核酸抗体联合检测致病菌的试剂盒

摘要

本发明公开了核酸抗体联合检测致病菌的试剂盒。本发明筛选获得特异性识别幽门螺旋杆菌单克隆抗体，将所述单克隆抗体标记量子点和其他抗体标记的硝酸纤维素膜制备获得抗体荧光量子点快速检测试纸，同时针对幽门螺旋杆菌DNA序列进行分析，选取保守区设计RPA引物和探针，并制备成为相应的检测试纸条；将两个检测方法进行组合使用，能够进一步提高检测的准确性，从而及早诊断，利于患者尽快治疗，适于大规模推广使用。

权利要求

1.一种核酸‑抗体双重检测幽门螺旋杆菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有抗体标记量子点制备而成的荧光量子点快速检测试纸条和试纸条RPA检测试剂盒，所述试纸条RPA检测试剂盒包括一对引物和一条探针，所述的一对引物的序列如SEQ ID NO:9和10所示，所述探针的序列如SEQ ID NO:11所示；所述荧光量子点快速检测试纸条中的抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:7所示,轻链可变区序列如SEQ ID NO:8所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的探针标记有荧光基团、荧光淬灭基团、脱碱基位点及阻塞基团。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述荧光基团为FAM、荧光淬灭基团为BHQ1、脱碱基位点为dSpacer修饰及阻塞基团为C3Spacer修饰。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述荧光基团为TAMARA、荧光淬灭基团为BHQ2、脱碱基位点为四氢呋喃修饰及阻塞基团为C3Spacer修饰。

5.如权利要求1‑4任一项所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括水解缓冲液，醋酸镁以及ddH2O。

6.如权利要求1‑4任一项所述的试剂盒，其特征在于RPA扩增反应在温度设定为36℃的水浴锅中进行，反应时间为20min。

7.权利要求1‑4任一项所述的试剂盒在制备检测幽门螺旋杆菌试剂中的用途。

说明书

核酸抗体联合检测致病菌的试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及生物检测领域,并且更具体地涉及核酸抗体联合检测致病菌的试剂盒。

背景技术

[0002] 幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）于1983年由澳大利亚学者Warren 和Marshall从慢性胃炎患者胃粘膜中成功分离出。H. pylori是一种革兰氏阴性螺
旋状杆菌，在胃上皮细胞定居繁殖。大量研究证实，H. pylori是慢性胃炎、消化性溃疡及胃
肠道淋巴瘤的主要致病因素，并与胃癌发生密切相关。1994年国际癌症研究中心（IARC）将
H.pylori列为I 类致癌因子。目前，H. pylori的感染率在发达国达到30%～50%，在发展中
国家则高达80%，而我国20岁以上的成年人感染率也达到32%～75%。

[0003] 幽门螺旋杆菌的诊断方法可划分为侵入性方法和非侵入性方法，其中侵入性方法包括细菌培养、快速脲酶试验和组织学检测等；这些方法具有足够的敏感性和特异性，但成
本高，需要专业人员操作，还可能引起患者不适，不利于临床应用，更不适用于大批量检测。
非侵入方法包括呼吸实验（UBT）、粪便抗原检测和血清学试验等；非侵入性方法不需借助胃
镜检查、患者依从性较好，因而具有临床实际意义，但易受感染，出现假阳性。此外，基因检
测技术即不受临床治疗用药的干扰，又可检测有无H. pylori的感染，同时也能检测细菌的
基因型；基因诊断技术同样可以直接用于胃液、唾液、粪便等标本的检测，具有较高的可信
度，在疾病诊断方面得到了广泛应用。但幽门螺旋杆菌的DNA突变性非常高，存在大量的变
异，具有高度不一致性，很容易造成假阴性的结果。因此，现有方法的临床敏感性不是十分
理想。

发明内容

[0004] 为了更好规避以上缺陷  ,为患者提供尽早、准确的诊断结果，提供了一种制备简单、成本低廉、使用方便、不需要高精尖仪器、更为准确、高效的检测试剂盒。所述试剂盒通
过核酸‑抗体双重检测方法对幽门螺旋杆菌进行检测，能更有效检测幽门螺旋杆菌, 从而
及早诊断，利于患者尽快治疗。

[0005] 本发明提供以下技术方案：

[0006] 本发明提供一种特异性结合幽门螺旋杆菌的单克隆抗体3F8，其包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，重链CDR1区、CDR2区和CDR3区
的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2和3所示；该轻链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，
其中轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5和6所示。

[0007] 另一方面，本发明提供一种特异性结合幽门螺旋杆菌的单克隆抗体3F8，其包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO :7，轻链可变区包含
氨基酸序列SEQ ID NO :8。

[0008] 在一些实施方案中，本发明所述的抗幽门螺旋杆菌抗体包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序
列或CDR序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列或CDR序列。本发明的
抗体可以是全长抗体，所述全长抗体包含恒定区，所述全长抗体轻链恒定区进一步包含鼠
源κ、λ链序列。所述全长抗体重链恒定区进一步包含鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA或
IgM序列。

[0009] 在一些实施方式中，本发明的抗幽门螺旋杆菌抗体是由上述的抗幽门螺旋杆菌抗体或抗体片段形成的Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗
体分子或多特异性抗体。

[0010] 本发明另外提供一种幽门螺旋杆菌荧光量子点快速检测试纸，其中将3F8单克隆抗体标记量子点配制备而成。

[0011] 本发明提供另外一种用于快速检测幽门螺旋杆菌的试纸条RPA(LFD RPA)检测试剂盒，含有侧流层析试纸条，以及有一对引物和一条探针，其中所述上游引物序列如SEQ ID 
NO :9所示，所述下游引物序列如SEQ ID NO :10所示，所述探针的序列如SEQ ID NO :11所
示。

[0012] 具体的，上游引物(SEQ ID NO :9)：

[0013] CGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGC

[0014] 下游引物(SEQ ID NO :10)：

[0015] Biotin‑ CGGATTTTACCCCTACACCAAGAATTCCACCTAC

[0016] 探针序列(SEQ ID NO :11)：

[0017] FAM‑ CGTAAAGAGCGCGTAGGCGGGATAGTCAGTCAGGTGTGAAATCCTATG,

[0018] 在一些实施例中，本发明的探针在中间距5’端36bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的距5’端35bp和37bp位置的胸腺嘧啶(dT)分别被荧光基团FAM和淬灭基
团BHQ1取代，并且在探针的3’末端通过阻塞基团C3Spacer修饰。

[0019] 在一些实施例中，如上所述的核酸探针，所述荧光基团可替换为TAMARA，所述淬灭基团可替换为BHQ2；所述的脱碱基位点可替换为四氢呋喃；所述探针3’端的C3Spacer修饰
可替换为磷酸化设计或连接biotin‑TEG。

[0020] 所述试纸条带有检测线，检测线上固定有分子A；

[0021] 序列如SEQ ID NO.10所述的引物，其末端带有特异性结合前述分子A的分子B。所述分子A是生物素配体，分子B是生物素。

[0022] 在本发明所述的试纸条RPA检测试剂盒中，优选的，所述试剂盒中还包括水解缓冲液，醋酸镁以及ddH2O。

[0023] 本发明提供的试纸条法，RPA探针中间位置的两个胸腺嘧啶核苷酸上分别标记一个荧光基团和一个荧光淬灭基团，两个基团之间设计一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点可
被具有3'‑5'外切酶活性的核酸外切酶III识别、切割，游离荧光基团，从而发出荧光信号随
后被荧光检测的仪器；同时留下可延伸3’‑OH，DNA聚合酶以探针为“正向引物”继续延伸合
成DNA，与反向引物(带亲和标记，例如生物素)一起扩增出一种带有双重标记(荧光基团标
记、亲和标记)的扩增产物；该产物在侧向流检测试纸中层析，遇到可识别亲和标记的试纸
区域(通常为一条线，即“检测线”，带有链霉亲和素)时，则被富集，表现出线形荧光信号。试
纸条法由于不依赖荧光定量PCR仪，成本和适用范围更广。

[0024] 本发明进一步的，提供一种幽门螺旋杆菌的检测方法，它是使用前述引物和探针对样品进行扩增，再用核酸检测试纸条检测扩增产物即可。结果检测：结合试纸条进行显
色，上述扩增产物吸取5μL‑25μL，用缓冲液1×PBST稀释10倍‑50倍，用相应标记的试纸条进
行检测。结果判读：同时出现T线和C线为阳性(+)，仅出现C线为阴性(‑)，只出现T线需考虑
试纸条是否有效性。

[0025] 在一些实施方式中，本发明提供一种核酸‑抗体双重检测幽门螺旋杆菌的试剂盒，所述试剂盒含有特异性检测幽门螺旋杆菌核酸的RPA试剂盒以及特异性检测幽门螺旋杆菌
的含有单克隆抗体的试纸条；所述RPA试剂盒含有SEQ ID NO:9和10的引物以及SEQ ID NO:
11的探针；所述单克隆抗体的试纸条为将抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体3F8标记量子点制备
而成的荧光量子点快速检测试纸条；其中，所述抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体3F8包括重链可
变区，其包含SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的
CDR3,以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:4所示的CDR1、SEQ ID NO:5所示的CDR2和SEQ ID 
NO:6所示的CDR3。

[0026] 在一些实施方式中，本发明提供一种核酸‑抗体双重检测幽门螺旋杆菌的试剂盒，所述试剂盒含有特异性检测幽门螺旋杆菌核酸的RPA试剂盒以及特异性检测幽门螺旋杆菌
的含有单克隆抗体的试纸条；所述RPA试剂盒含有SEQ ID NO:9和10的引物以及SEQ ID NO:
11的探针；所述单克隆抗体的试纸条为将抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体3F8标记量子点制备
而成的荧光量子点快速检测试纸条；其中，所述抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体3F8单克隆抗体
的重链可变区序列如SEQ ID NO:7所示,轻链可变区序列如SEQ ID NO:8所示。

[0027] 一种检测幽门螺旋杆菌试剂盒的应用，所述试剂盒通过体外测定来自受试者的生物试样中是否存在幽门螺旋杆菌及其含量。

[0028] 在一些实施方式中，本发明所述的生物试样为粪便、血液、血浆、血清、尿、唾液或组织。

[0029] 有益效果

[0030] 本发明通过针对幽门螺旋杆菌的DNA序列进行分析获得了特异性针对幽门螺旋杆菌的RPA引物和探针，并制备出幽门螺旋杆菌检测试剂；同时针对幽门螺旋杆菌筛选并获得
效果较好的单克隆抗体，将所述单克隆抗体标记量子点和其他抗体标记的硝酸纤维素膜制
备获得幽门螺旋杆菌荧光量子点快速检测试纸，将以上两个检测方法进行组合使用，用于
幽门螺旋杆菌患者的诊断，能够进一步提高检测的准确性，从而及早诊断，利于患者尽快治
疗，适于大规模推广使用。

附图说明

[0031] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。

[0032] 图1小鼠抗体亚型鉴定结果。

[0033] 图2 RPA检测方法灵敏度评价结果图。

具体实施方式

[0034] 以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

[0035] 实施例1.抗幽门螺旋杆菌抗体制备

[0036] 取‑70℃保存的H.pylori于5.1%O2、10%CO2微氧条件下37℃培养48h，生理盐水洗涤后，超声破碎菌体，超声后14000rpm，离心15 分钟，将上清转移至新的离心管，沉淀以含8M 
尿素的PBS 缓冲液重悬,上清和沉淀菌体蛋白‑20℃保存备用。将上清和沉淀菌体蛋白分别
用弗氏完全佐剂(CFA)乳化后，按照1:1的比例混合, 对6‑8周龄的Balb/c雌性小鼠进行腹
部多点注射免疫，注射剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次,抗原使用弗氏非完全佐剂
(IFC)乳化,剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天取小鼠血清检测效价,效价最高的小鼠以
尾静脉注射冲击免疫,抗原用生理盐水混匀,剂量为50μg/只。取免疫后的Balb/c小鼠脾细
胞，使用PEG法将其与骨髓瘤Sp2/0细胞株融合，将融合后的细胞用20% FBS‑HAT‑DMEM 培养
基重悬，然后均匀铺于96 孔板内，37℃，5%CO2培养。融合后的细胞在培养一周左右后用10% 
FBS‑HT‑DMEM培养基进行半量换液，当细胞菌落覆盖孔底的面积达到 1/3～1/2 时，取培养
上清，用间接ELISA方法进行阳性克隆的检测。经过克隆化筛选和培养的杂交瘤细胞株，采
用有限稀释法进行克隆化培养。同样以ELISA方法进行筛选，最终获得阳性杂交瘤细胞株并
将其命名为3F8。扩大培养后，冻存杂交瘤细胞。

[0037] 实施例2. 单克隆抗体的纯化

[0038] 取BALB/c小鼠，在接种杂交瘤细胞前1周，经腹腔注射降植烷，0.5ml/只。1周后，每6
只小鼠经腹腔接种约 1X10个杂交瘤细胞；7～10d后，收集腹水。将腹水经 10000×g离心
30min后，弃沉淀，用50%硫酸铵盐析粗提,PBS溶解，流水透析5h；用0.1mol/L磷酸盐缓冲液
（pH8.0）透析平衡过夜；上样，用0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0）洗脱杂蛋白，用不同pH值的
柠檬酸盐洗脱液洗脱，分段收集洗脱峰，浓缩后，得到纯化后的抗幽门螺旋杆菌抗体3F8。

[0039] 实施例3.抗幽门螺旋杆菌抗体亚型鉴定

[0040] 根据亚类测定试剂(sigma公司)对间接ELISA筛选出的阳性鼠单克隆细胞株进行亚类测定。试剂盒中提供的酶标板上已经预包被了针对小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、
IgM、kappa轻链、lambda轻链的特异性抗体，将实施例2中纯化的抗幽门螺旋杆菌抗体3F8样
品加入样品孔中，每孔50μl，无需孵育。将1X羊抗鼠IgA+IgM+IgG‑HRP加入样品孔中，每孔50
μl，轻轻混匀后，孵育1h。扣去孔中液体加入1XPBST洗孔3次，吸水纸吸干多余水分。加入显
色液，每孔100μl，室温避光显色15min。加入100μl终止液，终止显色反应。结果如图1所示，
本发明的单克隆抗体为IgG2a亚型。

[0041] 实施例4.单克隆抗体序列确定

[0042] 从液氮中取出3F8杂交瘤细胞细胞冻存管，于37℃快速融解，1000rpm，5min离心去除冻存液，置于100mm孔板，培养至占培养板约80％，加入1ml Trizol试剂(Thermo公司)，并
依据说明书提取杂交瘤细胞总RNA。取2.5μg上述总RNA，加入DECP水，使体积达到11μl，加入
1.0μl oligo(dT)(10μM)，加入1μl dNTPs(10mM)，混合均匀，65℃孵育5分钟后置冰上1分
钟，然后加入4μl RT buffer(5×)，1.0μl DTT(100mM)，1μl Ribonuclease Inhibitor及1μ
l逆转录酶(takara公司)，50℃反应10min。80℃孵育10分钟以终止反应，获得的cDNA保存
在‑20℃。设计特异性的巢式PCR引物，该扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一
框架区和恒定区互补，采用常规PCR方法扩增目的基因。其中，引物序列的设计按照文献
(Bodo Brocks.Species‑Crossreactive scFv Against the Tumor Stroma Marker
“Fibroblast Activation Protein”Selected by Phage Display From an Immunized 
‑/‑
FAP Knock‑Out Mouse)进行。

[0043] 测序结果显示,本发明所述的抗幽门螺旋杆菌抗体3F8的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；该抗体的重链可变区3个CDR的氨基酸序
列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示；轻链可变区3个CDR的氨基酸序列
分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。

[0044] 实施例5. 抗幽门螺旋杆菌抗体亲和力测定

[0045] 取经超声破碎的幽门螺旋杆菌的超声上清,包被浓度为5μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜，PBST洗涤3次。每孔加200μl，浓度为2 % 的脱脂奶粉作为封闭液，37℃封闭2h，PBST
洗涤3次。将实施例2纯化的单克隆抗体，稀释成以下浓度：1000ng/mL、500ng/mL、125 ng/
mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.625ng/mL、3.125ng/mL、0.625 ng/mL，最后1孔留空白对照，
37℃ 孵育1h，PBST洗涤3 次。HRP标记的羊抗鼠二抗1:5000稀释,每孔100μl，37℃ 孵育1h，
PBST洗涤3次。每孔加入100μl TMB显色液，显色15min，加入50μl终止液终止反应。用酶标仪
测定波长450nm 的吸光值。画出OD 值对应抗体稀释倍数的曲线 ，找出1/2“平台OD值”对应
9
的抗体浓度A。利用公式：亲和常数≈150000/A，计算出亲和常数为1.37×10。

[0046] 实施例6.抗幽门螺旋杆菌多克隆抗体的制备

[0047] 取经超声破碎的幽门螺旋杆菌全菌蛋白作为抗原，按照每只兔子1mg蛋白的量进行免疫。将1mg蛋白溶于500μl无菌PBS中，然后加入等体积的佐剂，在漩涡震荡器上混匀1h，
然后用注射器吹吸混匀后皮下多点注射。14天后重复该实验，多次免疫后，采取耳缘静脉血
进行抗血清效价的检测。当抗血清的效价达到融合标准，进行一次加强免疫后，选用一次全
采血法,自颈动脉无菌放血,分离血清,加入适量防腐剂,分装小瓶,低温冰箱保存。用50%硫
酸铵沉淀一次,33%硫酸铵沉淀两次,然后用DEAE层析法把兔血清进行纯化，提取IgG。用间
接ELISA 法测定纯化的IgG效价, 得到抗幽门螺旋杆菌多克隆抗体。

[0048] 实施例7.幽门螺旋杆菌荧光量子点快速检测试纸的制备及验证

[0049] 将实施例2纯化的3F8单克隆抗体标记量子点，实施例6纯化的抗幽门螺旋杆菌多克隆抗体包被硝酸纤维素膜搭配检测。将其制备成快速检测试纸后，对其进行交叉反应测
试。将埃希克氏大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、痢疾志贺氏菌、绿脓杆菌以及幽门螺旋杆菌标准
株经超声破碎后，收集上清并作为包被抗原, 用所述幽门螺旋杆菌荧光量子点快速检测试
纸检测，观察是否存在交叉反应。 (+)代表检测结果阳性，(‑)代表检测结果阴性。检测结果
表明幽门螺旋杆菌荧光量子点快速检测试纸与所测样品没有交叉反应，具有良好的特异
性。

[0050] 表1

[0051]

[0052] 实施例8. RPA特异性检测引物的设计

[0053] 对幽门螺旋杆菌常见株的基因序列进行比对，选择特异性的保守区，设计检测幽门螺旋杆菌的RPA引物组，其序列如下所示：

[0054] 上游引物(SEQ ID NO:9)：

[0055] CGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGC

[0056] 下游引物(SEQ ID NO :10)：

[0057] Biotin‑ CGGATTTTACCCCTACACCAAGAATTCCACCTAC

[0058] 探针序列(SEQ ID NO :11)：

[0059] FAM‑CGTAAAGAGCGCGTAGGCGGGATAGTCAGTCAGGTGTGAAATCCTATG,探针在中间距5’端36bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的距5’端35bp和37bp位置的胸腺嘧啶
(dT)分别被荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1取代，并且在探针的3’末端通过阻塞基团
C3Spacer修饰。

[0060] 实施例9. 幽门螺旋杆菌DNA 提取

[0061] 幽门螺旋杆菌DNA 提取的具体操作步骤为:在1.5ml的离心管中加入细菌原液350μl，加入等量(350μl)预热的组织裂解液,再加入蛋白酶K (终浓度为0.2mg/ml)，混匀，56℃
水浴2小时；每管加入700μl饱和酚混匀，12000rpm 离心10min；吸取700μl上层溶液置于一
个新的1.5ml的离心管中，加入350μl饱和酚,再加入350μl氯仿:异戊醇(24:1)混匀，
12000rpm 离心10min；吸取700μl上层溶液置于一个新的1.5ml的离心管中,加氯仿:异戊醇
(24 :1 )700μl 混匀,12000rpm 离心10m in；吸取700μl 上层溶液置于一个新的

[0062] 1  .5ml 的离心管中,加入7 00μl氯仿混匀,12000 rpm 离心10min ；取上清400μl，加入2.5倍体积(1000μl)无水乙醇，加入1 /10体积(40μl) 3M NaAC(pH =5.2)混匀，‑ 20
℃放置2小时；12000 rpm，4 ℃离心30min，小心吸弃上清；加入1ml 75%无水乙醇洗涤沉淀，
12000rpm，4℃离心10mi n；弃上清,自然干燥后,加入30μl TE缓冲液,室温溶解30min 即为
提取的幽门螺旋杆菌基因组DNA ,‑20℃保存备用。

[0063] 实施例10. RPA反应灵敏度检测

[0064] 以实施例9提取的幽门螺旋杆菌DNA作为模板，进行RPA试验，采用筛选的引物进行RPA扩增，同时设置超纯水为阴性对照，反应温度为36℃，反应时长为20min，RPA反应体系为
50μl，其中，2μl正反向引物(10μM)，2μl反向引物(10μM)，0.6μl探针，25μl含重组酶、DNA聚
合酶、单链结合蛋白、核酸内切酶IV的缓冲液，1μl模板和17.9μlddH2O，充分振荡混匀并且
瞬离，最后加入2.5μl的280mM醋酸镁，将反应管置于实时荧光PCR仪中36℃恒温反应相应时
长；结果如图2所示。如图2所示，当模板浓度为500pg，50pg，5pg时，均出现明显扩增曲线，但
模板浓度低于0.5pg时无明显扩增曲线，即说明RPA的检测最低限为5pg，具有较好的检测精
度。

[0065] 实施例11. 幽门螺旋杆菌RPA检测试纸条的制备及检测

[0066] 链霉亲和素包被的纳米金颗粒的制备:取1ml纳米金颗粒溶液(0.15pmol/mL)，加入200mM的硼砂溶液,调整pH值至9.5。同时,在另一个试管中将2μl的链霉亲和素(2mg/ml)
与398μl的硼砂溶液(2mM)混合；将稀释的链霉亲和素加入到前述的纳米金颗粒溶液中,以
50μl的量递加，边加边搅拌。将混合物置室温放置45分钟,加入含有155.6μl含10%BSA的2mM 
硼砂溶液,继续将溶液在室温放置10 分钟，4500g离心15分钟，吸弃液体，用1ml的洗涤液
(含有10g /L BSA的2mM硼砂溶液)重悬沉淀，4500g离心15 分钟,吸弃液体,将红色的沉淀
重悬在250μl含有5%BSA、137mM NaCl和0.025 %吐温‑200的缓冲液中。按照此比例制备足量
的链霉亲和素包被的纳米金颗粒,取250μl上述包被的纳米金颗粒滴加到7mm×300mm激光
切割的玻璃纤维垫上,使之扩散均匀,在实验台上干燥过夜。

[0067] 胶体金侧向流免疫层析试纸条的制备:用含有5%甲醇、2%蔗糖的100mM碳酸氢钠缓冲液将抗羧基荧光素抗体和生物素化的抗鼠IgG 分别稀释到终浓度为0.5mg/ml和1.0mg/
ml。所有抗体均用侧向流试剂分配器,分配器头的速度设定在1～3厘米/分钟,优选为2厘
米/分钟,注射泵的流速设定在0.1～0.3ml/分钟,优选为0.1ml/分钟。当两种抗体在纸条上
点样完成后,将试纸条在37 ℃干燥1小时。然后按照如下步骤进行试纸卡的装配: 首先将
一个17mm× 300mm的吸收垫放在塑料支撑的硝酸纤维素膜的右手下游端,二者重叠2毫米;
随后将一个7 mm× 300mm含有干燥金纳米颗粒的玻璃纤维垫放在硝酸纤维素膜的左手上
游端,二者重叠2 毫米;最后将一个12mm× 300mm的玻璃纤维样品垫放在金纳米颗粒垫的
左手端,二者重叠2毫米。装配完成后,将试纸卡立即裁成3mm宽的试纸条即得到胶体金侧向
流免疫层析试纸条,密封、干燥保存。

[0068] 此外，幽门螺旋杆菌的RPA试剂盒包括实施例8中设计的引物和探针、水解缓冲液、酶混合物、醋酸镁(280mM)、无核酸酶纯水以及侧向层析试纸条，试纸条带有检测线，检测线
上固定有分子链霉亲和素，能够与引物SEQ ID NO :10末端的生物素特异性结合。

[0069] 将所述的试纸条分别检测实施例9提取的幽门螺旋杆菌DNA、金黄色葡萄球菌、埃希克氏大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、痢疾志贺氏菌的基因组DNA，以确定本发明RPA检测方法的
特异性。RPA反应体系为50μl，其中，2μl正反向引物(10μM)，2μl反向引物(10μM)，0.6μl探
针，25μl含重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、核酸内切酶IV，1μl样品和17.9μlddH2O，充分
振荡混匀并且瞬离，最后加入2.5μl的280mM醋酸镁。反应温度设为36℃的水浴锅中进行，反
应时间设定为20min。结果表明，幽门螺旋杆菌DNA的样本同时出现T线和C线为阳性(+)，其
他病原体的DNA样本仅出现C线为阴性(‑)，说明本发明的试纸条试剂盒可以有效检测幽门
螺旋杆菌，结果如下表2所示。

[0070] 表2

[0071]

[0072] 实施例12.实际样品检测

[0073] 选取经病理确诊的胃黏膜幽门螺旋杆菌感染病人和健康病人各100例，取其粪便和胃粘膜组织分别采用荧光量子点快速检测试纸以及试纸条RPA进行检测，检测结果见表
3。从表3结果可以看出，抗体荧光量子点试纸条和RPA试纸条的方法均可以较好的检测幽门
螺旋杆菌，荧光量子点快速检测试纸检测的阳性率为96%，试纸条RPA检测阳性率为88%，荧
光量子点快速检测试纸检测与试纸条RPA联合检测幽门螺旋杆菌的阳性率为98%，两者联合
检测高于其单独检测。将幽门螺旋杆菌抗原检测与DNA检测二者结合，可以起到良好的补
充，加强检测结果的准确性。

[0074] 表3

[0075]