马齿苋多糖在制备抗急性肺损伤药物中的应用

摘要

本发明涉及制药技术领域，公开了一种马齿苋多糖在制备抗急性肺损伤药物中的应用。本发明通过马齿苋多糖对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤的作用研究发现，马齿苋多糖能够降低小鼠肺组织W/D比值和肺组织中MPO活性，同时降低小鼠血清中TNF‑α、IL‑1β和IL‑6炎症因子含量，并可缓解小鼠肺组织损伤程度，表明马齿苋多糖对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤有一定的保护作用，并有望用于抗急性肺损伤药物的制备当中。

权利要求

1.一种马齿苋多糖作为唯一活性成分在制备抗急性肺损伤药物中的应用，其特征在于，马齿苋多糖的制备过程为：将马齿苋经粉碎机粉碎后过10目筛得粗粉，加入粗粉4倍量无水乙醇浸泡24 h，抽滤，于60℃将滤渣烘干；向烘干滤渣中加入10倍量的蒸馏水，80℃水浴温浸2h，抽滤，重复上述步骤两次，合并滤液，减压浓缩；向浓缩液中加入无水乙醇至80%，

4℃静置过夜，抽滤，然后用50mL无水乙醇冲洗滤渣，并收集滤渣，即为马齿苋粗多糖；将得到马齿苋粗多糖用蒸馏水溶解后，加入马齿苋粗多糖质量1%的活性炭进行脱色，之后再与Sevage试剂在分液漏斗中充分震荡，所述Sevage试剂为正丁醇：氯仿=4：1（v/v），除去粗多糖中含有的蛋白，收集上清液，最后减压浓缩，真空冷冻干燥48h，得马齿苋多糖，‑20℃保存备用。

2.根据权利要求1所述的马齿苋多糖作为唯一活性成分在制备抗急性肺损伤药物中的应用，其特征在于，真空冷冻干燥温度为‑10℃，真空冷冻压强为100pa。

说明书

马齿苋多糖在制备抗急性肺损伤药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及制药技术领域，具体涉及一种马齿苋多糖在制备抗急性肺损伤药物中的应用。

背景技术

[0002] 急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是急诊科最常见的危重病之一，其特点为肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，并伴随蛋白质的渗出、促炎症介质和因子的释放。ALI的发生过程中多种细胞因子与炎症相关介质参与了本病的发生与发展，例如肿瘤坏死因子α（TNF‑α）、白介素6（IL‑6）、白介素1β（IL‑1β）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和一氧化氮（NO）等。近年来尽管医疗和科研平取得较大进步，但是ALI病死率仍然居高不下，研究统计ALI致死率高达30‑50%。目前，临床上常用糖皮质激素、利索茶碱、表面活性剂等药物治疗ALI，但是其副作用较大，治疗效果不理想，因此探讨防治ALI的有效措施是当前研究的热点之一。

[0003] 马齿苋（Portulaca Oleracea L）为马齿苋科一年生草本植物，又名长寿菜、五行草、马蜂菜等，其性寒，味酸，具有清热解毒、凉血止血、止痢的功效，具有较高的药用和食用价值。马齿苋化学成分主要为多糖类、黄酮类、生物碱类、有机酚酸类、萜类、香豆素类等。现代药理研究发现马齿苋多糖具有抗炎、保肝、镇痛、抗氧化等作用。但该多糖是否对急性肺损伤有保护作用则未见报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的是为了克服现有技术存在的不足，提供了一种马齿苋多糖在制备抗急性肺损伤药物中的应用。所述马齿苋多糖对LPS（脂多糖）所致的急性肺损伤表现出了一定的保护作用，表明马齿苋多糖可有望用于抗急性肺损伤药物的制备当中，且马齿苋属于草本植物，毒副作用小。

[0005] 为了实现上述目的，本发明提供了一种马齿苋多糖在制备抗急性肺损伤药物中的应用。

[0006] 优选的，马齿苋多糖的制备过程为：将马齿苋经粉碎机粉碎后过10目筛得粗粉，加入粗粉4倍量无水乙醇浸泡24 h，抽滤，于60℃将滤渣烘干；向烘干滤渣中加入10倍量的蒸馏水，80℃水浴温浸2h，抽滤，重复上述步骤两次，合并滤液，减压浓缩；向浓缩液中加入无水乙醇至80%，4℃静置过夜，抽滤，然后用50mL无水乙醇冲洗滤渣，并收集滤渣，即为马齿苋粗多糖；将得到马齿苋粗多糖用蒸馏水溶解后，加入马齿苋粗多糖质量1%的活性炭进行脱色，之后再与Sevage试剂在分液漏斗中充分震荡，除去粗多糖中含有的蛋白，收集上清液，最后减压浓缩，真空冷冻干燥48h，得马齿苋多糖，‑20℃保存备用。

[0007] 优选的，所述Sevage试剂为正丁醇：氯仿=4：1（v/v）。

[0008] 优选的，真空冷冻干燥温度为‑10℃，真空冷冻压强为100pa。

[0009] LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分。LPS刺激能够活化巨噬细胞，诱导机体释放大量TNF‑α、IL‑1β和IL‑6等炎症细胞因子，进而引发急性炎症，相关研究报道认为，肺组织的炎症反应失衡是导致ALI发生的根本原因。本发明通过采用气管内滴注LPS溶液建立急性肺损伤小鼠动物模型，滴注后2‑4 h内可诱发ALI，在24‑48 h内造成最大肺损伤。此法可避免皮下注射LPS诱发的全身炎症反应和多器官衰竭。

[0010] ALI的症状之一就是肺水肿，而肺组织湿/干重比值（W/D）则反映了肺水肿程度，W/D比值越大则肺水肿程度越大，本申请通过W/D=(肺组织湿重/肺组织干重)×100%，对W/D比值进行计算。

[0011] 本发明所述马齿苋多糖能够降低肺组织水肿程度和肺组织中髓过氧化物酶（MPO）活性，同时降低小鼠血清中TNF‑α、IL‑1β和IL‑6炎症因子含量，表明马齿苋多糖对LPS所致的急性肺损伤具有一定的保护作用。

[0012] 本发明的优点是为抗急性肺损伤提供了一种新的药物来源。

附图说明

[0013] 图1为马齿苋多糖对肺组织湿/干重比值（W/D）的影响(n=10)。

[0014] 图2为马齿苋多糖对肺组织中髓过氧化物酶（MPO）活性的影响(n=10)。

[0015] 图3为马齿苋多糖对血清中TNF‑α、IL‑1β和IL‑6含量的影响(n=10)。

[0016] 图4为马齿苋多糖对肺组织病理形态学的影响(×400)。

[0017] 图5为马齿苋多糖对肺组织损伤评分的影响。

具体实施方式

[0018] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明的保护范围并不局限于此。

[0019] 实施例1

[0020] 1 材料与仪器

[0021] 1.1 试剂

[0022] 马齿苋（张仲景大药房）；脂多糖（美国Sigma公司）；地塞米松(上海源叶生物科技有限公司)；肿瘤坏死因子ɑ（TNF‑α）、白介素1β（IL‑1β）和白介素6（IL‑6）ELISA检测试剂盒（上海西塘生物科技有限公司）；髓过氧化物酶（MPO）活性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；羧甲基纤维素钠（天津市科密欧化学试剂有限公司）；戊巴比妥钠（上海试剂二厂生产）。

[0023] 1.2 动物

[0024] 60只SPF级KM小鼠，雌雄各半，体重18‑20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2017‑0005，存放在黄河科技学院动物房，光照12h/d，温度20‑23℃，相对湿度40 60%，适应性饲养7 d后用于实验。~

[0025] 仪器

[0026] 多功能酶标仪（奥地利Infinite公司）；高速台式冷冻离心机（美国赛默飞世尔科技有限公司）；FY135型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；DHP‑9052电热恒温培养箱（上海‑恒科技有限公司）；BS‑3000A系列电子天平（上海友声衡器有限公司）；光学显微镜（OLYMPUS）；ＲM2125型石蜡切片机（德国Leica公司）；L9型紫外‑可见光分光度计（上海仪电分析仪器有限公司）。

[0027] 方法

[0028] 2.1 药物制备

[0029] 2.1.1 马齿苋多糖的制备及溶液配制

[0030] 将马齿苋经粉碎机粉碎后过10目筛得粗粉，称取500g马齿苋粗粉，加入4倍量无水乙醇浸泡24 h，抽滤，于60℃将滤渣烘干；向烘干滤渣中加入10倍量的蒸馏水，80℃水浴温浸2h，抽滤，重复上述步骤两次，合并滤液，减压浓缩；向浓缩液中加入无水乙醇至80%，4℃静置过夜，抽滤，然后用50mL无水乙醇冲洗滤渣，并收集滤渣，即为马齿苋粗多糖；将得到马齿苋粗多糖用蒸馏水溶解后，加入马齿苋粗多糖质量1%的活性炭进行脱色，之后再与正丁醇：氯仿=4：1（v/v）混合液在分液漏斗中充分震荡，除去粗多糖中含有的蛋白，收集上清液，最后减压浓缩，在温度为‑10℃，真空压强为100pa条件下进行真空冷冻干燥48h，得马齿苋多糖，‑20℃保存备用。

[0031] 分别精密称定马齿苋多糖0.75 g、1.5 g 和3 g置于50mL容量瓶中，加入20mL蒸馏水使马齿苋多糖完全溶解后，再用蒸馏水定容至50mL，浓度分别为0.015g/mL 、0.03g/mL和0.06g/mL，即低、中、高三种浓度，备用。

[0032] 地塞米松溶液的配制

[0033] 精密称定地塞米松25mg置于50mL容量瓶中，加入20mL 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液中混匀后，再用0.5%羧甲基纤维素钠水溶液定容至50mL，浓度为0.0005g/mL的溶液，备用，每次灌胃之前一定充分混匀。

[0034] 分组、造模与给药

[0035] 将60只小鼠适应性饲养1周后，随机分为正常组，模型组，地塞米松组（0.005 g/kg.d），马齿苋多糖低、中、高剂量组（0.15、0.3、0.6 g/kg/d），每组10只。按照10mL/kg.d体质量进行灌胃给药，1次/d，连续14d，其中正常组、模型组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠水溶液。末次给药后2h，腹腔注射1.5%戊巴比妥钠溶液（按照0.1ml/10g体质量）麻醉小鼠，然后剔除小鼠颈部正中毛发，酒精消毒，正中切开颈部皮肤，暴露并分离气管。采用样品进样器于气管内慢慢滴注LPS生理盐水溶液50uL（含LPS 10ug），建立急性肺损伤小鼠动物模型，正常组则采用同样方法给予相应体积的生理盐水，滴注结束后消毒并缝合皮肤。禁食不禁水，造模
12h后，小鼠眼眶采血，随后处死小鼠并迅速取出小鼠的肺组织，备用。

[0036] 统计学方法

[0037] 采用SPSS 22.0软件进行数据处理。计量资料符合正态分布的以（）表示，采用单因素方差分析检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

[0038] 小鼠肺组织湿/干重比值（W/D）测定

[0039] 取小鼠右肺上叶，除去结缔组织，用滤纸吸干表面水分和血液，称量得到肺组织湿重；随后将肺组织放置在80℃恒温干燥箱中连续干燥48h，称量肺组织干重并记录，计算W/D，结果见图1。

[0040] 由图1结果所知，与正常组小鼠相比，模型组小鼠W/D比值显著性升高（##P＜0.01），与模型组相比，马齿苋多糖各剂量组小鼠W/D比值均有下降，其中中剂量和高剂量组均具有* **统计学差异（P<0.05 , P<0.01），表明马齿苋多糖能够减轻LPS所诱导的ALI。

[0041] 小鼠肺组织中MPO活性测定

[0042] 取小鼠肺组织于组织匀浆器中，加生理盐水并在冰水浴中进行研磨，离心得上清液，按照MPO活性检测试剂盒说明书检测肺组织中MPO活性，结果见图2。

[0043] 由图2结果可知，与正常组小鼠相比，模型组小鼠肺组织中MPO活性显著性升高（##P <0.01），与模型组相比，马齿苋多糖各剂量组小鼠肺组织中MPO活性均有降低，其中中剂量* **和高剂量组均具有统计学差异（P<0.05 , P<0.01）。

[0044] 小鼠血清中TNF‑α、IL‑1β和IL‑6含量测定

[0045] 取血液样本在3000r/min条件下离心10min，再取上清液按照各ELISA检测试剂盒说明书步骤，利用ELISA法测定小鼠血清中TNF‑α、IL‑1β和IL‑6的含量，结果见图3。

[0046] 由图3结果所知，与正常组小鼠相比，模型组小鼠血清中TNF‑α、IL‑1β和IL‑6含量##显著性升高（ P＜0.01），与模型组相比，马齿苋多糖各剂量组小鼠血清中TNF‑α、IL‑1β和* **
IL‑6含量均有降低，其中中剂量和高剂量组均具有统计学差异（P<0.05  , P<0.01）。目前关于ALI的致病机制尚不清楚，但是相关研究报道认为，肺组织的炎症反应失衡是导致ALI发生的根本原因。本研究结果表明马齿苋多糖能够降低TNF‑α、IL‑1β和IL‑6炎症细胞因子含量，提示马齿苋多糖对LPS诱导的急性肺损伤的保护与抑制炎症因子分泌有关。

[0047] 肺组织病理学检查

[0048] 取小鼠右肺下叶固定于10%中性甲醛溶液中，24h后取出，使用蒸馏水冲洗至无味；然后对其进行常规的脱水、浸蜡、包埋、切片、苏木素‑伊红染色、封片，在显微镜下对其进行病理学观察（图4），并进行病理学评分（图5）。包括肺泡壁厚度、肺组织破坏和炎症细胞浸润三个指标，每个指标按5分制评分：0分为最小损伤，1分为轻度损伤，2分为中度损伤，3分为重度损伤，4分为最大损伤，肺损伤评分为3个指标评分之和。

[0049] 由图4结果可知，正常组小鼠肺组织的结构清晰、无渗出液，并且没有出现水肿及炎性细胞浸润现象。模型组小鼠的肺组织有血斑出现、呈现肺水肿，而且肺泡壁增宽，有大##量炎性细胞浸润现象出现（ P＜0.01）。与模型组小鼠相比，马齿苋多糖各剂量组小鼠肺组* **
织损伤均有不同程度的缓解（P＜0.05 , P＜0.01）。

[0050] 以上实验结果表明：马齿苋多糖能够降低小鼠肺组织W/D比值和肺组织中MPO活性，同时降低小鼠血清中TNF‑α、IL‑1β和IL‑6炎症因子含量，并可缓解小鼠肺组织损伤程度。表明马齿苋多糖对LPS所致的急性肺损伤具有一定的保护作用，其作用机制可能与马齿苋多糖抑制细胞炎症因子分泌有关。表明马齿苋多糖可有望用于抗急性肺损伤药物的制备当中。

[0051] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。