结核分枝杆菌对氨基水杨酸耐药相关的基因突变位点及其应用

摘要

本发明提供了结核分枝杆菌对氨基水杨酸(PAS)耐药相关的基因突变位点及其应用，该基因突变位点为metH基因突变位点和/或rv3253c基因启动子区域突变位点；相对于序列为SEQ ID No.1的核酸，所述metH基因突变位点及其突变类型为A1108G、T1631C或A3292C；相对于序列为SEQ ID No.2的核酸，所述rv3253c基因启动子区域突变位点及其突变类型为G7A、C31T、C33T、G35A、T39C、G40A、G42A或G57A。本发明提供的metH基因或rv3253c基因启动子区域上的突变将导致结核分枝杆菌PAS耐药水平的增加，因此本发明提供的结核分枝杆菌PAS耐药相关的基因突变位点可作为检测靶点应用于结核分枝杆菌PAS耐药性的检测中，提高了其耐药阳性检出率，能够有效缩短相应患者的诊断时间，节约患者治疗时间和费用。

权利要求

1.结核分枝杆菌对氨基水杨酸耐药相关的基因突变SNP分子标记，其特征在于，所述基因突变SNP分子标记为rv3253c基因启动子区域突变位点；相对于序列为SEQ ID No.2的核酸，所述rv3253c基因启动子区域突变位点及其突变类型为G7A、C31T、C33T、G35A、T39C、G40A、G42A以及G57A。

2.一种如权利要求1所述基因突变SNP分子标记在制备对氨基水杨酸耐药的结核分枝杆菌的检测试剂中的应用，其特征在于，所述检测试剂包括用于检测所述基因突变SNP分子标记的引物组合物和探针，所述引物组合物包括核苷酸序列为SEQ ID No. 7 8的引物，所~述探针的序列选自SEQ ID No. 12 SEQ ID No. 14。

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3.一种如权利要求1所述基因突变SNP分子标记在制备对氨基水杨酸耐药的结核分枝杆菌的检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测试剂盒包括用于检测所述基因突变SNP分子标记的引物组合物和探针，所述引物组合物包括核苷酸序列为SEQ ID No. 7 8的引~物，所述探针的序列选自SEQ ID No. 12 SEQ ID No. 14。

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说明书

结核分枝杆菌对氨基水杨酸耐药相关的基因突变位点及其

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及结核分枝杆菌耐药基因突变检测技术领域，尤其涉及结核分枝杆 菌对氨基水杨酸(PAS)耐药相关的基因突变位点及其应用。

背景技术

[0002] 结核病是由结核分枝杆菌感染引起的传染性疾病，是世界范围内第一大致死 性传染病。耐多药结核日益增加是全球结核病的防控面临的最严峻的挑战之一。 相比于非耐药结核病，耐药结核病的治疗时间从6个月增长至12‑24个月，治疗 费用增长数十倍。中国是耐药结核大国，我国多耐药结核病人数量占全球13％。 近年来，由于耐多药结核病和泛耐药结核病的增加，对氨基水杨酸(PAS)主要 用于泛耐药结核病患者的加强治疗方案、以及对治疗没有反应的耐多药结核病患 者。PAS的副作用主要是难以耐受的胃肠道副反应，然而它有力的抗结核效果又 为治愈耐药结核病不可或缺，因此用药之前了解患者对此药的耐药情况尤为重 要。

[0003] 表型药敏试验对人员、基础设施、生物安全性要求高，且耗时、耗力，常规 培养方法至少需要额外的3‑4周时间获得药敏结果。目前分子耐药诊断由于其快 速的特征，已经得到了WHO指南的推荐。对结核患者，尤其是耐药结核患者， 快速诊断其耐药性对于临床方案的选择和制定很重要。

[0004] 目前已知的PAS的作用机制为干扰结核分枝杆菌的叶酸代谢和胸腺嘧啶核 苷酸的生物合成。耐药机制主要涉及以上通路中的6个基因(thyA、dfrA、folC、 folP1、ribD、thyX)。然而以上6个基因的突变只能解释不到40％的表型耐药， 仅用上述基因诊断耐药具有较高的假阴性率。再考虑到目前常规检测中并未开展 PAS药敏及相关耐药基因的检测，因此发现PAS的新的耐药基因及检测方法对 于耐药结核的快速诊断和治疗有着重要意义。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供了结核分枝杆菌PAS耐药 相关的基因突变位点及其应用，该基因突变位点具体为：与野生型H37Rv标准 株的metH基因相比，metH基因的第1108位(碱基a突变为g)或第1631位(碱 基t突变为c)或第3292位(碱基a突变为c)突变位点；与野生型H37Rv标准 株相比，rv3253c基因启动子区域的第‑7位(碱基g突变为a)突变位点或第‑31 位(碱基c突变为t)突变位点或第‑33位(碱基c突变为t)突变位点或第‑35 位(碱基g突变为a)突变位点或第‑39位(碱基t突变为c)突变位点或第‑40 位(碱基g突变为a)突变位点或第‑42位(碱基g突变为a)突变位点或第‑57 位(碱基g突变为a)突变位点。

[0006] 本发明为解决上述技术问题采用以下技术方案：

[0007] 本发明的第一方面是提供结核分枝杆菌PAS耐药相关的基因突变位点，该 基因突变位点为metH基因和/或rv3253c基因启动子区域突变位点；相对于序列 为SEQ ID No.1的核酸，所述MetH基因突变位点及其突变类型为A1108G、 T1631C或A3292C；相对于序列为SEQ ID No.2的核酸，所述rv3253c基因启动 子区域突变位点及其突变类型为G7A、C31T、C33T、G35A、T39C、G40A、 G42A或G57A。

[0008] 本发明的第二方面是提供第一方面提供的基因突变位点在制备PAS耐药的 结核分枝杆菌的检测试剂中的应用，该检测试剂包括用于检测所述基因突变位点 的引物组合物和/或探针。

[0009] 进一步地，引物组合物包括苷酸序列为SEQ ID No.3～6的引物和/或核苷酸 序列为SEQ ID No.7～8的引物。

[0010] 进一步地，探针的序列选自SEQ ID No.9～SEQ ID No.14和其碱基互补序 列。

[0011] 本发明的第三方面是提供第一方面提供的基因突变位点在制备PAS耐药的 结核分枝杆菌的检测试剂盒中的应用，该检测试剂盒包括用于检测所述基因突变 位点的引物组合物和/或探针。

[0012] 进一步地，引物组合物包括苷酸序列为SEQ ID No.3～6的引物和/或核苷酸 序列为SEQ ID No.7～8的引物；探针的序列选自SEQ ID No.9～SEQ ID No.14 和其碱基互补序列

[0013] 本发明的第四方面是提供一种PAS耐药的结核分枝杆菌的检测试剂盒，该试 剂盒包括用于检测第一方面提供的基因突变位点的引物组合物和/或探针。

[0014] 进一步地，上述引物组合物包括苷酸序列为SEQ ID No.3～6的引物和/或核 苷酸序列为SEQ ID No.7～8的引物；探针的序列选自SEQ ID No.9～SEQ ID No. 14和其碱基互补序列。

[0015] 本发明的第五方面是提供一种采用第四方面提供的检测试剂盒的结核分枝 杆菌耐药突变碱基的快速筛查法，该快速筛查法为扩增metH基因及其内部碱基 序列并检测metH基因的突变位点；和/或扩增rv3253c基因启动子区域并检测 rv3253c基因启动子区域突变位点。

[0016] 本发明的第六方面是提供一种检测结核分枝杆菌耐药突变碱基的二代测序 方法，其步骤为通过高通量测序，并与核苷酸序列为SEQ ID No.1的metH基因 和/或核苷酸序列为SEQ ID No.2的rv3253c基因启动子区域进行比对，检测metH 基因及其碱基序列的第1108、1631或3292位是否发生碱基突变和/或rv3253c 基因启动子区域及其碱基序列的第
7、31、33、35、39、40、42或57位是否发 生碱基突变。

[0017] 本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

[0018] 本发明提供的metH基因或rv3253c基因启动子区域上的突变将导致结核分 枝杆菌PAS耐药水平的增加，因此本发明提供的结核分枝杆菌PAS耐药相关的 基因突变位点可作为检测靶点应用于结核分枝杆菌PAS耐药性的检测中，提高 了其耐药阳性检出率，能够有效缩短这部分患者的诊断时间，节约患者治疗时间 和费用。

附图说明

[0019] 图1为本发明一实施中结核分枝杆菌metH基因(图A)和rv3253c基因启 动子区域(图B)突变位点的位置图；

[0020] 图2为本发明一实施中metH基因突变的核苷酸和氨基酸序列。

具体实施方式

[0021] 本发明人通过全基因组测序方法，在遗传学差异非常小的传播簇内观察到了PAS耐药表型的变化，比较簇内PAS耐药菌株和敏感菌株间仅有的几个差异 SNP，发现了甲硫氨酸合酶的突变(rv2124c,metH)，随后，发明人扩大样本量， 在共28株PAS耐药菌株及107株PAS敏感菌株中进行检测，一共在4株耐药菌 株中发现metH基因的突变，分别为1108a>g、1631t>c、3292a>c，以上突变发生 的频率为14.3％，在敏感菌株中未发现metH基因突变，这说明在PAS耐药的菌 株中，metH基因的突变有一定的发生频率。同时，发明人通过体外诱导耐药的 方式获得PAS耐药株，对诱导耐药的菌株及敏感的亲本菌株进行全基因组测序， 通过数据分析比较其差异SNP，发现诱导耐药菌株中rv3253c基因启动子区域存 在唯一的差异突变，且其突变类型较多，这说明rv3253c基因启动子区域突变与 PAS耐药相关。因此metH基因或rv3253c基因启动子的突变可以作为临床PAS 耐药分子诊断的诊断依据。

[0022] 基于此，本发明提供了一种结核分枝杆菌PAS耐药相关的基因突变位点及其 应用，该基因突变位点具体为：与野生型H37Rv标准株的metH基因(SEQ ID No.1)相比，metH基因的第1108位(碱基a突变为g)或第1631位(碱基t突 变为c)或第3292位(碱基a突变为c)突变位点；与野生型H37Rv标准株的 rv3253c基因启动子区域(SEQ ID No.2)相比，rv3253c基因启动子区域的第‑7 位(碱基g突变为a)突变位点或第‑31位(碱基c突变为t)突变位点或第‑33 位(碱基c突变为t)突变位点或第‑35位(碱基g突变为a)突变位点或第‑39 位(碱基t突变为c)突变位点或第‑40位(碱基g突变为a)突变位点或第‑42 位(碱基g突变为a)突变位点或第‑57位(碱基g突变为a)突变位点。

[0023] 下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理 解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

[0024] 实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使 用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

[0025] 实施例1

[0026] 本实施例筛选与PAS耐药相关的metH基因突变位点，具体的操作方法和结 果如下：

[0027] 步骤一，预测与PAS耐药相关的碱基突变位点

[0028] 首先采用二代测序技术，对来自中国的55株多耐药结核分枝杆菌临床株， 进行全基因组测序，通过生物信息学方法，预测与对氨基水杨酸(PAS)耐药相 关的碱基突变位点。以H37Rv(NC000962.3)为比对模板，进行单核苷酸多态 性(SNP)分析，并基于SNP构建进化树。在遗传学差异非常小的传播簇内观 察到了PAS耐药表型的变化，比较簇内PAS耐药菌株和PAS敏感菌株间的差异 SNP，发现了metH基因(rv2124c)突变。

[0029] 步骤二，对预测的与PAS耐药相关的碱基位点作进一步验证

[0030] 扩大样本量，对metH基因及其突变的预测结果做进一步验证。另选取了135 株临床菌株，对其进行PAS的表型药物敏感性试验，发现其中28株为PAS耐 药菌株，107株为PAS敏感菌株。

[0031] 以H37Rv标准株为对照，对135株PAS耐药临床株的metH基因的PCR产 物的一代测序结果进行分析，有4株在metH基因内发生了碱基突变，如图1A、 图2和表1所示，突变位点分别为第1108位(碱基a突变为g)、第1631位(碱 基t突变为c)2株和第3292位(碱基a突变为c)，该突变率为14.3％(以上 位点的突变率分别为3.6％、7.1％、3.6％)，且107株敏感株的metH基因均未 发生突变。进一步证明了，预测的基因metH及其碱基突变位点可能与结核分枝 杆菌PAS耐药性相关。

[0032] 表1PAS耐药菌株中metH基因突变位点

[0033]基因组中位置 核苷酸位置及改变 氨基酸位置及改变
2384988 a1108g C370R
2384445 t1631c Q544R
2382784 a3292c Y1098D

[0034] 步骤三，对比分析metH基因与PAS已知耐药相关基因的突变率

[0035] PAS已知耐药相关基因为叶酸代谢、DNA合成通路中的thyA、dfrA、folC、 folP1、ribD、thyX，常应用于结核分枝杆菌PAS耐药性的检测。以上6个基因 的突变率约为表型耐药菌株的40％，仅用上述基因诊断耐药具有较高的假阴性 率。

[0036] 将步骤二中的28株PAS耐药的结核分枝杆菌菌株中的上述6个基因进行测 序分析，发现共有11个菌株发生以上基因的突变，其突变率为39.3％。

[0037] 如果增加metH基因突变的检测，可以使PAS耐药检测的突变率达到53.6％， 可以将准确率提高14.3％。

[0038] 上述分析结果说明单核苷酸多态性(SNP)位点，metH第1108位(碱基a 突变为g)、第1631位(碱基t突变为c)和第3292位(碱基a突变为c)的突 变碱基可作为结核分枝杆菌PAS耐药性分子诊断的一个标志物，有利于提高对 具有PAS耐药性的结核分枝杆菌的检出率。

[0039] 实施例2

[0040] 本实施例通过体外诱导耐药的方法，筛选与PAS耐药相关的rv3253c启动子 区域基因突变位点，具体的操作方法和结果如下：

[0041] 将适当浓度的结核分枝杆菌模式菌株H37Ra涂布于PAS药物浓度为 1mg/mL的7H11平板上，37℃静置培养4‑6周，挑取平板上的单克隆。扩大培 养后，将亲本H37Ra野生株及获得的诱导耐药菌株进行全基因组测序，分析其 差异SNP。在8个耐药克隆中发现了8种不同类型的rv3253c启动子突变(如图 1B所示)，该8种不同类型的rv3253c启动子突变的位点分别为第‑7位(碱基g 突变为a)突变位点、第‑31位(碱基c突变为t)突变位点、第‑33位(碱基c 突变为t)突变位点、第‑35位(碱基g突变为a)突变位点、第‑39位(碱基t 突变为c)突变位点、第‑40位(碱基g突变为a)突变位点、第‑42位(碱基g 突变为a)突变位点、第‑57位(碱基g突变为a)突变位点。

[0042] 实施例3

[0043] 本实施例验证rv3253c启动子突变对基因表达以及过表达rv3253c基因对 PAS MIC的影响。

[0044] 一、验证rv3253c启动子突变对基因表达的影响：通过lacZ酶活实验，验证 启动子突变对后续基因转录的影响。构建携带以上启动子突变的lacZ表达质粒， 并将质粒转入耻垢分枝杆菌(Mycobacterium Smegmatis)，通过检测lacZ酶活的 变化，验证该启动子突变对转录的影响。具体的操作方法如下：

[0045] (1)样本准备：

[0046] 1.取1ml耻垢分枝杆菌液(37℃摇菌3天)13000rpm 1min离心去除培养 基，用1*PBS 500μl清洗细胞2次；

[0047] 2.6000rpm离心3.5min，弃上清；

[0048] 3.用50μl 1*裂解液重悬沉淀物，将样本保存在4℃；

[0049] 4.将样本冷冻在干冰上(30s)，然后37℃水浴解冻(90s)，重复两次；

[0050] 6.最大转速(13000rpm)4℃离心5min，并将上清转移到新的EP管中。

[0051] (2)酶活测定：

[0052] 1.分别取1、5、10μl细胞裂解产物加入96孔板；

[0053] 2.96孔板中加入17μl的ONPG和50μl 1*cleavage buffer(已加入巯基乙醇)；

[0054] 3.酶标仪中37℃孵育30min，并每隔5min读取OD420；

[0055] 4.终止反应，加入125μl终止液，颜色可能会加深，终体积为192μl；

[0056] 5.读取420nm吸光度，未转染的细胞裂解物作为对照；

[0057] 6.测3个不同体积的裂解物(1、5、10μl)，吸光度变化应为线性；

[0058] 7.得到裂解液的精确读数后，确定蛋白裂解物蛋白浓度(BCA法)，然后计 算裂解物酶活，公式如下：

[0059] 酶活＝被水解的ONPG的量(nmol)/t/蛋白(mg)；

[0060] 被水解的ONPG的量(nmol)＝(OD420)(1.92×105nL)/(4500 nL/nmol‑cm)(1cm)；

[0061] (3)BAC法测定蛋白浓度：

[0062] 1.A液：B液＝50：1配成混合液；

[0063] 2.180μl混合液+20μl标准品；

[0064] 3.180μl混合液+10μl裂解产物+10μl ddH2O；

[0065] 4.37℃孵育30min，上机检测。

[0066] 实验结果表明，以上突变会提高rv3253c基因的表达量10‑20倍。

[0067] 二、验证过表达rv3253c基因对PAS MIC的影响

[0068] 构建基于polyG的rv3253c基因过表达质粒，将其导入无毒模式株H37Ra 中，并realtime‑PCR验证其过表达成功。对过表达菌株进行PAS MIC鉴定，发 现其MIC提高4倍以上。

[0069] 以上实验证明，rv3253c启动子突变会导致后续基因，即rv3253c基因的表 达量增加，从而提高了菌株对PAS的耐药程度。

[0070] 实施例4

[0071] 本实施例提供一种采用PCR扩增‑测序的方法来检测PAS耐药相关的基因突 变位点的试剂盒，该试剂盒可以检测出metH基因第1108位(碱基a突变为g)、 第1631位(碱基t突变为c)和第3292位(碱基a突变为c)突变，以及rv3253c 基因启动子区域第‑7位(碱基g突变为a)、第‑31位(碱基c突变为t)、第‑33 位(碱基c突变为t)、第‑35位(碱基g突变为a)、第‑39位(碱基t突变为c)、 第‑40位(碱基g突变为a)、第‑42位(碱基g突变为a)和第‑57位(碱基g突 变为a)突变。该试剂盒包括以下一种或几种试剂的组合：

[0072] (1)从待检样品中提取DNA的试剂；

[0073] (2)用于扩增结核菌样本DNA的metH基因、rv3253c基因启动子区域的 PCR引物和相关的PCR反应试剂；

[0074] (3)对PCR产物进行直接测序的试剂。

[0075] 其中，用于检测metH基因和rv3253c基因启动子区域基因突变的PCR引物 见表2。

[0076] 一种采用该试剂盒检测metH基因和rv3253c基因启动子区域基因突变的方 法，包括如下步骤：

[0077] (1)采集待测个体的培养的结核菌样本，提取全基因组DNA；

[0078] (2)以提取的DNA为模板，以本发明设计的针对metH基因突变、rv3253c 基因启动子区域突变的引物(表2)进行突变区段DNA序列的扩增，得到相应 的PCR扩增产物；

[0079] (3)将得到的PCR产物进行一代测序，将所测得的序列与metH基因、 rv3253c基因启动子区域的正常序列进行比对，确定突变是否存在：图2用方框 标出的是突变的碱基和氨基酸，第1108位碱基由野生型的a变为g，该突变使 野生型的MetH蛋白的第370位半胱氨酸(C)突变成精氨酸(R)；第1631位 碱基由野生型的t变为c，该突变使野生型的MetH蛋白的第544位谷氨酰胺(Q) 突变成精氨酸(R)；第3292位碱基由野生型的腺嘌呤(a)为鸟嘌呤(g)，该突变使 野生型的MetH蛋白的第1098位酪氨酸(Y)突变成天冬氨酸(D)，以上突变 导致MetH蛋白的功能发生改变，进而引起PAS的耐药。图2用方框标出的是 rv3253c启动子区域突变的碱基，以上突变导致Rv3253c表达量增加，进而引起 PAS的耐药，含有以上突变的菌株的PAS表型为耐药。

[0080] (4)根据以上实验结果分析患者的致病菌是否为metH基因突变或rv3253c 启动子区域突变导致的耐PAS结核分枝杆菌菌株。

[0081] 上述方法中得到的PCR产物还能用其他方法进行检测，如DNA杂交探针法。 所用探针能是与突变metH基因、突变rv3253c启动子区域核苷酸序列杂交，也 可以有两个探针分别与正常或突变的metH基因、rv3253c启动子区域核苷酸序 列杂交。探针能够选择同位素标记、有色物质标记或荧光物质标记。其中，本发 明人设计的探针如表3所示。此外，还能够用位点特异的PCR引物、限制性内 切酶或单链构象多态性的方法确定突变。

[0082] 表2 metH基因、rv3253c启动子区域的扩增引物序列信息

[0083]

[0084] 表3人工探针序列信息表

[0085]

[0086]

[0087] 本发明提供的PAS耐药的结核分枝杆菌的检测试剂盒，试剂盒内应装有用 于检测metH和/或rv3253c基因启动子区域基因突变的试剂，同时提供的是经政 府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。如采用 PCR‑直接测序法检测metH和/或rv3253c基因启动子区域基因突变的试剂盒，含 有扩增引物、dNTPs、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液及测序所需试剂 的一种或多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性成分，如扩增引物为 本发明中所提供的一对引物metH‑F和metH‑R，所述用于PCR反应的DNA聚 合酶是能够进行PCR扩增的酶。

[0088] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不 限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的 等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围 下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。