硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA06.GTR2基因及其应用

摘要

本发明公开了硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA06.GTR2基因及其应用，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对异源四倍体甘蓝型油菜中硫苷转运基因BnGTR的多个拷贝进行编辑，获得了BnaA06.GTR2基因的纯合突变体，所述BnaA06.GTR2基因敲除突变体成熟种子中总硫苷含量极显著降低，证明BnaA06.GTR2基因是调控硫苷从合成部位转运到种子中的关键基因，能够用于油菜种子中硫苷性状的改良，为甘蓝型油菜种子低硫苷性状的改良开发提供了理论依据，为以低硫苷性状改良为目标的油菜育种工作提供了一种新的途径。

权利要求

1.一种基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体，所述基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体转入甘蓝型油菜能够获得种子中总硫苷含量降低的甘蓝型油菜材料，其特征在于，所述基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体对甘蓝型油菜BnaA06.GTR2基因进行定向编辑，所述BnaA06.GTR2基因的基因组区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；在甘蓝型油菜BnaA06.GTR2外显子区域选取以碱基NGG结尾的DNA片段作为靶位点；

所述靶位点的一条链具有5’‑(N)XNGG‑3’结构，其中(N)X中的X表示数目为X的一条碱基序列，(N)X中的N代表碱基A、G、C、T中的任意一种，X为19或20；所述靶位点序列如SEQ ID NO.5所示。

2.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株中转入了权利要求1所述的基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体。

3.权利要求1所述的基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体在降低油菜种子中总硫苷含量中的应用，其特征在于，将所述基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体转化微生物培养表达，转化目标植物，获得BnaA06.GTR2基因敲除突变体，所述转化方式为农杆菌介导、花粉管通道法、基因枪法、显微注射法中的任意一种。

4.一种降低油菜种子中总硫苷含量的方法，其特征在于，所述方法包括获得BnaA06.GTR2基因敲除突变体，所述BnaA06.GTR2基因的基因组区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述基因敲除突变体的获得方法为CRISPR/Cas9基因编辑系统；在甘蓝型油菜BnaA06.GTR2外显子区域选取以碱基NGG结尾的DNA片段作为靶位点；所述靶位点序列如SEQ ID NO.5所示。

说明书

硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA06.GTR2基因及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于油菜分子育种技术领域，尤其涉及硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA06.GTR2基因及其应用。

背景技术

[0002] 油菜(Brassica napus)是十字花科芸薹属植物中的一种重要的油料作物，是世界范围内广泛种植的主要油料作物，也是我国唯一的冬季油料作物。因此，国家把发展油菜生产作为保证食用油安全供应的重点，油菜的生产具有重要的现实意义。我国甘蓝型油菜由于具有抗病、产量高、适应性广、耐逆行性强等特点，成为主要栽培品种。油菜增产主要通过提高单位面积菜籽产量、提高菜籽含油量和扩大种植面积三种途径。油菜育种工作者现在的主要目标是努力提高含油量、产量和品质。

[0003] 硫代葡萄糖苷(硫苷)是一类含氮、硫的植物次生代谢产物。油菜菜籽榨油后的饼粕含丰富的蛋白质，是良好的天然动物饲料。然而硫苷在甘蓝型油菜籽粒中却是一种有害成分，含有高硫苷及其水解产物的油菜饼粕去饲养禽畜，会对禽畜造成毒害，所以油菜籽粒中硫苷含量的高低决定了油菜饼粕作为饲料的价值。

[0004] 一方面，降低油菜籽粒中硫苷含量是改良菜籽油品质的重要育种目标之一。另一方面，硫苷的水解产物在油菜营养体中却可以对油菜起保护作用。因此，低硫苷油菜自身的抗虫抗病性随着籽粒硫苷含量的下降也显著的降低，不利于双低油菜的推广和应用。通过遗传育种的方法，培育出高叶片硫苷但低籽粒硫苷含量的材料，具有重要的现实意义。

[0005] 植物中硫苷的合成与积累部位并不一致，硫苷首先在嫩叶中大量积累，随着叶片逐渐老化，其硫苷含量下降，种子中的硫苷开始积累。研究表明拟南芥GTR1和GTR2基因在介导硫苷的这种长距离运输过程中起着重要作用。在GTR1和GTR2双突变体中，种子中的硫苷几乎完全消失，而在叶片中积累10倍以上。因此，阻断硫苷从合成部位往种子中运输，对降低种子中硫苷含量、提高植物抗虫抗病性具有重要作用。Nour‑Eldin等成功将硫苷转运基因突变的gtr功能丧失表型从模式植物转移到芸苔属作物中，即通过对白菜中7个GTR同源基因中的一个(BrGTR2A2)和芥菜中12个GTR同源基因中的4个(Bj2A1/2A2/2B1/2B2)进行突变，分别使白菜和芥菜种子中的硫苷含量降低60‑70％，从而证明这种“转运工程(transport engineering)”方法可广泛应用于降低其他油料作物(如异源四倍体油菜)种子硫代葡萄糖苷含量。因此，鉴定油菜GTR同源基因中负责硫苷往种子中转运的关键转运子，对甘蓝型油菜种子硫苷含量性状进行进一步研究，提高菜籽油品质，培育出高叶片硫苷但低籽粒硫苷含量的材料，具有重要的现实意义，同时为揭示甘蓝型油菜中硫苷含量遗传机理和分子机制奠定基础。

发明内容

[0006] 针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA06.GTR2基因及其应用，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对异源四倍体甘蓝型油菜中硫苷转运基因BnGTR的多个拷贝进行编辑，获得了BnaA06.GTR2基因的纯合突变体，所述BnaA06.GTR2基因敲除突变体成熟种子中总硫苷含量极显著降低，证明BnaA06.GTR2基因是调控硫苷从合成部位转运到种子中的关键基因。

[0007] 本发明提供硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA06.GTR2基因，所述BnaA06.GTR2基因的基因组区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0008] 本发明提供硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA06.GTR2基因，所述BnaA06.GTR2基因的编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0009] 本发明还提供硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA06.GTR2蛋白，所述BnaA06.GTR2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述氨基酸序列由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码。

[0010] 本发明还提供硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA06.GTR2基因在油菜分子育种方面的应用，所述BnaA06.GTR2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0011] 本发明还提供硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA06.GTR2基因在油菜硫苷性状改良方面的应用，所述BnaA06.GTR2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0012] 本发明还提供一种基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体，所述基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体转入甘蓝型油菜能够获得种子中总硫苷含量显著降低的甘蓝型油菜材料，所述基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体对甘蓝型油菜BnaA06.GTR2基因进行定向编辑，在甘蓝型油菜BnaA06.GTR2外显子区域选取以碱基NGG结尾的DNA片段作为靶位点。

[0013] 进一步的，所述靶位点的一条链具有5’‑(N)XNGG‑3’结构，其中(N)X中的X表示数目为X的一条碱基序列，(N)X中的N代表碱基A、G、C、T中的任意一种，X为19或20；优选的，所述靶位点序列如SEQ ID NO.5所示。

[0014] 本发明还提供一种种子中总硫苷含量降低的甘蓝型油菜材料，所述甘蓝型油菜材料中转入了所述基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体。

[0015] 本发明还提供一种重组菌株，所述重组菌株中转入了所述的基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体。

[0016] 本发明还提供所述的基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体在降低油菜种子中总硫苷含量中的应用，将所述基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体转化微生物培养表达，转化目标植物，获得BnaA06.GTR2基因敲除突变体，所述转化方式为农杆菌介导、花粉管通道法、基因枪法、显微注射法中的任意一种。

[0017] 本发明还提供一种降低油菜种子中总硫苷含量的方法，所述方法包括获得BnaA06.GTR2基因敲除突变体，所述基因敲除突变体的获得方法为CRISPR/Cas9基因编辑系统、EMS诱变、同源重组、T‑DNA插入中的任意一种。

[0018] 综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

[0019] (1)本发明鉴定到甘蓝型油菜中一个重要硫苷转运基因BnaA06.GTR2，该基因对硫苷从合成部位往种子中运输起重要作用，为油菜种子低硫苷、叶片高硫苷的育种工作提供了一种全新的途径，具有广阔的应用前景。

[0020] (2)本发明鉴定了一个能改变甘蓝型油菜种子硫苷含量的关键转运子，并提供一个基于CRISPR/Cas9系统的靶位点，该靶位点可以定点编辑BnaA06.GTR2基因；通过CRISPR/Cas9系统获得甘蓝型油菜的种子低硫苷种质，为种子低硫苷的抗病种质的育种工作提供了一种全新的途径，具有广阔的应用前景。

[0021] (3)本发明利用基因编辑技术，将BnaA06.GTR2基因在甘蓝型油菜中特异敲除，经一系列实验证明，与受体甘蓝型油菜相比，BnaA06.GTR2敲除突变体的种子中硫苷的含量显著降低，证明BnaA06.GTR2对硫苷往种子中转运，影响硫苷在种子中积累起着重要作用，这一发现不仅丰富了对甘蓝型油菜硫苷转运机制的认识，而且为甘蓝型油菜种子低硫苷育种的培育提供了理论依据。

[0022] (4)本发明利用基因编辑技术，获得BnaA06.GTR2基因在甘蓝型油菜中特异敲除的突变体，为硫苷的理论研究和应用提供种质资源。

附图说明

[0023] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

[0024] 图1为BnaA06.GTR1a和BnaA06.GTR2基因结构及CRISPR/Cas9靶位点示意图；

[0025] 图2为CRISPR/Cas9重组载体示意图；

[0026] 图3为BnGTR2s‑Cas9转化植株T0代靶位点测序峰图及序列图；

[0027] 图4为BnaA06.GTR2 CRISPR编辑植株T2代纯合突变体营养期表型图；

[0028] 图5为BnaA06.GTR2 CRISPR编辑植株T2代纯合突变株系成熟种子总硫苷含量分析；

[0029] 图6为BnaA06.GTR2和BnaA09.GTR2c基因在中油821各组织中的表达水平。

具体实施方式

[0030] 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

[0031] 本发明的目的在于鉴定甘蓝型油菜中负责硫苷从合成部位向成熟种子中转运的关键硫苷转运基因，并通过基于CRISPR/Cas9的方法特异敲除甘蓝型油菜中关键硫苷转运基因获得甘蓝型油菜种子硫苷含量显著降低的油菜新种质。本发明通过对高硫苷品种中硫苷转运基因的多个拷贝实施CRISPR/Cas9基因编辑，并鉴定到BnaA06.GTR2(BnaA06G002659700ZY821)基因特异敲除的移码突变体，通过种子中硫苷含量分析证明BnaA06.GTR2基因突变阻断了甘蓝型油菜硫苷从合成部位向种子中的运输，从而降低种子中硫苷的含量，提高油菜品质。

[0032] 以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0033] 实施例1利用CRISPR/Cas9系统特异性敲除甘蓝型油菜BnGTR基因

[0034] (1)根据BnaA06.GTR1a、BnaA06.GTR2基因的编码区(CDS)设计了两个靶位点，gRNA1和gRNA2，在甘蓝型油菜BnaA06.GTR2外显子区域选取以碱基NGG结尾的DNA片段作为靶位点，靶位点的一条链具有5’‑(N)XNGG‑3’结构，其中(N)X中的X表示数目为X的一条碱基序列，(N)X中的N代表碱基A、G、C、T中的任意一种，X为19或20；本实施例中两个靶位点gRNA1和gRNA2的序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示，gRNA1靶向BnaA06.GTR1a基因的第四个外显子，gRNA2靶向BnaA06.GTR2基因的第三个外显子，如图1所示；

[0035] (2)根据靶位点序列设计合成四条单链oligo DNA引物序列，分别为BnGTR‑DT1‑F0、BnGTR‑DT1‑BsF、BnGTR‑DT2‑R0、BnGTR‑DT2‑BsR，其序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；

[0036] (3)以稀释100倍的pCBC‑DT1T2(中国农业大学陈其军老师提供)为模板进行四引物PCR扩增获得sgRNA表达盒，其中BnGTR‑DT1‑BsF/‑BsR为正常引物浓度(10μmol/L)；BnGTR‑DT1‑F0/‑R0稀释20倍(0.5μmol/L)。PCR体系：pCBC‑DT1T2载体(稀释100倍)1μl、BnGTR‑DT1‑BsF 1μl、BnGTR‑DT2‑BsR 1μl、BnGTR‑DT1‑F0 1μl、BnGTR‑DT2‑R0 1μl、2×Phanta Max Master Mix(康为世纪)10μl、ddH2O 5μl；PCR反应条件为：95℃ 3min；95℃ 
15sec，58℃ 15sec，72℃ 45sec，32个循环；72℃ 7min。PCR扩增获得626bp的片段，1％琼脂糖凝胶电泳检测并将目的条带切胶回收，用30μl ddH2O溶解。

[0037] (4)将回收纯化的sgRNA表达盒(626bp)与pHSE401骨架载体(中国农业大学陈其军老师提供)采用边切边连的方法构建基因编辑载体CRISPR/Cas9载体。酶切‑连接体系如下：纯化后的sgRNA表达盒6μl、pHSE401载体2μl、10×T4 ligase Buffer(New England Biolabs,NEB)1.5μl、10×BSA(NEB)1.5μl、BsaI(NEB)1μl、T4 ligase(NEB)1μl、ddH2O 2μl，反应体系为15μl。反应条件为：37℃5h，50℃5min，80℃10min。酶切‑连接产物取5μl转化大肠杆菌感受态DH5α，Kan抗性平板筛选，U626‑IDF(SEQ ID NO.10)和U629‑IDR(SEQ ID NO.12)引物进行菌落PCR鉴定(726bp)，阳性克隆用U626‑IDF(SEQ ID NO.10)和U629‑IDF(SEQ ID NO.11)引物进行测序，测序正确的为构建好的CRISPR/Cas9载体，如图2所示。

[0038] (5)转农杆菌GV3101感受态细胞：感受态细胞冻融后加入10μL步骤(4)所得的包含CRISPR/Cas9载体的重组质粒，混匀，冰浴5min；液氮中冷冻5min；37℃恒温水浴锅水浴5min；加入新鲜的无抗生素的液体LB培养基，混匀后，28℃，220rpm/min活化2h。涂布于含卡那霉素和利福平的LB平板上，28℃，倒置暗培养2天，检测阳性单克隆，在卡那霉素和利福平抗性的液体LB培养基中扩增培养，用于甘蓝型油菜的遗传转化。

[0039] (6)使用根癌农杆菌介导的方式将CRISPR/Cas9载体转化到甘蓝型油菜受体材料高硫苷油菜品种中油821中，采用CTAB法提取转基因单株基因组DNA，通过载体特异性的引物筛选转基因阳性植株，鉴定所用上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.12所示；

[0040] (7)在转基因后代中筛选BnaA06.GTR2靶位点发生编辑的植株，根据鉴定引物扩增后的测序结果判断BnaA06.GTR2基因两个等位基因是否均被成功敲除。

[0041] BnaA06.GTR2基因的敲除，除了通过CRISPR/Cas9基因编辑系统，还可以采用EMS诱变、同源重组、T‑DNA插入等方法；且植物遗传转化方法不局限于农杆菌介导的转化方法，还可以通过花粉管通道法、基因枪法、显微注射法等遗传转化方法获得转基因植株。

[0042] 实施例2 BnaA06.GTR2基因特异性敲除突变体的获得

[0043] 提取T0代阳性单株的基因组DNA，分别以BnaA06.GTR1a、BnaA06.GTR2基因靶位点上下游特异引物进行PCR扩增，其中BnaA06.GTR1a的特异性引物为SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17，扩增后将PCR产物回收后用SEQ ID NO.16进行测序；BnaA06.GTR2的特异性引物为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，扩增后将PCR产物回收后用SEQ ID NO.15进行测序。通过比较测序峰图确定BnaA06.GTR1a、BnaA06.GTR2敲除情况，将测序峰图通过DSDecodeM分析确定突变类型，如没有野生型的峰图存在，说明该拷贝发生了纯合或双等位/嵌合突变，并进一步通过TA克隆进行验证。如图3所示，T0代转化植株13#、34#、45#在BnaA06.GTR2靶位点位置发生了双等位基因编辑且编辑类型相同，造成其编码的氨基酸序列发生移码突变：其CDS序列第464位G碱基缺失，导致其编码蛋白序列第155位氨基酸及其后序列发生移码突变，至157个氨基酸提前终止；其CDS序列第464、465位GT碱基缺失，导致其编码蛋白序列第156位氨基酸及其后序列发生移码突变，至174个氨基酸提前终止。但是在BnaA06.GTR1a靶位点位置均没有发生编辑，通过自交的方法在T1代中筛选到BnaA06.GTR2的纯合突变单株。

[0044] gRNA1除靶向BnaA06.GTR1a外，还靶向BnaC03.GTR1b；gRNA2除靶向BnaA06.GTR2外，还靶向BnaA09.GTR2c、BnaA09.GTR2b和BnaA09.GTR2a。同样地，分别在这些靶基因的靶位点上下游采用特异引物进行PCR扩增并进行测序鉴定突变情况，BnaC03.GTR1b基因特异扩增引物为SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19，测序引物为SEQ ID NO.19，检测结果为靶位点均未发生编辑；BnaA09.GTR2c基因特异扩增引物为SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21，测序引物为SEQ ID NO.22，检测结果为靶位点发生单碱基非同义突变，导致其编码氨基酸序列第229位点由亮氨酸到甲硫氨酸替换；BnaA09.GTR2b基因特异扩增引物为SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24，测序引物为SEQ ID NO.25，检测结果为靶位点发生两个碱基的同义突变，其编码的蛋白序列未发生变化；BnaA09.GTR2a基因特异扩增引物为SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27，测序引物为SEQ ID NO.28，检测结果为靶位点均未发生编辑。

[0045] 随后，使用CRISPR‑GE在线软件(Xie et al.,2017)分别预测了gRNA1和gRNA2的潜在脱靶位点，并根据分值分别选择5个最有可能的脱靶位点进行测序，转基因植株13#、34#、45#均未发现任何脱靶事件。

[0046] 随后，通过自交的方法获得F1代植株，并使用Sanger测序或高通量测序(Hi‑Tom，方法详见文献Liu et al.,2019)的方法，在gRNA1和gRNA2的靶序列位置对T1代单株进行基因分型。13#、34#、45#株系的BnaA06.GTR2基因在gRNA2靶位点区的双等位突变均能成功传至T1代，在T1代个体中表现为纯合或双等位基因突变。此外，结果还表明，包括双等位基因突变在内的基因组编辑事件能成功地传递到T1代，但在这3个转基因家系(13#，34#，45#)的后代中均未发现额外的突变。而且，如图4所示，上述基因编辑的植物在正常自然条件下没有表现出明显的形态变化，说明上述基因编辑的操作并没有对植物生长造成毒害。

[0047] 综上所述，本实施例通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了BnaA06.GTR2特异敲除突变体，其编码的蛋白发生提前终止。

[0048] 实施例3转基因T2代纯合突变株系种子中硫苷含量分析

[0049] 将上述BnaA06.GTR2基因编辑T1代植株自交并收获成熟的T2代家系种子，采用液相色谱(HPLC)法测定并分析种子中硫苷含量，以转基因受体材料中油821作为对照。硫苷含量采用中华人民共和国行业标准(NY/T 1582‑2007)油菜籽中硫代葡萄糖苷的测定高效液相色谱方法进行测定。

[0050] 结果如图5所示，13#、34#、45#3个转基因株系中成熟种子硫苷含量均显著降低，其成熟种子中平均硫苷含量分别为32.6±11.9、31.5±6.8、30.6±13.4μmol/g干种子，与ZY821(131.8±8.3μmol/g)相比，平均降低76.05±0.76％。

[0051] 考虑到13#、34#、45#基因编辑家系中BnaA09.GTR2c基因发生了一个单碱基非同义突变，导致其编码氨基酸序列第229位点由亮氨酸到甲硫氨酸替换，取转基因受体植株中油821的4‑48天的种子(seed)、4‑48天的角果皮(selique wall:sw)、根(root)和叶(leaf)材料，提取总RNA，进行RT PCR，转录组数据如图6所示，BnaA09.GTR2c基因在转基因受体植株中油821的根、叶等组织及不同发育时期的角果皮(selique wall:sw)和种子(seed)中均不表达。而BnaA06.GTR2靶位点位置发生了双等位基因编辑，造成其编码的氨基酸序列在第
155位或第156位后发生移码突变且提前终止。因此，上述实验结果表明BnaA06.GTR2基因的突变是导致基因编辑材料13#、34#、45#家系种子中总硫苷显著降低的原因。从而证明，在甘蓝型油菜中，硫苷转运基因BnaA06.GTR2为硫苷的关键转运基因，在负责硫苷从合成组织向成熟种子中积累的过程中发挥着重要作用。

[0052] 综上所述，本发明利用基因组编辑工具CRISPR/Cas9技术对异源四倍体甘蓝型油菜中硫苷转运基因BnGTR的多个拷贝进行编辑，并鉴定到BnaA06.GTR2基因特异编辑的纯合突变体，成熟种子中硫苷含量的高效液相色谱分析表明BnaA06.GTR2基因敲除突变体中总硫苷含量相对转基因受体中油821发生极显著降低，从而证明BnaA06.GTR2基因是硫苷从合成部位往种子中转运的关键基因，并获得了种子中硫苷含量显著降低的甘蓝型油菜新种质资源。本发明鉴定的BnaA06.GTR2基因对甘蓝型油菜中硫苷从合成部位往种子中运输过程中发挥关键作用，能够用于油菜种子中硫苷性状的改良，为甘蓝型油菜种子低硫苷性状的改良开发提供了理论依据，为以低硫苷性状改良为目标的油菜育种工作提供了一种新的途径。

[0053] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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