC提供的标准培养基，28℃恒温培养箱培养72h，将100mL的趋磁细菌6
AMB‑1(其中，趋磁细菌AMB‑1的密度为2×10CFU/mL)分装于50mL离心管，5000r/min，离心
10min，去除上清液，得到富集后的细菌；

[0044] 2)将富集的细菌重悬浮于10mL去离子水中，5000r/min，离心10min，去除上清液，重新悬浮于10mL去离子水中，重复操作三遍；

[0045] 3)称取100mg的多巴胺盐酸盐，溶解于1mL PH为8.0的PBS缓冲液中，充分溶解；

[0046] 4)将最后一次离心富集的趋磁细菌AMB‑1悬浮于9mL PH为8.0的PBS缓冲液中，用移液枪轻轻吹匀，然后加入3)配置的多巴胺盐酸盐溶液，混合均匀后，将反应液置于28℃，
100rpm的恒温震荡箱中震荡反应3h；

[0047] 5)称取5.406g的FeCl3·6H2O，溶解于100mL 0.1M PH为8.0的Tris缓冲溶液中，得到浓度为200mmol/L的原液；

[0048] 6)将4)中反应结束的反应液5000r/min，离心10min，去除上清液，重复步骤2)，去除未反应完全的多巴胺盐酸盐；

[0049] 7)将产物分散于7.5mL 0.1M PH为8.0的Tris缓冲溶液，吹匀，加入2.5mL步骤5)配置的FeCl3溶液，混合均匀后，将反应液置于28℃，100rpm的恒温震荡箱中震荡反应6h；

[0050] 8)反应结束后，5000r/min，离心10min，去除上清液，重复步骤2)，去除未反应的3+
Fe ，然后重悬浮于10mL pH值为7.2的PBS中，保存于4℃；所得造影剂TEM图如图3。

[0051] 实施例3：

[0052] 1)使用ATCC提供的标准培养基，28℃恒温培养箱培养72h，将100mL的趋磁细菌6
AMB‑1(其中，趋磁细菌AMB‑1的密度为2×10CFU/mL)分装于50mL离心管，5000r/min，离心
10min，去除上清液，得到富集后的细菌；

[0053] 2)将富集的趋磁细菌AMB‑1重悬浮于10mL去离子水中，5000r/min，离心10min，去除上清液，重新悬浮于10mL去离子水中，重复操作三遍；

[0054] 3)称取30mg的多巴胺盐酸盐，溶解于1mL PH为9.0的PBS缓冲液中，充分溶解；

[0055] 4)将最后一次离心富集的细菌悬浮于9mL PH为9.0的PBS缓冲液中，用移液枪轻轻吹匀，然后加入3)配置的多巴胺盐酸盐溶液，混合均匀后，将反应液置于28℃，100rpm的恒
温震荡箱中震荡反应1h；

[0056] 5)称取5.406g的FeCl3·6H2O，溶解于100mL 0.1M PH为6.0的Tris缓冲溶液中，得到浓度为200mmol/L的原液；

[0057] 6)将4)中反应结束的反应液5000r/min，离心10min，去除上清液，重复步骤2)，去除未反应完全的多巴胺盐酸盐；

[0058] 7)将产物分散于7.5mL 0.1M PH为6.0的Tris缓冲溶液，吹匀，加入2.5mL步骤5)配置的FeCl3溶液，混合均匀后，将反应液置于28℃，100rpm的恒温震荡箱中震荡反应0.5h；

[0059] 8)反应结束后，5000r/min，离心10min，去除上清液，重复步骤2)，去除未反应的3+
Fe ，然后重悬浮于10mL pH值为7.2的PBS中，保存于4℃；所得造影剂TEM图如图4。

[0060] 对比例1：

[0061] 1)使用ATCC提供的标准培养基，28℃恒温培养箱培养72h，将100mL的趋磁细菌6
AMB‑1(其中，趋磁细菌AMB‑1的密度为2×10CFU/mL)分装于50mL离心管，5000r/min，离心
10min，去除上清液，得到富集后的细菌；

[0062] 2)将富集的趋磁细菌AMB‑1重悬浮于10mL去离子水中，5000r/min，离心10min，去除上清液，重新悬浮于10mL去离子水中，重复操作三遍；

[0063] 3)称取60mg的多巴胺盐酸盐，溶解于1mL PH为9.0的PBS缓冲液中，充分溶解；

[0064] 4)将最后一次离心富集的细菌悬浮于9mL PH为9.0的PBS缓冲液中，用移液枪轻轻吹匀，然后加入3)配置的多巴胺盐酸盐溶液，混合均匀后，将反应液置于28℃，静置反应1h；

[0065] 5)称取5.406g的FeCl3·6H2O，溶解于100mL 0.1M PH为6.0的Tris缓冲溶液中，得到浓度为200mmol/L的原液；

[0066] 6)将4)中反应结束的反应液5000r/min，离心10min，去除上清液，重复步骤2)，去除未反应完全的多巴胺盐酸盐；

[0067] 7)将产物分散于7.5mL 0.1M PH为6.0的Tris缓冲溶液，吹匀，加入2.5mL步骤5)配置的FeCl3溶液，混合均匀后，将反应液置于28℃，静置反应0.5h；

[0068] 8)反应结束后，5000r/min，离心10min，去除上清液，重复步骤2)，去除未反应的3+
Fe ，然后重悬浮于10mL pH值为7.2的PBS中，保存于4℃；所得造影剂TEM图如图5。

[0069] 用50μL的移液枪分别取50μL培养好的AMB‑1(密度为2×106CFU/mL)与实施例2最终制备的T1‑T2造影剂滴在碳支持膜上，常温干燥后使用HT7700表征形貌，如图1和图3所
示；并用JE2100f表征元素实例中得到的造影剂的元素分布，如图6所示；由图5可知表面聚
3+
合一层聚多巴胺后，可以很好地吸附鳌合Fe ，用于MRI成像。

[0070] 将实施例2所得造影剂稀释不同倍数后得到一系列浓度的溶液，在2.0mL的Eppendorf管中，使用3T临床磁共振仪(Philips Achieva 3.0T TX)测定横向和纵向弛豫速
率，成像参数设置如下：T1加权像：matrix size＝256×256；slice thickness＝1mm；echo 
time(TE)＝5.13ms；repetition time(TR)＝300ms；number of excitations(NEX)＝4。T2
加权像：matrix size＝256×256；slice thickness＝1mm；echo time(TE)＝40ms；
repetition time(TR)＝2000ms；number of excitations(NEX)＝4。结果如图7。由图7可
知，所得造影剂具备明显的T1和T2成像效果，可以显著提高MR成像中的对比度。

[0071] 将生长中的细胞用胰酶消化，加入5mL培养基终止消化，将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心5min，去上清，加入1×PBS溶液洗一次，最后加入适量PBS溶液将细胞吹匀。
在体重约为16‑20g的4周龄BALB/c白鼠(购自北京大学医学院实验动物部)右后肢皮下注射
5
100μL细胞悬液(约10个细胞)，构建皮下肿瘤模型。在细胞液注射5～7天后，小鼠右腿上可
观察到～5mm的肿瘤凸起时，可进行成像实验。

[0072] 取100μL实施例2所得造影剂(浓度2×107CFU/mL)瘤周注射到小鼠体内，后加磁场靶向，并在固定时间成像。用1％异氟烷采用气体麻醉系统对小鼠进行全程麻醉，然后将其
放入环形线圈内，置于磁场强度为1.0T(ASPECT)的核磁共振成像仪中，对白鼠肝肾截面进
行扫描。扫描参数如下：T1加权像：matrix size＝256×256；slice thickness＝1mm；echo 
time(TE)＝10.00ms；repetition time(TR)＝300ms。T2加权像：matrix size＝256×256；
slice thickness＝1mm；echo time(TE)＝75.868ms；repetition time(TR)＝4000ms。结果
如图8，给药后可以看到肿瘤区域分别产生明显的T1明信号和T2暗信号的增强。