利用NASBA检测REV的方法及使用的成套试剂

摘要

本发明公开了利用NASBA检测REV的方法及使用的成套试剂。成套试剂由“引物F和引物R组成的引物对”和探针组组成；引物对的靶序列含有SEQ ID NO：9所示的特异DNA片段；探针组由SEQ ID NO：3所示的上游探针和SEQ ID NO：4所示的下游探针组成。采用本发明提供的成套试剂检测REV，特异性好(从ALV、MDV、CIAV和REV中准确鉴定出REV)且灵敏度高(灵敏度为2×10个拷贝数/反应体系)，适应于病毒含量低的样品中REV的检测，而且检测方法简便、快速(1h内完成检测)、准确。本发明具有重大的推广价值。

权利要求

1.检测REV的成套试剂，由引物对和探针组组成；

引物对由引物F和引物R组成；引物F为SEQ ID NO：1所示的单链DNA分子；引物R为SEQ ID NO：2所示的单链DNA分子；

探针组由上游探针和下游探针组成；上游探针为SEQ ID NO：3所示的单链DNA分子；下游探针为SEQ ID NO：4所示的单链DNA分子；

上游探针的3′端具有荧光标记；下游探针的5′端具有荧光猝灭基团；

上游探针自3′端起第1至4位核苷酸的碱基均为核糖核苷酸碱基，其它核苷酸的碱基均为脱氧核糖核苷酸碱基；

下游探针自3′端起第1至4位核苷酸的碱基均为核糖核苷酸碱基，其它核苷酸的碱基均为脱氧核糖核苷酸碱基。

2.权利要求1所述成套试剂的应用，为a1）‑a3）中至少一种：a1）制备鉴定REV的试剂盒；

a2）制备检测待测样本中是否含有REV的试剂盒；

a3）制备检测待测病毒是否为REV的试剂盒。

3.试剂盒甲或试剂盒乙；

试剂盒甲含有权利要求1所述成套试剂；

试剂盒乙含有包埋权利要求1所述成套试剂的芯片；

试剂盒甲或试剂盒乙的用途为a4）‑a6）中至少一种：a4）鉴定REV；

a5）检测待测样本中是否含有REV；

a6）检测待测病毒是否为REV。

说明书

利用NASBA检测REV的方法及使用的成套试剂

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及利用NASBA检测REV的方法及使用的成套试剂。

背景技术

[0002] 禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)可以感染火鸡、鸡、鸭、鹅、鹌鹑等多种家禽和一些野鸟，引起禽网状内皮组织增殖病。禽网状内皮组织增殖病存在不同类型症状和病变，一般包括矮小病综合征、淋巴组织和其它组织的慢性肿瘤、急性网状细胞增生性肿瘤等，还严重影响鸡的生长发育和免疫反应(即造成亚临床感染状态下的免疫抑制)，甚至可与鸡贫血病病毒、马立克氏病病毒等互相作用，给养殖业带来了巨大的损失，已成为当前严重危害我国养殖业的传染病之一。弱毒疫苗中REV的污染是困扰我国养鸡业的一个重要问题。特别是在1周龄内使用的弱毒疫苗，如果污染REV，造成的免疫抑制最为严重。因此，能够及时检测REV是有效预防禽网状内皮组织增殖病的基础。

[0003] 目前，常用的检测REV的方法包括病理组织检查、ELISA、试纸条、常规PCR技术、杂交芯片法等等。病理组织检查方法耗时长，对动物本身有破坏性，而且对于操作着有较高的经验要求。ELISA以及试纸条检测方法，灵敏度较低，容易造成检测结果假阴性。常规PCR技术仪器价格昂贵、操作繁琐且耗时较长，在基层的推广使用受到极大的限制。杂交芯片法成本较高、操作比较复杂且依赖较多昂贵的仪器。因此，迫切需要建立一种操作方便、特异性好且灵敏度高的检测REV的方法。

[0004] NASBA(Nuclear acid sequence‑based amplification，核酸依赖性扩增检测技术)是一种扩增RNA的新型技术，其以RNA为模板进行等温核酸扩增并能实时观测检测结果。该技术不需要模板的热变性、长时间循环扩增等过程，而是由一对带有T7启动子序列的引物介导，在体外特异性并连续均一的对单链RNA进行恒温扩增。扩增效率方面，PCR扩增需要
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约20个循环可将DNA模板扩增10倍，而NASBA只需4‑5个循环就可将RNA扩增10 倍。灵敏度方面，NASBA可以检测到溶液中低于10copies/μL的痕量靶标，而PCR的检测限在100copies/μL左右。特异性方面，由于NASBA在反应中无需加热变性步骤，不受样品中DNA、肝素、EDTA、柠檬酸盐、血红蛋白、白蛋白和脂质等污染的影响，更适合粗提样品的直接扩增。由于NASBA对模板RNA的高效扩增，大大缩短了反应时间，从而降低了酶促反应过程中核苷酸的错配几率。由此可见，NASBA的扩增效率、灵敏度和特异性均都高于RT‑PCR技术。此外，NASBA的仪器成本非常低廉，反应条件为41℃，水浴锅即可满足，不需要复杂的升降温PCR设备。NASBA还具有操作简单、无需产物开盖环节，避免交叉污染等优势。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种特异且灵敏的检测REV的方法。

[0006] 本发明首先保护检测REV的成套试剂，可包括引物对和探针组；

[0007] 引物对可由引物F和引物R组成；引物对的靶序列可含有特异DNA片段；特异DNA片段的核苷酸序列可如SEQ ID NO：9所示；

[0008] 探针组可包括上游探针和下游探针；

[0009] 上游探针可为8‑15个核苷酸组成的单链核酸分子，与特异DNA片段中的部分区段相同或互补；

[0010] 下游探针可为8‑15个核苷酸组成的单链核酸分子，与特异DNA片段中的部分区段相同或互补；

[0011] 上游探针与特异DNA片段结合的位置在下游探针与特异DNA片段结合的位置的上游。

[0012] 上述成套试剂中，上游探针的3′端可具有荧光标记；下游探针的5′端可具有荧光猝灭基团。所述荧光标记可为FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、ROX、Texas或Red。所述荧光猝灭基团可为TAMARA、BHQ1、BHQ2或CY5。

[0013] 上述成套试剂中，上游探针自3′端起第1至4位核苷酸的碱基均为核糖核苷酸碱基，其它核苷酸的碱基均为脱氧核糖核苷酸碱基；下游探针自3′端起第1至4位核苷酸的碱基均为核糖核苷酸碱基，其它核苷酸的碱基均为脱氧核糖核苷酸碱基。

[0014] 上述成套试剂中，上游探针可为SEQ ID NO：3所示的单链DNA分子；下游探针可为SEQ ID NO：4所示的单链DNA分子。

[0015] 上述成套试剂中，引物F可为SEQ ID NO：1所示的单链DNA分子；引物R从5′端至3′端依次可包括DNA片段甲和DNA片段乙；DNA片段甲可为RNA聚合酶识别的启动子序列；RNA聚合酶具有催化5′→3′方向的RNA形成的活性；DNA片段乙可为SEQ ID NO：2自5′末端起第29至49位所示的单链DNA分子。

[0016] 所述DNA片段甲中，RNA聚合酶可为T7 RNA聚合酶。

[0017] 所述DNA片段甲可为SEQ ID NO：2自5′末端起第1至28位所示的单链DNA分子。

[0018] 所述引物R从5′端至3′端具体可由DNA片段甲和DNA片段乙组成。

[0019] 所述引物R可为SEQ ID NO：2所示的单链DNA分子。

[0020] 所述探针组具体可由上游探针和下游探针组成。

[0021] 所述检测REV的成套试剂具体可由引物对和探针组组成。

[0022] 上述任一所述成套试剂中，上述任一所述引物F、上述任一所述引物R、上述任一所述上游探针和上述任一所述下游探针的浓度比可为4：4：1：1。

[0023] 上述任一所述成套试剂中，上述任一所述引物F、上述任一所述引物R、上述任一所述上游探针和上述任一所述下游探针的量具体可如下：0.2μM上述任一所述引物F、0.2μM上述任一所述引物R、50nM上述任一所述上游探针和50nM上述任一所述下游探针。

[0024] 本发明还保护上述任一所述成套试剂的应用，可为a1)‑a6)中至少一种：

[0025] a1)制备鉴定REV的试剂盒；

[0026] a2)制备检测待测样本中是否含有REV的试剂盒；

[0027] a3)制备检测待测病毒是否为REV的试剂盒；

[0028] a4)鉴定REV；

[0029] a5)检测待测样本中是否含有REV；

[0030] a6)检测待测病毒是否为REV。

[0031] 本发明还保护试剂盒甲或试剂盒乙。

[0032] 试剂盒甲可含有上述任一所述成套试剂；试剂盒甲的用途可为a4)‑a6)中至少一种：

[0033] a4)鉴定REV；

[0034] a5)检测待测样本中是否含有REV；

[0035] a6)检测待测病毒是否为REV。

[0036] 试剂盒甲还可包括碟式芯片，如24反应腔碟式芯片。

[0037] 本发明还保护试剂盒甲的制备方法，可包括将上述任一所述引物F、上述任一所述引物R、上述任一所述上游探针和上述任一所述下游探针分别单独包装的步骤。

[0038] 试剂盒乙可含有包埋上述任一所述成套试剂的芯片；试剂盒乙的用途可为a4)‑a6)中至少一种：

[0039] a4)鉴定REV；

[0040] a5)检测待测样本中是否含有REV；

[0041] a6)检测待测病毒是否为REV。

[0042] 本发明还保护试剂盒乙的制备方法，可包括包埋上述任一所述成套试剂的芯片的制备步骤。包埋上述任一所述成套试剂的芯片的制备步骤如下：(1)将上述任一所述引物F、上述任一所述引物R、上述任一所述上游探针和上述任一所述下游探针混合，得到混合溶液(混合溶液中，引物F、引物R、上游探针、下游探针的浓度依次可为0.2μM、0.2μM、50nM和50nM)；(2)将混合溶液(如1μL)点入芯片的反应腔，洁净超净台晾干，压片封装，冲压抽真空。所述芯片可为碟式芯片，如24反应腔碟式芯片。

[0043] 试剂盒甲或试剂盒乙还可包括进行NASBA所需的试剂；所述“进行NASBA所需的试剂”不包括NASBA反应所需的引物和探针。

[0044] 所述“进行NASBA所需的试剂”可包括逆转录酶、RNA聚合酶、核糖核酸酶H、RNA酶抑制剂、BSA、Tris‑HCl(pH8.0)、DTT、dNTP、rNTP、MgCl2、KCl、DMSO、山梨糖醇和四甲基氯化铵中的至少一种。

[0045] 逆转录酶可为AMV逆转录酶。RNA聚合酶可为T7 RNA聚合酶。

[0046] 试剂盒甲或试剂盒乙中，上述任一所述引物F、上述任一所述引物R、上述任一所述上游探针和上述任一所述下游探针的浓度比可为4：4：1：1。

[0047] 试剂盒甲或试剂盒乙中，上述任一所述引物F、上述任一所述引物R、上述任一所述上游探针和上述任一所述下游探针的量具体可如下：0.2μM上述任一所述引物F、0.2μM上述任一所述引物R、50nM上述任一所述上游探针和50nM上述任一所述下游探针。

[0048] 本发明还包括一种检测待测样本中是否含有REV的方法，可包括如下步骤：

[0049] (1)提取待测样本的总RNA；

[0050] (2)以步骤(1)提取的总RNA为模板，采用上述任一所述成套试剂进行NASBA，然后进行如下判断：如果成套试剂可以实现对所述总RNA的NASBA，则待测样本中含有或疑似含有REV；如果成套试剂不能实现对所述总RNA的NASBA，则待测样本不含有或疑似不含有REV。

[0051] 本发明还包括一种检测待测病毒是否为REV的方法，包括如下步骤：

[0052] (1)提取待测病毒的总RNA；

[0053] (2)以步骤(1)提取的总RNA为模板，采用上述任一所述成套试剂进行NASBA，然后进行如下判断：如果成套试剂可以实现对所述总RNA的NASBA，则待测病毒为或候选为REV；如果成套试剂不能实现对所述总RNA的NASBA，则待测病毒为或候选为非REV。

[0054] 上述任一所述的方法中，“进行NASBA”的反应体系可包括恒温扩增酶溶液、恒温扩增缓冲液、模板、上述任一所述引物F、上述任一所述引物R、上述任一所述上游探针和上述任一所述下游探针。所述模板可为待测样本的总RNA或待测病毒的总RNA。上述任一所述引物F、上述任一所述引物R、上述任一所述上游探针和上述任一所述下游探针在反应体系中的浓度依次可为0.2μM、0.2μM、50nM和50nM。

[0055] 上述任一所述的方法中，“进行NASBA”的反应体系具体可为10μL，由1μL恒温扩增酶溶液、7μL恒温扩增缓冲液、2μL模板、上述任一所述引物F、上述任一所述引物R、上述任一所述上游探针和上述任一所述下游探针组成。所述模板可为待测样本的总RNA或待测病毒的总RNA。上述任一所述引物F、上述任一所述引物R、上述任一所述上游探针和上述任一所述下游探针在反应体系中的浓度依次可为0.2μM、0.2μM、50nM和50nM。

[0056] 上述任一所述恒温扩增酶溶液的溶质及其浓度可为：AMV逆转录酶1U/μL，T7 RNA聚合酶5U/μL，核糖核酸酶H 0.5U/μL，RNA酶抑制剂5U/μL和BSA 0.5μg/μL；溶剂可为水。

[0057] 上述任一所述恒温扩增缓冲液的溶质及其浓度可为：200mM Tris‑HCl(pH8.0)，50mM DTT，10mM dNTP，10mM rNTP，80mM MgCl2，450mM KCl，15％DMSO，1M山梨糖醇和20mM四甲基氯化铵；溶剂可为水。

[0058] 上述任一所述的方法中，NASBA的反应条件可为：41℃恒温1h。

[0059] 上述任一所述的方法中，“可以实现对所述总RNA的NASBA”可为出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为“倒S型”曲线)。“不能实现对所述总RNA的NASBA”可为没有出现阳性扩增曲线。所述扩增曲线是以扩增时间为横坐标，荧光值为纵坐标绘制而成。荧光值通过实时荧光PCR仪、微流控恒温扩增仪等荧光检测设备检测获得。

[0060] 上述任一所述待测病毒可为禽白血病病毒(ALV)、鸡马立克氏病病毒(MDV)或鸡传染性贫血(CIAV)。

[0061] 上述任一所述待测样本可为家禽病组织、疫苗或SPF鸡胚。所述SPF鸡胚可用于生产弱毒疫苗。

[0062] 上述任一所述24反应腔碟式芯片可为博奥生物集团有限公司生产的“晶芯RTisochipTM‑A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪”的配套碟式芯片，其型号为1x24。

[0063] 采用本发明提供的成套试剂检测REV，特异性好(从ALV、MDV、CIAV和REV中准确鉴定出REV)且灵敏度高(灵敏度为2×10个拷贝数/反应体系)，适应于病毒含量低的样品中REV的检测，而且检测方法简便、快速(1h内完成检测)、准确。本发明具有重大的推广价值。

附图说明

[0064] 图1为检测REV成套试剂2的检测结果。

[0065] 图2为检测REV成套试剂的筛选结果。

[0066] 图3为灵敏度和特异性的检测结果。

具体实施方式

[0067] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

[0068] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0069] 下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

[0070] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0071] 实施例1、检测REV成套试剂的筛选和检测REV试剂盒的制备

[0072] 一、检测REV成套试剂的制备

[0073] 本发明的发明人根据REV env基因(Genebank：MG471384)的核苷酸序列，设计并制备了五个检测REV成套试剂，依次为检测REV成套试剂1、检测REV成套试剂2、检测REV成套试剂3、检测REV成套试剂4和检测REV成套试剂5。

[0074] 检测REV成套试剂1由引物对1和探针组1组成。引物对1由上游引物：5′‑CACCAACTCCCTCGATTGCG‑3′和下游引物：5′‑AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATCATAACAGGTGGAATGCA‑3′(下划线为T7 RNA聚合酶识别的启动子序列)组成。探针组1由上游探针：5′‑TTCACCGCCUAC‑FAM‑3′和下游探针：5′‑TAMRA‑TTACGGGUCU‑3′组成。

[0075] 检测REV成套试剂2由引物对2和探针组2组成。引物对2由上游引物：5′‑CTGACTTACGGGTCTGGGGC‑3′(SEQ ID NO：1)和下游引物：5′‑AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATGCTCCTGCACAGAGGGTATG‑3′(下划线为T7 RNA聚合酶识别的启动子序列)(SEQ ID NO：2)组成。探针组2由上游探针：5′‑TTAGACAACAGU‑FAM‑3′(SEQ ID NO：3)和下游探针：5′‑TAMRA‑GAGTGTGUGUU‑3′(SEQ ID NO：4)组成。

[0076] 检测REV成套试剂3由引物对3和探针组3组成。引物对3由上游引物：5′‑ATCCACTGAGGGTAAAGTTG‑3′和下游引物：5′‑AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATGCTGCGAGGGGTGACTCT‑3′(下划线为T7 RNA聚合酶识别的启动子序列)组成。探针组3由上游探针：5′‑TTGGGACCACU‑FAM‑3′和下游探针：5′‑TAMRA‑TTGTGGTTUGGU‑3′组成。

[0077] 检测REV成套试剂4由引物对4和探针组4组成。引物对4由上游引物：5′‑AATGCCTCACGATAGCCACC‑3′和下游引物：5′‑AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGATGGCAGTAAAATAAGTT‑3′(下划线为T7 RNA聚合酶识别的启动子序列)组成。探针组4由上游探针：5′‑CATTCCACCUG‑FAM‑3′和下游探针：5′‑TAMRA‑AAGGCTCAGGA‑3′组成。

[0078] 检测REV成套试剂5由引物对5和探针组5组成。引物对5由上游引物：5′‑AGGAATGCACCCTCATGGGA‑3′和下游引物：5′‑AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACAGTTTATTAGGCCCGTCTTC‑3′(下划线为T7 RNA聚合酶识别的启动子序列)组成。探针组5由上游探针：5′‑TACTGCCAUCC‑FAM‑3′和下游探针：5′‑TAMRA‑AAGCTAGGUUC‑3′组成。

[0079] 各个检测REV成套试剂中，上游引物和下游引物的碱基均为脱氧核糖核苷酸碱基；上游探针自3′端起第1至4位的碱基均为核糖核苷酸碱基，其它碱基均为脱氧核糖核苷酸碱基；下游探针自3′端起第1至4位的碱基均为核糖核苷酸碱基，其它碱基均为脱氧核糖核苷酸碱基。

[0080] 各个检测REV成套试剂中，上游引物、下游引物、上游探针和下游探针分别独立包装。各个成套试剂中，上游引物、下游引物、上游探针和下游探针的摩尔比为4：4：1：1。

[0081] 采用上述检测REV成套试剂检测NASBA产物的原理为：上游探针和下游探针均可与NASBA产物结合，上游探针的3′端标记有荧光报告基团，下游探针的5′端标记有荧光猝灭基团。当没有扩增出NASBA产物时，上游探针和下游探针均游离与体系中，可检测到较强的荧光信号。当扩增出NASBA产物时，上游探针和下游探针与NASBA产物结合后，上游探针3′端的荧光报告基团和下游探针5′端的荧光猝灭基团十分接近，荧光分子发出的荧光被猝灭分子吸收，并以热量形式散失，体系中荧光信号降低。因此，以扩增时间为横坐标，荧光值为纵坐标，绘制扩增曲线；如果可以实现NASBA，则扩增曲线为倒S形曲线。

[0082] 二、检测REV成套试剂的筛选

[0083] 1、含REV‑env基因的质粒的制备

[0084] 将pUC57质粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)MCS区间的DNA片段替换为REV env基因的核苷酸序列，得到的重组质粒即为含REV‑env基因的质粒。

[0085] REV env基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

[0086] 2、恒温扩增酶溶液的制备

[0087] 制备恒温扩增酶溶液。恒温扩增酶溶液的溶质及其浓度为：AMV逆转录酶1U/μL，T7 RNA聚合酶5U/μL，核糖核酸酶H 0.5U/μL，RNA酶抑制剂5U/μL和BSA 0.5μg/μL；溶剂为水。

[0088] 3、恒温扩增缓冲液的制备

[0089] 制备恒温扩增缓冲液。恒温扩增缓冲液的溶质及其浓度为：200mM Tris‑HCl(pH8.0)，50mM DTT，10mM dNTP，10mM rNTP，80mM MgCl2，450mM KCl，15％DMSO，1M山梨糖醇和20mM四甲基氯化铵；溶剂为水。

[0090] 4、检测REV成套试剂的筛选

[0091] 以含REV‑env基因的质粒为模板，采用检测REV成套试剂1、检测REV成套试剂2、检测REV成套试剂3、检测REV成套试剂4或检测REV成套试剂5进行NASBA。

[0092] 反应体系为10μL，由1μL恒温扩增酶溶液、7μL恒温扩增缓冲液、2μL模板(含20ng含REV‑env基因的质粒)、上游引物、下游引物、上游探针和下游探针组成。反应体系中，上游引物和下游引物的浓度均为0.4μM，上游探针和下游探针的浓度均为0.1μM。

[0093] 反应条件：41℃恒温1h。

[0094] 反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光值。以扩增时间为横坐标，荧光值为纵坐标，绘制扩增曲线，然后进行如下判断：如果在60min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为“倒S型”曲线)，表明反应体系中的相应核酸含量可以被检测出来；如果在60min内没有出现阳性扩增曲线，表明反应体系中的相应核酸含量不能被检测出来。

[0095] 按照上述方法，将含REV‑env基因的质粒替换为无菌水，其它步骤均不变，作为空白对照。

[0096] 检测REV成套试剂2的检测结果见图1(1为含REV‑env基因的质粒，2为空白对照)。

[0097] 检测结果见图2(1为检测REV成套试剂1，2为检测REV成套试剂2，3为检测REV成套试剂3，4为检测REV成套试剂4，5为检测REV成套试剂5，6为空白对照)。结果表明，检测REV成套试剂2和检测REV成套试剂3的性能优于其它检测REV成套试剂，且空白对照不出现非特异扩增。综合各个检测REV成套试剂的检出情况和检出时间，比较，确定检测REV成套试剂2进行后续实验。

[0098] 三、检测REV试剂盒的制备

[0099] 检测REV试剂盒由检测REV成套试剂2、恒温扩增酶溶液和恒温扩增缓冲液组成。

[0100] 实施例2、灵敏度实验和特异性实验

[0101] 一、RNA核酸的制备

[0102] A、REV‑env基因RNA核酸的制备

[0103] 1、取含REV‑env基因的质粒，用限制性内切酶EcoRI 37℃酶切2h，得到酶切产物。

[0104] 2、完成步骤1后，制备转录体系，然后37℃转录4h。

[0105] 转录体系为50μL，包括5μL 5×Transcription Optimized Buffer(Promega)、2U T7 RNA聚合酶、DTT(Promega)、10U重组RNA酶抑制剂(Promega)、rNTP、5μL酶切产物和水。转录体系中，DTT的浓度为10mM，rNTP的浓度为2mM。

[0106] 3、取完成步骤2的体系，加入1μL DNA消化酶(rDNAseI，5U/μL)，震荡离心，37℃孵育20min，得到转录产物RNA。

[0107] 4、完成步骤3后，取转录产物RNA，采用RNA纯化试剂盒(Macherey‑Nagel公司，740948)进行纯化，得到REV‑env基因RNA核酸。纯化的具体步骤如下：

[0108] (1)取离心管(规格为1.5mL)，加入600μL RA1‑乙醇混合液和100μL转录产物RNA(如果转录产物RNA的体积不足100μL，则用水补至100μL)，充分震荡离心，得到产物混合液。

[0109] RA1‑乙醇混合液为RA1和乙醇按照体积比为1:1混合而成。

[0110] (2)完成步骤(1)后，将产物混合液转入吸附柱，12000rpm离心2min，弃下层溶液。

[0111] (3)完成步骤(2)后，向吸附柱加入700μL RA3，静置1min，12000rpm离心2min，弃下层溶液。

[0112] (4)完成步骤(3)后，向吸附柱加入350μL RA3，静置2min，12000rpm离心2min，弃下层溶液。

[0113] (5)完成步骤(4)后，向吸附柱加入300μL RA3，静置2min，12000rpm离心2min，弃下层溶液。

[0114] (6)完成步骤(5)后，重复如下步骤2次：打开吸附柱的盖子静置3min，12000rpm空离2min，弃下层溶液。

[0115] (7)完成步骤(6)后，重复如下步骤2次：将吸附柱转移至新的离心管，打开吸附柱盖子静置15min，然后向吸附柱加入60μL RNAse‑free H2O，静置2min。

[0116] (8)完成步骤(7)后，弃吸附柱，将离心管内的溶液取出2μL，用Nano drop测定其浓度，并记录其浓度以及OD260nm/OD280nm、OD260nm/OD230nm值。离心管内的溶液即为REV‑env基因RNA核酸。

[0117] B、ALV‑env基因RNA核酸的制备

[0118] 1、含ALV‑env基因的质粒的制备

[0119] 将pUC57质粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)MCS区间的DNA片段替换为ALV env基因的核苷酸序列，得到的重组质粒即为含ALV‑env基因的质粒。

[0120] ALV env基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

[0121] 2、按照步骤A的方法，将含REV‑env基因的质粒替换为含ALV‑env基因的质粒，其它步骤均不变，得到ALV‑env基因RNA核酸。

[0122] C、MDV‑meg基因RNA核酸的制备

[0123] 1、含MDV‑meg基因的质粒的制备

[0124] 将pUC57质粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)MCS区间的DNA片段替换为MDV meg基因的核苷酸序列，得到的重组质粒即为含MDV‑meg基因的质粒。

[0125] MDV meg基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

[0126] 2、按照步骤A的方法，将含REV‑env基因的质粒替换为含MDV‑meg基因的质粒，其它步骤均不变，得到MDV‑meg基因RNA核酸。

[0127] D、CIAV‑CUX‑1基因RNA核酸的制备

[0128] 1、含CIAV‑CUX‑1基因的质粒的制备

[0129] 将pUC57质粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)MCS区间的DNA片段替换为CIAVCUX‑1基因的核苷酸序列，得到的重组质粒即为含CIAV‑CUX‑1基因的质粒。

[0130] CIAV CUX‑1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

[0131] 2、按照步骤A的方法，将含REV‑env基因的质粒替换为含CIAV‑CUX‑1基因的质粒，其它步骤均不变，得到CIAV‑CUX‑1基因RNA核酸。

[0132] 二、灵敏度实验

[0133] 1、取REV‑env基因RNA核酸，用无菌水进行梯度稀释，得到各个稀释液。

[0134] 2、以步骤1得到的稀释液为模板，采用检测REV成套试剂2进行NASBA。

[0135] 反应体系为10μL，由1μL恒温扩增酶溶液、7μL恒温扩增缓冲液、2μL稀释液(2μL稀3 2
释液中含有靶标RNA的拷贝数为2×10 、2×10或2×10)、上游引物、下游引物、上游探针和下游探针组成。反应体系中，上游引物和下游引物的浓度均为0.4μM，上游探针和下游探针的浓度均为0.1μM。

[0136] 反应条件：41℃恒温1h。

[0137] 反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光值。以扩增时间为横坐标，荧光值为纵坐标，绘制扩增曲线。

[0138] 如果在60min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为“倒S型”曲线)，表明反应体系中的相应核酸含量可以被检测出来。如果在60min内没有出现阳性扩增曲线，表明反应体系中的相应核酸含量不能被检测出来。

[0139] 检测结果见图3(1为2×103个拷贝，2为2×102个拷贝，3为2×10个拷贝)。结果表明，检测REV成套试剂2检测靶标RNA的灵敏度为2×10个拷贝数/反应体系。

[0140] 三、特异性实验

[0141] 待测样本1：REV‑env基因RNA核酸。

[0142] 待测样本2：ALV‑env基因RNA核酸。

[0143] 待测样本3：MDV‑meg基因RNA核酸。

[0144] 待测样本4：CIAV‑CUX‑1基因RNA核酸。

[0145] 以待测样本(待测样本1、待测样本2、待测样本3或待测样本4)为模板，采用检测REV成套试剂2进行NASBA。

[0146] 反应体系为10μL，由1μL恒温扩增酶溶液、7μL恒温扩增缓冲液、2μL模板(5‑50ng)、上游引物、下游引物、上游探针和下游探针组成。反应体系中，上游引物和下游引物的浓度均为0.4μM，上游探针和下游探针的浓度均为0.1μM。

[0147] 反应条件：41℃恒温1h。

[0148] 反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光值。以扩增时间为横坐标，荧光值为纵坐标，绘制扩增曲线。

[0149] 按照上述方法，将待测样本替换为无菌水，其它步骤均不变，作为空白对照。

[0150] 部分检测结果见图3(4为待测样本3，5为待测样本4，6为待测样本2)：待测样本为REV‑env基因RNA核酸(即待测样本1)的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为“倒S型”曲线)；待测样本为ALV‑env基因RNA核酸(即待测样本2)、MDV‑meg基因RNA核酸(即待测样本3)、CIAV‑CUX‑1基因RNA核酸(即待测样本4)或空白对照的时候不显示阳性扩增曲线。结果表明，检测REV成套试剂2检测靶标RNA具有较高的特异性。