硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针及其制备方法和在食品检测中的应用转让专利
申请号 : CN202110611402.5
文献号 : CN113045497B
文献日 : 2021-09-28
发明人 : 张军民 , 刘宇宁 , 赵青余 , 冯潇慧 , 余雅男 , 汤超华
申请人 : 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
摘要 :
本发明公开了硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针及其制备方法和在食品检测中的应用。本发明提供的硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针化合物的结构式为式I所示。本发明进一步提供了制备所述荧光探针化合物的方法，其制备方法简单，容易大量获取。本发明的硒醇反应型荧光探针化合物可以选择性检测硒醇，且在检测过程中不会受共存基质的干扰。运用该荧光探针测定硒醇，硒醇的检出限为7.2nM（3σ/k），可以实现硒醇的定性定量检测，该方法操作简单、准确度高、灵敏度高、选择性好，硫醇类化合物对荧光探针测定硒醇的体系无干扰，可用于食品样品中硒醇的定性或定量检测。
权利要求 :
1.一种硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针化合物，其特征在于，其结构式为式I所示：
2.一种权利要求1所述的硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针化合物的制备方法，其特征在于，包括：
(1)将式II所示的4‑溴‑1,8‑萘二甲酸酐溶于冰乙酸中，加入对氨基苯酚进行反应得到式III所示的化合物；
(2)将式III所示的化合物溶于二甲亚砜中加入4‑(2‑氨基乙基)吗啉进行反应得到式IV所示的化合物；
(3)将式IV所示的化合物溶于二氯甲烷中后加入三乙胺及2,4‑二硝基氟苯进行反应得到式I所述的硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针化合物；
3.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，按摩尔比计，4‑溴‑1,8‑萘二甲酸酐与对氨基苯酚的比例为1:1.05～1.2；步骤(1)中所述的反应在以下条件下进行：在磁力搅拌下，在100‑140℃的温度下回流反应5‑12小时。
4.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的反应在以下条件下进行：在磁力搅拌下，120℃回流反应8小时。
5.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，按摩尔比，式III所示的化合物与4‑(2‑氨基乙基)吗啉的比例为1:5～10；步骤(2)所述的反应在以下条件下进行：在磁力搅拌下80‑100℃反应5‑12小时。
6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于；步骤(2)所述的反应在以下条件下进行：在磁力搅拌下90℃反应8小时。
7.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，按摩尔比，式IV所示的化合物与2,4‑二硝基氟苯的比例为1:1.2～1.5，式IV所示的化合物与三乙胺的比例为1:2.5～5。
8.一种定性或定量检测样品中硒醇类物质的检测试剂盒，其特征在于，包括：权利要求
1所述的硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针化合物，Tris‑HCl缓冲溶液；其中，Tris‑HCl缓冲溶液的pH值为5.5‑7。
9.权利要求1所述的硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针化合物在定性或定量检测食品样品硒醇基团中的应用。
10.按照权利要求9所述的应用，其特征在于，包括：将权利要求1所述的硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针化合物与待检测的含硒醇类物质的样品溶液进行混合，在pH＝5.5‑7下定容，常温静止反应，用荧光分光光度计在波长550nm处检测反应体系的荧光强度，根据公式F＝678.17[Sec]+17349，计算待测样品溶液中硒醇的浓度；其中，F为反应体系在550nm处的荧光强度，[Sec]是反应体系中硒醇的浓度，单位为μmol/L。
说明书 :
硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针及其制备方法和在食品检测中
的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及萘酰亚胺荧光探针，尤其涉及检测硒醇类物质的反应型萘酰亚胺荧光探针及其制备方法和在食品检测中的应用，属于萘酰亚胺荧光探针及食品检测应用领域。
背景技术
[0002] 硒蛋白及硒代半胱氨酸等小分子均含有硒醇基团，是动物组织和体液中的重要组成部分，参与很多细胞的生理功能，对于维持蛋白质的氧化还原环境起着重要的作用，如调
节信号通路，对不同疾病如癌症、糖尿病及神经退行性疾病的响应情况。这些物质中的硒醇
基团很容易被活性氧、活性氮氧化，是非常活泼的基团。生物体内含有硒醇基团的化合物对
于氧化还原平衡起着关键的作用，如具有一定的抗氧化作用，结合金属离子，能保护细胞，
防止被氧化，因此，对活细胞及组织中含有硒醇基团的化合物检测具有重要的生物学及医
学意义。
节信号通路，对不同疾病如癌症、糖尿病及神经退行性疾病的响应情况。这些物质中的硒醇
基团很容易被活性氧、活性氮氧化，是非常活泼的基团。生物体内含有硒醇基团的化合物对
于氧化还原平衡起着关键的作用，如具有一定的抗氧化作用，结合金属离子，能保护细胞，
防止被氧化，因此，对活细胞及组织中含有硒醇基团的化合物检测具有重要的生物学及医
学意义。
[0003] 萘酰亚胺类化合物因其荧光强、耐高温、稳定的特点，被广泛用作荧光染料。其衍生物中有多数都具有非常高的荧光量子产率、具有较大的共轭系统、良好的刚性共平面性、
荧光发射波长适中、斯托克斯(Stocks)位移大、光稳定性好、易修饰、优良的DNA嵌入性能等
诸多性能，在其共轭系统的两端引入了强烈的吸电性基团可形成推拉电子共轭体系，故能
发射很强的荧光。萘酰亚胺大量应用于荧光分子探针的信号基团，广泛用于荧光染料、颜
料、激光燃料、有机半导体材料、荧光探针等。
荧光发射波长适中、斯托克斯(Stocks)位移大、光稳定性好、易修饰、优良的DNA嵌入性能等
诸多性能，在其共轭系统的两端引入了强烈的吸电性基团可形成推拉电子共轭体系，故能
发射很强的荧光。萘酰亚胺大量应用于荧光分子探针的信号基团，广泛用于荧光染料、颜
料、激光燃料、有机半导体材料、荧光探针等。
[0004] 荧光检测技术方法简单并应用于许多领域，因其无创性，高灵敏度，高选择性，可操作性，低成本，快速响应，高时间分辨率和适当的有益特征而易于信号检测，已成为化学
和生化研究中的重要工具。研究快速灵敏检测硒醇类化合物的方法,提供简单、快速、灵敏、
廉价的分析测定方法，具有迫切的现实意义。
和生化研究中的重要工具。研究快速灵敏检测硒醇类化合物的方法,提供简单、快速、灵敏、
廉价的分析测定方法，具有迫切的现实意义。
发明内容
[0005] 本发明的目的之一是提供硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针。
[0006] 本发明的目的之二是提供该硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针的制备方法。
[0007] 本发明的目的之三是将所述的硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针应用于定性或定量检测样品中硒醇，尤其是应用于食品样品中硒醇的定性或定量检测。
[0008] 为实现以上目的，本发明采用了的技术方案包括：
[0009] 一种硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针化合物Nap‑DNB，其结构式为式I所示：
[0010]
[0011] 本发明还提供一种式I所示的荧光探针化合物的制备方法，包括：
[0012] (1)将式II所示的4‑溴‑1,8‑萘二甲酸酐溶于冰乙酸中，加入对氨基苯酚进行反应得到式III所示的化合物；
[0013]
[0014] (2)将式III所示的化合物溶于二甲亚砜中加入4‑(2‑氨基乙基)吗啉进行反应得到式IV所示的化合物；
[0015]
[0016] (3)将式IV所示的化合物溶于二氯甲烷中后加入三乙胺及2,4‑二硝基氟苯进行反应得到式I所述的反应型萘酰亚胺荧光探针化合物：
[0017]
[0018] 作为一种优选的具体实施方式，步骤(1)中，按摩尔比计，4‑溴‑1,8‑萘二甲酸酐与对氨基苯酚的比例优选为1:1.05～1.2；步骤(1)中所述的反应优选在以下条件下进行：在
磁力搅拌下，100‑140℃回流反应5‑12小时；更优选的，在磁力搅拌下，120℃回流反应8小
时。
磁力搅拌下，100‑140℃回流反应5‑12小时；更优选的，在磁力搅拌下，120℃回流反应8小
时。
[0019] 作为一种优选的具体实施方式，步骤(2)中，按摩尔比，式III所示的化合物与4‑(2‑氨基乙基)吗啉的比例优选为1:5～10；步骤(2)所述的反应优选在以下条件下进行：在
磁力搅拌下80‑100℃反应5‑12小时；更优选的，在磁力搅拌下90℃反应8小时。
磁力搅拌下80‑100℃反应5‑12小时；更优选的，在磁力搅拌下90℃反应8小时。
[0020] 作为一种优选的具体实施方式，步骤(3)中，按摩尔比，式IV所示的化合物与2,4‑二硝基氟苯的比例优选为1:1.2～1.5，式IV所示的化合物与三乙胺的比例为1:2.5～5。
[0021] 采用本发明提供的式I所示的荧光探针化合物Nap‑DNB可以通过硒醇裂解化合物上的苯氧醚键，使酚羟基暴露，从而使萘酰亚胺荧光团的荧光恢复，通过在550nm下荧光信
号的强弱可以反映出硒醇的含量。因此，能够将本发明式I所示的荧光探针化合物Nap‑DNB
应用于含有硒醇基团的化合物的定性或定量检测。
号的强弱可以反映出硒醇的含量。因此，能够将本发明式I所示的荧光探针化合物Nap‑DNB
应用于含有硒醇基团的化合物的定性或定量检测。
[0022] 因此，本发明提供了将所述荧光探针化合物Nap‑DNB应用于检测硒醇类物质的检测，包括：将式I所示的荧光探针化合物Nap‑DNB与待检测的含硒醇类物质的溶液进行混合，
在pH＝6下定容，常温静止反应20‑30分钟，用荧光分光光度计在波长550nm处检测反应体系
的荧光强度，根据公式F＝678.17[Sec]+17349，计算待测样品溶液中硒醇的浓度，其中F为
反应体系在550nm处的荧光强度，[Sec]是反应体系中硒醇的浓度，单位μmol/L。
在pH＝6下定容，常温静止反应20‑30分钟，用荧光分光光度计在波长550nm处检测反应体系
的荧光强度，根据公式F＝678.17[Sec]+17349，计算待测样品溶液中硒醇的浓度，其中F为
反应体系在550nm处的荧光强度，[Sec]是反应体系中硒醇的浓度，单位μmol/L。
[0023] 更进一步的，本发明提供了一种定性或定量检测样品中硒醇类物质的检测试剂盒，包括：式I所示的荧光探针化合物Nap‑DNB，Tris‑HCl缓冲溶液；其中，Tris‑HCl缓冲溶液
的pH值为5.5‑7，优选为pH值为6。
的pH值为5.5‑7，优选为pH值为6。
[0024] 本发明的硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针化合物合成方法简单，容易大量获取；该荧光探针化合物含有4‑(2‑氨基乙基)吗啉基团，使该化合物适合在水溶液环境下对硒醇进
行检测；其检测基团上含有强吸电子基团(‑NO2)，在pH＝6时的Tris‑HCl缓冲溶液中，能与
硒醇发生亲核取代反应，使得萘酰亚胺的荧光恢复，使反应体系在波长550nm处有强的荧光
信号。实验结果表明，本发明的硒醇反应型荧光探针化合物可以选择性检测硒醇，且在检测
过程中不会受共存基质的干扰。运用该荧光探针测定硒醇，硒醇的检出限为7.2nM(3σ/k)，
可以实现硒醇的定性定量检测，该方法操作简单、准确度高、灵敏度高、选择性好，硫醇类化
合物对荧光探针测定硒醇的体系无干扰，可用于定性或定量检测食品样品中硒醇。
行检测；其检测基团上含有强吸电子基团(‑NO2)，在pH＝6时的Tris‑HCl缓冲溶液中，能与
硒醇发生亲核取代反应，使得萘酰亚胺的荧光恢复，使反应体系在波长550nm处有强的荧光
信号。实验结果表明，本发明的硒醇反应型荧光探针化合物可以选择性检测硒醇，且在检测
过程中不会受共存基质的干扰。运用该荧光探针测定硒醇，硒醇的检出限为7.2nM(3σ/k)，
可以实现硒醇的定性定量检测，该方法操作简单、准确度高、灵敏度高、选择性好，硫醇类化
合物对荧光探针测定硒醇的体系无干扰，可用于定性或定量检测食品样品中硒醇。
附图说明
[0025] 图1为本发明硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针化合物的结构式。
[0026] 图2为本发明硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针化合物的合成路线图。
[0027] 图3为本发明硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针化合物与式IV所示的化合物(10μM)在pH＝7.5的Tris‑HCl缓冲溶液中测得的激发波长(450nm)。
[0028] 图4为本发明硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针化合物与式IV所示的化合物(10μM)在不同pH的Tris‑HCl缓冲溶液中测得的荧光强度。
[0029] 图5为本发明硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针化合物(10μM)在不同pH的Tris‑HCl缓冲溶液中与硒代半胱氨酸(100μM)的反应速率。
[0030] 图6为本发明硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针化合物(10μM)与硒代半胱氨酸(0‑100μM)在pH＝6的Tris‑HCl缓冲溶液中测得的发射波长(550nm)。
[0031] 图7为本发明硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针化合物对硒代半胱氨酸检测的标准曲线。
[0032] 图8为本发明硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针化合物对硒蛋白，各类硫醇及干扰物响应的荧光比率值(1，Sec、2，TrxR+NADPH、3，TrxR、4，NADPH、5，DTT、6，GSH、7，Cys、8，Hcy、9，
2‑ + + 2+ 2+ 2+ 3+ 2+ 2+
Na2S、10，SO4 、11，Gly、12，K 、13，Na 、14，Ca 、15，Mg 、16，Cu 、17，Fe 、18，Zn 、19，Pd 、
2+ ‑ ‑ ‑ ‑
20，Cd 、21，Cl、22，NO3、23，维生素C、24，H2O2、25，ClO、26，OH，10μL，10mM)。
2‑ + + 2+ 2+ 2+ 3+ 2+ 2+
Na2S、10，SO4 、11，Gly、12，K 、13，Na 、14，Ca 、15，Mg 、16，Cu 、17，Fe 、18，Zn 、19，Pd 、
2+ ‑ ‑ ‑ ‑
20，Cd 、21，Cl、22，NO3、23，维生素C、24，H2O2、25，ClO、26，OH，10μL，10mM)。
具体实施方式
[0033] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域
技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和
形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和
形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0034] 实施例1硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针化合物的合成及表征
[0035] 荧光探针化合物的合成路线如图2所示，步骤包括：
[0036] 在氮气保护下，在无水乙酸(50mL)中将式II的4‑溴‑1，8‑萘酐(2.77g，10mM)和对氨基苯酚(1.15g，10.5mM)的混合物搅拌并回流8小时。自然冷却后，收集滤饼，并用冰乙醇
洗涤，得到浅黄色固体为式III所示的中间化合物，其可以直接用于下一反应(3.26g，收率：
89％)；
洗涤，得到浅黄色固体为式III所示的中间化合物，其可以直接用于下一反应(3.26g，收率：
89％)；
[0037] 在氮气保护下，在干燥的DMSO(50mL)中将式III的化合物1(1.83g，5mM)和4‑(2‑氨基乙基)吗啉(6.5mL，50mM)的混合物在90℃下搅拌8小时。反应完成后，将混合物冷却至室
温并倒入冰水中。通过柱层析色谱法(二氯甲烷/甲醇＝10∶1，v/v，硅胶：200‑300目)分离纯
化，得到黄色化合物为式IV所示的中间化合物(1.46g，收率：70％)。
温并倒入冰水中。通过柱层析色谱法(二氯甲烷/甲醇＝10∶1，v/v，硅胶：200‑300目)分离纯
化，得到黄色化合物为式IV所示的中间化合物(1.46g，收率：70％)。
[0038] 在氮气保护下，在干燥的二氯甲烷(50mL)中，将式IV的化合物(0.834g，2mM)，2，4‑二硝基氟苯(0.465mg，2.5mM)和三乙胺(2.06ml，10mM)的混合物在50℃下搅拌并回流5个小
时，减压蒸发溶剂并将滤饼干燥，通过柱层析色谱法(二氯甲烷：丙酮＝5：1，V/V，硅胶：200‑
300目)分离纯化，得到黄色的式I所示的化合物Nap‑DNB(0.758g，收率：65％)。
时，减压蒸发溶剂并将滤饼干燥，通过柱层析色谱法(二氯甲烷：丙酮＝5：1，V/V，硅胶：200‑
300目)分离纯化，得到黄色的式I所示的化合物Nap‑DNB(0.758g，收率：65％)。
[0039] 1H NMR(500MHz,DMSO‑d6)δ8.89(d,J＝2.8Hz,1H),8.67(d,J＝8.5Hz,1H),8.53(dd,J＝9.3,2.9Hz,1H),8.42(d,J＝7.2Hz,1H),8.25(d,J＝8.4Hz,1H),7.70(t,J＝7.7Hz,
2H),7.49(d,J＝8.8Hz,2H),7.42–7.37(m,2H),7.27(d,J＝9.2Hz,1H),6.82(d,J＝8.7Hz,
1H),3.61(t,J＝4.6Hz,4H),3.54(q,J＝6.4Hz,2H),2.68(t,J＝6.8Hz,2H),2.51(s,5H).
2H),7.49(d,J＝8.8Hz,2H),7.42–7.37(m,2H),7.27(d,J＝9.2Hz,1H),6.82(d,J＝8.7Hz,
1H),3.61(t,J＝4.6Hz,4H),3.54(q,J＝6.4Hz,2H),2.68(t,J＝6.8Hz,2H),2.51(s,5H).
[0040] 13C NMR(126MHz,DMSO‑d6)δ164.42,163.53,155.10,153.58,151.12,142.01,140.00,134.75,134.64,132.10,131.26,130.31,130.23,129.13,124.80,122.67,122.36,
120.76,120.63,120.05,108.32,104.38,66.70,56.64,53.85,40.67.HRMS(ESI)m/z calcd
+
forC30H25N5O8([M+H]),584.1882,found 584.1892.
120.76,120.63,120.05,108.32,104.38,66.70,56.64,53.85,40.67.HRMS(ESI)m/z calcd
+
forC30H25N5O8([M+H]),584.1882,found 584.1892.
[0041] 试验例1应用荧光探针化合物检测硒醇的性能试验
[0042] 本发明所述的荧光探针化合物，可以在pH＝6的条件下检测硒醇，实现了在水溶液中检测硒醇，响应速度快，适合用于硒醇的快速检测。
[0043] 图5为本发明硒醇反应型萘酰亚胺荧光探针化合物(10μM)在不同pH的Tris‑HCl缓冲溶液中与硒代半胱氨酸(100μM)的反应速率。将本发明的荧光探针化合物与硒代半胱氨
酸进行反应时，550nm处荧光信号的强弱可以反映硒代半胱氨酸与荧光探针化合物反应的
速率。由于硒醇的活性极易受酸度的影响，虽然如图5所示本发明荧光探针化合物与硒代半
胱氨酸在pH5.5‑7的Tris‑HCl缓冲溶液中均可以反应，然而在pH＝6的条件下，反应的速度
是最合适的。
酸进行反应时，550nm处荧光信号的强弱可以反映硒代半胱氨酸与荧光探针化合物反应的
速率。由于硒醇的活性极易受酸度的影响，虽然如图5所示本发明荧光探针化合物与硒代半
胱氨酸在pH5.5‑7的Tris‑HCl缓冲溶液中均可以反应，然而在pH＝6的条件下，反应的速度
是最合适的。
[0044] 图8为本发明的荧光探针化合物(10μM)在pH＝6的Tris‑HCl缓冲溶液中测得的对硒蛋白，各类硫醇及干扰物响应的荧光比率值。由图8可知，加入荧光探针化合物与各类硒
2‑
醇，硫醇，阴离子，阳离子及ROS(TrxR+NADPH，TrxR，NADPH，DTT，GSH，Cys，Hcy，Na2S，SO4 ，
+ + 2+ 2+ 2+ 3+ 2+ 2+ 2+ ‑ ‑ ‑ ‑
Gly，K ，Na ，Ca ，Mg ，Cu ，Fe ，Zn ，Pd ，Cd ，Cl ，NO3 ，维生素C，H2O2，ClO ，OH ，10μL，
10mM)，除还原型和非还原型的硫氧还蛋白还原酶(TrxR，一种通过NADPH还原的硒蛋白)会
使荧光光谱产生发生明显变化，其他化合物包括各类硫醇，均不会使荧光光谱产生发生明
显变化。因此，本发明所述的硒醇反应型荧光探针化合物可以选择性检测硒醇，且在检测过
程中不会受共存基质的干扰。
2‑
醇，硫醇，阴离子，阳离子及ROS(TrxR+NADPH，TrxR，NADPH，DTT，GSH，Cys，Hcy，Na2S，SO4 ，
+ + 2+ 2+ 2+ 3+ 2+ 2+ 2+ ‑ ‑ ‑ ‑
Gly，K ，Na ，Ca ，Mg ，Cu ，Fe ，Zn ，Pd ，Cd ，Cl ，NO3 ，维生素C，H2O2，ClO ，OH ，10μL，
10mM)，除还原型和非还原型的硫氧还蛋白还原酶(TrxR，一种通过NADPH还原的硒蛋白)会
使荧光光谱产生发生明显变化，其他化合物包括各类硫醇，均不会使荧光光谱产生发生明
显变化。因此，本发明所述的硒醇反应型荧光探针化合物可以选择性检测硒醇，且在检测过
程中不会受共存基质的干扰。
[0045] 试验例2应用本发明荧光探针化合物检测滩羊样品中的硒醇含量
[0046] 滩羊血清，肝脏及背最长肌样品通过TCEP(0.5M，样品：TCEP＝10:1，V/V)还原30分钟并稀释五倍后(10μM)，加入本发明的荧光探针化合物Nap‑DNB(10μM)以及980μM Tris‑
HCl缓冲溶液(100mM，pH＝6)中，充分反应30分钟，测试荧光信号。通过探针和硒醇的的标准
曲线(譬如图7)得以实现硒醇的定性或定量检测。滩羊血清，肝脏及背最长肌的硒醇含量分
别为54.83±1.23μM，12.98±0.43μM及7.45±0.12μM。
HCl缓冲溶液(100mM，pH＝6)中，充分反应30分钟，测试荧光信号。通过探针和硒醇的的标准
曲线(譬如图7)得以实现硒醇的定性或定量检测。滩羊血清，肝脏及背最长肌的硒醇含量分
别为54.83±1.23μM，12.98±0.43μM及7.45±0.12μM。