一种同时测定血浆中抗凝药物及活性代谢物浓度的方法

摘要

本发明公开了一种同时测定血浆中抗凝药物及活性代谢物浓度的方法，抗凝药物分别为达比加群酯、利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班，活性代谢物为达比加群。该方法的专属性、精密度、准确度、线性和稳定性等均符合生物样品的分析要求，灵敏度较高，可以用于临床达比加群酯、达比加群、利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班的治疗药物监测。

权利要求

1.一种同时测定血浆中抗凝药物及活性代谢物浓度的方法，其特征在于，所述抗凝药物分别为达比加群酯、利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班，所述活性代谢物为达比加群；采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过前处理的血浆中的抗凝药物及活性代谢物，通过超高效液相色谱将待测物与血浆基质分离，然后串联质谱进行同位素内标定量，以标准品峰面积与相应内标峰面积之比为Y轴，标准品浓度为X轴，绘制标准曲线，计算血浆中抗凝药物和活性代谢物的含量；

色谱条件如下：

固定相：色谱柱型号Agilent ZORBAX Eclipse XDB‑C18，3.5μm，2.1×100mm；

流动相：A相：0.01～0.2％的甲酸水溶液，B相：0.01～0.2％的甲酸乙腈溶液；采用流动相A和流动相B不同体积混合，进行梯度洗脱；

质谱条件如下：

在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测，正离子模式；毛细管电压4500V；离子源温度550℃；第一离子源气体，55psi；第二离子源气体，55psi；气帘气，35psi；

所述经过前处理的血浆按照以下方法制备：取血浆样品，向其中加入甲醇和混合内标工作液，涡旋后离心取上清液，氮吹至干燥，将干燥样品溶于0.001～1％甲酸甲醇溶液，离心，取上清液与纯水混合；

该方法的定量下限为0.1ng/mL‑0.5ng/mL；

所述梯度洗脱过程如下：

在0～1分钟中，流动相A和流动相B的体积比保持95:5不变；1～4分钟中，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至20:80；在4‑4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由

20:80匀速渐变至5:95；在4.5‑6分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持5:95不变；在6‑

6.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由5:95匀速渐变至95:5；在6.1‑8分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持95:5不变；每个样品采集时间为8分钟。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，色谱条件还包括：柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样量：2μL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经过前处理的血浆按照以下方法制‑1备：取血浆样品100μL于1.5mL离心管中，向其中加入890μL冰冷甲醇和1μg·mL 所述混合内标工作液10μL，涡旋后离心取上清液，氮吹至干燥，向干燥样品中加入100μL含0.001～1％甲酸甲醇溶液并超声复溶，离心取上清50μL，加入450μL纯水混匀，待进样分析。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合内标工作液中包含同位素内标物利伐沙班‑氘4和达比加群‑氘3。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利伐沙班‑氘4为利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班相对应的内标；所述达比加群‑氘3为达比加群和达比加群酯相对应的内标。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述混合内标工作液按照以下方法制备：精密称取内标达比加群‑氘3和利伐沙班‑氘4分别约1mg，用DMSO溶解，得浓度分别为‑1

1mg·mL 的内标贮备液，将一定体积的两种内标贮备液用适量甲醇稀释混合，得浓度为10μ‑1 ‑1g·mL 的混合内标溶液，取100μL的10μg·mL 混合内标溶液，加入900μL甲醇溶液，混合均‑1匀得1μg·mL 混合内标工作液，置于‑20℃冰箱中贮存。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准品按照以下方法制备：取达比加群酯、利伐沙班、依度沙班、阿哌沙班和达比加群贮备液一定量，用甲醇稀释成为适当浓度的工作液，取100μL此工作液，加入900μL空白血浆，制成含达比加群酯、利伐沙班、依度沙‑1班、阿哌沙班和达比加群浓度分别为0.1，0.5，1，2，5，10，50，100，200，500ng·mL 的所述标准品。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述空白血浆为不含抗凝药物及活性代谢物的空白血浆。

说明书

一种同时测定血浆中抗凝药物及活性代谢物浓度的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及血浆药物浓度检测技术领域，尤其涉及一种同时测定血浆中抗凝药物和活性代谢物浓度的方法。

背景技术

[0002] 达比加群(如图1.1中)是一种强极性的两性化合物，不溶于有机溶剂，达比加群酯(如图1.2中)是前药，在体内被转化为达比加群而发挥抗凝作用。达比加群酯是一种人工合成的新型口服抗凝抑制剂，它能可逆地竞争性抑制凝血酶活性，属于非肽类凝血酶抑制剂。其口服后通过消化道迅速吸收，在血浆和肝脏内通过酯酶水解可以产生活性代谢产物达比加群，通过抑制凝血酶发挥抗凝活性。利伐沙班(如图1.3中)和阿哌沙班(如图1.4中)均属于选择性Ⅹa因子抑制剂，它不需要抗凝血酶Ⅲ参与，可直接拮抗游离和结合的Ⅹa因子，临床用于择期髋关节或膝关节置换术的成年患者，以预防静脉血栓形成。依度沙班(如图1.5中)是达比加群、利伐沙班和阿哌沙班之后，第4个获得美国FDA批准的新型的口服抗凝药，是一种Ⅹa因子抑制剂，具有高度选择性，可直接抑制FXa，其结果可延长凝血酶原时间(prothrombin time，PT)和活化部分凝血活酶时间(Activated partial thrombophastin time，APTT)，最终抑制血栓形成。

[0003] 专利CN111812219A提供了一种检测血浆中抗凝血药物浓度的方法，其中提供了检测达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的检测方法，但是其没有公开同时检测达比加群酯、利伐沙班、依度沙班、阿哌沙班和达比加群的方法。此外，该专利中定量下限为1ng/mL，灵敏度低。

[0004] 因此，提供一种灵敏度高，且可以同时检测血浆中达比加群酯、利伐沙班、依度沙班、阿哌沙班和达比加群的方法，是一个重要的研究方向，有助于临床上对此类药物进行监测。

发明内容

[0005] 本发明为实现上述目的，提供了一种超高效液相色谱串联质谱法同时测定血浆中四种抗凝药物及一种活性代谢物的浓度的方法。

[0006] 一种同时测定血浆中抗凝药物及活性代谢物浓度的方法，所述抗凝药物分别为达比加群酯、利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班，所述活性代谢物为达比加群；采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过前处理的血浆中的抗凝药物及活性代谢物，通过超高效液相色谱将待测物与血浆基质分离，然后串联质谱进行同位素内标定量，以标准品峰面积与相应内标峰面积之比为Y轴，标准品浓度为X轴，绘制标准曲线，计算血浆中抗凝药物和活性代谢物的含量；

[0007] 色谱条件如下

[0008] 固定相：色谱柱型号Agilent ZORBAX Eclipse XDB‑C18(3.5μm,2.1×100mm)；

[0009] 流动相：A相：0.01‑0.2％的甲酸水溶液，B相：0.01‑0.2％的甲酸乙腈溶液；采用流动相A和流动相B不同体积混合，进行梯度洗脱；

[0010] 质谱条件如下：

[0011] 在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测，正离子模式；毛细管电压4500V；离子源温度550℃；第一离子源气体，55psi；第二离子源气体，55psi；气帘气，35psi。

[0012] 优选地，流动相：A相：0.1％的甲酸水溶液，B相：0.1％的甲酸乙腈溶液；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样量：2μL。

[0013] 优选地，所述梯度洗脱过程如下：在0～1分钟中，流动相A和流动相B的体积比保持95:5不变；1～4分钟中，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至20:80；在4‑4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由20:80匀速渐变至5:95；在4.5‑6分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持5:95不变；在6‑6.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由5:95匀速渐变至95:5；在6.1‑8分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持95:5不变。每个样品采集时间为8分钟。

[0014] 优选地，所述经过前处理的血浆按照以下方法制备：

[0015] 取血浆样品，向其中加入甲醇和混合内标工作液，涡旋后离心取上清液，氮吹至干燥，将干燥样品溶于0.001～1％甲酸甲醇溶液，离心，取上清液与纯水混合。

[0016] 优选地，所述经过前处理的血浆按照以下方法制备：取血浆样品100μL于1.5mL离‑1心管中，向其中加入890μL冰冷甲醇和1μg·mL 所述混合内标工作液10μL，涡旋后离心取上清液，氮吹至干燥，向干燥样品中加入100μL含0.001～1％甲酸甲醇溶液并超声复溶，离心取上清50μL，加入450μL纯水混匀，待进样分析。

[0017] 优选地，所述混合内标工作液中包含同位素内标物利伐沙班‑氘4和达比加群‑氘3，所述利伐沙班‑氘4为利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班相对应的内标；所述达比加群‑氘3为达比加群和达比加群酯相对应的内标。

[0018] 优选地，所述混合内标工作液按照以下方法制备：

[0019] 精密称取内标达比加群‑氘3和利伐沙班‑氘4分别约1mg，用DMSO溶解，得浓度分别‑1为1mg·mL 的内标贮备液，将一定体积的两种内标贮备液用适量甲醇稀释混合，得浓度为‑1 ‑1
10μg·mL 的混合内标溶液，取100μL的10μg·mL 混合内标溶液，加入900μL甲醇溶液，混‑1
合均匀得1μg·mL 混合内标工作液，置于‑20℃冰箱中贮存。

[0020] 优选地，所述标准品按照以下方法制备：取达比加群酯、利伐沙班、依度沙班、阿哌沙班和达比加群贮备液一定量，用甲醇稀释成为适当浓度的工作液，取100μL此工作液，加入900μL空白血浆，制成含达比加群酯、利伐沙班、依度沙班、阿哌沙班和达比加群浓度分别‑1为0.1，0.5，1，2，5，10，50，100，200，500ng·mL 的所述标准品。

[0021] 优选地，所述空白血浆为不含抗凝药物及活性代谢物的空白血浆。

[0022] 与现有技术相比，本发明存在以下技术效果：

[0023] 采用本发明提供的检测方法可以同时检测血浆中达比加群酯、利伐沙班、依度沙班、阿哌沙班和达比加群，此外本发明的定量下限可以达到0.1‑0.5ng/mL，灵敏度高。

[0024] 针对四种抗凝药物及一种活性代谢物的线性范围为0.1～500ng·mL‑1，相关系数(r)均大于0.997，三个质控浓度下回收率分别为97.0‑103％，99.4‑112％，93.9‑106％，RSD％小于14.9％，批内和批间准确度偏差＜15％，精密度RSD＜15％。样品在4℃放置24小时，‑80℃放置90天，以及反复冻融3次均保持稳定。因此，本方法的专属性、精密度、准确度、线性和稳定性等均符合生物样品的分析要求，灵敏度较高，可以用于临床达比加群酯，达比加群，利伐沙班，依度沙班和阿哌沙班的治疗药物监测。

附图说明

[0025] 图1.1为达比加群(Dabigatran)的分子结构式(C25H25N7O3)；

[0026] 图1.2为达比加群酯(Dabigatran etexilate)的分子结构式(C34H41N7O5)；

[0027] 图1.3利伐沙班(Rivaroxaban)的分子结构式(C19H18N3O5SCl)；

[0028] 图1.4为阿哌沙班(Apixaban)的分子结构式(C25H25N5O4)；

[0029] 图1.5为依度沙班(Edoxaban)的分子结构式(C24H30ClN7O4S)；

[0030] 图2.1为达比加群酯在人血浆中的标准曲线；

[0031] 图2.2为达比加群在人血浆中的标准曲线；

[0032] 图2.3为依度沙班在人血浆中的标准曲线；

[0033] 图2.4为利伐沙班在人血浆中的标准曲线；

[0034] 图2.5为阿哌沙班在人血浆中的标准曲线；

[0035] 图3.1为受试者血浆中利伐沙班的色谱图；

[0036] 图3.2为受试者血浆中达比加群酯的色谱图；

[0037] 图3.3为受试者血浆中达比加群的色谱图；

[0038] 图4.1为空白血浆和加入达比加群酯(100ng/mL)对照品的色谱图；

[0039] 图4.2为空白血浆和加入达比加群(100ng/mL)对照品的色谱图；

[0040] 图4.3为空白血浆和加入依度沙班(100ng/mL)对照品的色谱图；

[0041] 图4.4为空白血浆和加入利伐沙班(100ng/mL)对照品的色谱图；

[0042] 图4.5为空白血浆和加入阿哌沙班(100ng/mL)对照品的色谱图。

具体实施方式

[0043] 下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

[0044] 本发明具体实施方式中采用以下仪器和化学品：

[0045] 仪器

[0046] Agilent UPLC系统，SCIEX Q‑trap 6500质谱系统，Analyst色谱工作站(Version 1.7.1)，Agilent ZORBAX Eclipse XDB‑C18(3.5μm,2.1×100mm)色谱柱；

[0047] 低温高速冷冻离心机；

[0048] 氮吹仪；

[0049] 漩涡混合器；

[0050] 分析天平；

[0051] 冷柜，Thermo Fisher；

[0052] Millipore超纯水装置Direct Q,Millipore Ltd,Molsheim,France

[0053] 化学品

[0054] 甲醇、乙腈、达比加群酯、达比加群、利伐沙班、依度沙班、阿哌沙班、达比加群‑氘3、利伐沙班‑氘4、甲酸。

[0055] 【实施例1】

[0056] 本实施例提供了对照品溶液、混合内标工作液、标准曲线和质控血浆样本的配制方法：

[0057] 一、对照品溶液配制：

[0058] 分别精密称取达比加群酯、达比加群、利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班对照品适‑1量，用甲醇溶解并定容，得浓度分别为1mg·mL 的达比加群酯、达比加群、依度沙班和阿哌‑1
沙班贮备液，以及浓度为0.75mg·mL 的利伐沙班贮备液，如表1中，置于‑20℃冰箱中贮存。
将达比加群酯，达比加群，利伐沙班，阿哌沙班和依度沙班贮备液以甲醇水溶液配制成包含有5000ng/mL达比加群酯，达比加群，利伐沙班，阿哌沙班和依度沙班的对照品溶液。

[0059] 表1：贮备液配制

[0060]

[0061]

[0062] 二、利伐沙班‑氘4和达比加群‑氘3混合内标工作液配制：

[0063] 精密称取内标利伐沙班‑氘4和达比加群‑氘3分别约1mg，用DMSO溶解，得浓度分别‑1为1mg·mL 的内标贮备液，将一定体积的两种内标贮备液用适量甲醇稀释混合，得浓度为‑1 ‑1
10μg·mL 的混合内标溶液。取100μL的10μg·mL 混合内标溶液，加入900μL甲醇溶液，混‑1
合均匀得1μg·mL 混合内标工作液，置于‑20℃冰箱中贮存。

[0064] 三、标准曲线血浆样本配制：

[0065] 取达比加群酯、达比加群、利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班贮备液一定量，用甲醇稀释成为适当浓度的系列工作液，取100μL此工作液，加入900μL空白血浆，制成含达比加群酯、达比加群、利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班浓度分别为0.1，0.5，1，2，5，10，50，100，200，‑1500ng·mL 的系列标准血样。

[0066] 标准曲线血浆样本的一种具体的制备方法：

[0067] 取五种一定量贮备液以甲醇稀释得到200μg/mL的混合贮备液SW。取SW100μL、甲醇900μL稀释成20μg/mL得到工作液SW0，置于‑20℃冰箱中贮存，将SW0稀释四倍，获得5μg/mL的工作液S1，接着以甲醇梯度稀释，获得工作液S2‑S9。如表2中，取100μL相应的工作液，加入900μL空白血浆，制成含达比加群酯、达比加群、利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班浓度分别‑1
为0.1，0.5，1，2，5，10，50，100，200，500ng·mL 的系列标准血样。

[0068] 表2：标准曲线血浆样本的配制方法

[0069]

[0070] 四、质控血浆样本配制：

[0071] 取达比加群酯、达比加群、利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班贮备液一定量，用甲醇稀释成为适当浓度的系列工作液，取100μL此工作液，加入900μL空白血浆，分别制成含达比‑1加群酯、达比加群、利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班浓度为4，40，400ng·mL 的低、中、高质控血浆样本，如表3中。(同标准曲线血浆样本配制)

[0072] 表3：质控血浆样本的配制方法

[0073]

[0074] 【实施例2】

[0075] 本实施例提供了采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过前处理的血浆中的抗凝血药物达比加群酯、利伐沙班、依度沙班、阿哌沙班和活性代谢物达比加群的方法，具体包括以下步骤：

[0076] 步骤1、血浆样品和标准曲线血浆样本前处理

[0077] 血浆样品前处理：

[0078] 取血浆样品100μL于1.5mL离心管中，向其中加入890μL冰冷甲醇和1μg·mL‑1混合内标溶液10μL，涡旋后离心(13000g，4℃，10min)，取上清液，氮吹至干燥，向干燥样品中加入100μL含1％甲酸甲醇溶液并超声复溶，离心(13000g，4℃，10min)，取上清50μL，加入450μL纯水混匀，待进样分析。

[0079] 标准曲线血浆样本前处理：

[0080] 分别取各浓度标准曲线血浆样本100μL于1.5mL离心管中，向其中加入890μL冰冷‑1甲醇和1μg·mL 混合内标溶液10μL，涡旋后离心(13000g，4℃，10min)，取上清液，氮吹至干燥，向干燥样品中加入100μL含1％甲酸甲醇溶液并超声复溶，离心(13000g，4℃，10min)，取上清50μL，加入450μL纯水混匀，待进样分析。

[0081] 步骤2、超高效液相色谱将待测物与血浆基质分离，然后串联质谱进行同位素内标定量

[0082] 色谱条件如下：

[0083] 固定相：(色谱柱型号)Agilent ZORBAX Eclipse XDB‑C18(3.5μm,2.1×100mm)；

[0084] 柱温：40℃；

[0085] 流动相：A相：0.1％的甲酸水溶液；B相：0.1％的甲酸乙腈溶液。

[0086] 流速：0.3mL/min

[0087] 进样量：2μL

[0088] 采用流动相A和流动相B不同体积混合，进行梯度洗脱，梯度条件如下表4。每个样品采集时间为8分钟。

[0089] 表4梯度条件

[0090] 时间(min) B.conc.(％) A.conc.(％)0 5 95
1 5 95
4 80 20
4.5 95 5
6 95 5
6.1 5 95
8 5 95

[0091] 质谱条件如下：

[0092] 在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测MRM，正离子模式；毛细管电压4500V；离子源温度550℃；第一离子源气体，55psi；第二离子源气体，55psi；气帘气，35psi。分析物的质量跃迁、碰撞能量(CE)和去簇电压(DP)见如表5。

[0093] 表5五种抗凝药以及两种内标的MRM跃迁和质谱参数

[0094]

[0095]

[0096] 步骤3、以标准品峰面积与相应内标峰面积之比为Y轴，标准品浓度为X轴，绘制标准曲线，如图2.1‑2.5所示，计算血浆中抗凝药物的含量(标准品为各浓度的标准曲线血浆样本)，其中利伐沙班‑氘4为利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班相对应的内标；所述达比加群‑氘3为达比加群和达比加群酯相对应的内标。

[0097] 【实施例3】

[0098] 采用服用抗凝药的受试者提供的血浆样本，采用实施例2中的方法进行抗凝药物浓度分析，结果如图3.1‑3.3中所示，测定一例血浆样本中存在利伐沙班，另一例血浆样本中存在达比加群酯及其代谢产物达比加群，进一步确定利伐沙班、达比加群酯及其代谢产‑1 ‑1 ‑1物达比加群的浓度分别为263.7ng·L 、4.4ng·L 和224.0ng·L 。

[0099] 【试验验证】

[0100] 一、线性

[0101] 以药物与内标的峰面积比值(Y)对浓度(X,ng/mL)作加权线性回归。其中，权重系数选择1/X，回归方程的相关系数r均大于0.997，参见表6所示，线性良好，满足定量要求。

[0102] 表6五种抗凝药的线性范围，线性系数，线性方程以及检测限

[0103]分析物 线性范围 线性系数r 线性方程
达比加群酯 1‑500 0.99946 y＝0.00360x‑0.00355
达比加群 0.1‑500 0.99704 y＝0.008361x+0.000758087
依度沙班 0.5‑500 0.99758 y＝0.00314x‑0.00315
利伐沙班 0.5‑500 0.99975 y＝0.00991x‑0.01114
阿哌沙班 0.5‑500 0.99951 y＝0.002518x+0.08227

[0104] 二、专属性

[0105] 取空白血浆(不含任何标准品和内标)100μL按照实施例2中血浆样品前处理和测定的方法进行前处理后测定，将空白血浆的色谱图与分别含有100ng/mL达比加群酯、达比加群、依度沙班、利伐沙班和阿哌沙班的空白血浆进行对比，参见图4.1‑4.5，确认空白血浆中无内源性杂质的干扰。

[0106] 三、准确度和精密度。

[0107] 按质控血浆样品制备方法配制5批次质控血浆样品，分别取低、中、高质控血浆样本100μL于1.5mL离心管中，按照实施例2中血浆样品前处理和测定的方法对质控血浆样本进行前处理后测定，结果计算平均值、标准差和相对标准差。

[0108] 结果显示：三种浓度下含达比加群酯、达比加群、利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班的质控样品准确度偏差＜15％，批内批间精密度RSD<15％，见表7。结果表明：该方法的精密度和准确度良好，符合分析要求。

[0109] 表7五种抗凝药的批内和批间准确度和精密度

[0110]

[0111] 四、提取回收率

[0112] 分别取低(LQC)、中(MQC)、高(HQC)质控血浆样本，按照实施例2中血浆样品前处理和测定的方法进行前处理后测定，另取相应浓度的混合标准工作溶液进样测定。以血样处理后的药物峰面积除以相应浓度对照品溶液进样的药物峰面积计算提取回收率。参见下表8所示，达比加群酯、达比加群、利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班各浓度的质控血浆样本的平均提取回收率在93.9‑112％，RSD％＜14.9％。

[0113] 结果表明：该方法的提取回收率符合一般分析样品的要求。

[0114] 表8五种抗凝药的回收率(n＝5)

[0115]

[0116] 五、稳定性

[0117] (1)短期稳定性实验

[0118] 取质控血浆样本4℃放置，按照实施例2中血浆样品前处理和测定的方法对质控血浆样本进行前处理后测定，各浓度的血浆标样在自动进样器中放置24小时后测定与即时测定的结果相比，偏差＜9.2％，见下表9。

[0119] 结果表明：含达比加群酯、达比加群、利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班的血浆样本经过前处理后在4℃中放置24小时保持稳定。

[0120] (2)长期稳定性实验

[0121] 取质控血浆样本，按照实施例2中血浆样品前处理和测定的方法对质控血浆样本进行前处理后测定，各浓度的血浆标样在‑80℃中放置90天后测定与即时测定的结果相比，偏差<8.12％，见表9。

[0122] 结果表明：含达比加群酯、达比加群、利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班的血浆样本在‑80℃中内储存90天保持稳定。

[0123] (3)冻融实验

[0124] 取质控血浆样本，即时测定，于‑80℃放置，24小时后常温下使其融化，该过程重复3次，与即时测定结果相比较。结果显示偏差<9.3％，见表9。

[0125] 结果表明：含达比加群酯、达比加群、利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班的血浆样本反复冻融3次保持稳定。

[0126] (4)基质效应

[0127] 取质控血浆样本和相应浓度的标准品，同时进行前处理后测定。结果显示基质效应<12％。见表9。

[0128] 结果表明：含达比加群酯、达比加群、利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班的血浆样本基质效应较小。

[0129] 表9五种新型口服抗凝药的稳定性和基质效应

[0130]

[0131] 综上所述，本发明提供了采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过前处理的血浆中的抗凝血药物达比加群酯、利伐沙班、依度沙班、阿哌沙班和活性代谢物达比加群的方法，其专属性、精密度、准确度、线性和稳定性等均符合生物样品的分析要求，灵敏度较高，可以用于临床达比加群酯、达比加群、利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班的治疗药物监测。

[0132] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。