一种粗糠树组织培养快速生根的方法

摘要

本发明属于粗糠树繁育技术领域，具体涉及一种粗糠树组织培养快速生根的方法。本发明提供了一种粗糠树组织培养快速生根的方法，该方法组织培养周期短，生产成本低：与常见快繁技术相比，生根速度是粗糠树扦插快繁的两倍，而与常见木本植物组织培养周期相比，生根培养过程简单，无需愈伤组织脱分化、再分化培养，培养时间大大缩短。

权利要求

1.一种粗糠树组织培养快速生根的方法，其特征在于包含如下步骤：(1)剪切粗糠枝条，选取粗糠树当年生春季4月初的幼嫩带芽茎段作为外植体并进行预处理和消毒处理；

(2)将步骤(1)中消毒处理后的外植体接种于生根培养基上，在培养温度为22‑25℃、光照强度为1800‑2400lx，每日光照12h的条件下培养至不定根长出；

(3)生根培养40‑50天后，剪取步骤(2)中培养基上的带芽茎段接种于新的生根培养基中，进行二次生根培养，以扩大繁殖数量；

(4)将步骤(2)或步骤(3)生根培养后的组培苗进行炼苗移栽；

步骤(1)中所述的消毒处理的具体操作为：

将粗糠树当年生春季4月初的幼嫩带芽茎段用体积分数为75％的酒精浸洗20‑40s，再用0.1wt.％的氯化汞溶液消毒8min，无菌水冲洗3‑4次；无菌水冲洗后，吸干表面水分并切去切口与消毒液的接触部分；

步骤(2)中所述的生根培养基为：WPM培养基+IBA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+AC 3g/L+琼脂

4.9g/L，pH＝5.8；

步骤(3)中所述的生根培养基为：WPM培养基+IBA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+AC 3g/L+琼脂

4.9g/L，pH＝5.8。

2.根据权利要求1所述的粗糠树组织培养快速生根的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的幼嫩带芽茎段为长度为3‑4cm、带2个芽的幼嫩带芽茎段。

3.根据权利要求1所述的粗糠树组织培养快速生根的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的预处理为将粗糠树当年生春季4月初的幼嫩带芽茎段用流水冲洗4h。

4.根据权利要求1所述的粗糠树组织培养快速生根的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的带芽茎段的长度为3‑4cm。

5.根据权利要求1所述的粗糠树组织培养快速生根的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的二次生根培养的条件为：培养温度为22‑25℃，光照强度为1800‑

2400lx，每日光照12h。

6.根据权利要求1所述的粗糠树组织培养快速生根的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的炼苗移栽的具体操作为：

将生根后的幼苗移至温室，置于自然光照下7‑10天，使幼苗健壮并木质化，壮苗后开瓶炼苗1‑2天，以便适应外界环境；移栽前用水洗净根部培养基，洗去根部培养基后，移栽到高锰酸钾消毒过的珍珠岩中，移栽后即时浇水；移栽后，环境湿度保持在80‑90％，环境温度为

20‑26℃。

说明书

一种粗糠树组织培养快速生根的方法

技术领域

[0001] 本发明属于粗糠树繁育技术领域，具体涉及一种粗糠树组织培养快速生根的方法。

背景技术

[0002] 粗糠树(Ehretia macrophylla Wall.)落叶乔木，树皮灰色，小枝褐色，具皮孔；叶面绿色，被糙伏毛，背面色淡，无毛或近无毛；伞房状圆锥花序顶生，花多，芳香，花梗密被短毛，花萼绿色，花冠白色或略带黄，花丝白色，花药黄色，花柱淡绿色；核果绿色转黄色，近球形，花果期3～7月。粗糠树具有较强的吸附灰尘作用，是城市绿化的优良树种，随着国家储备和森林廊道及生态建设工程的发展，粗糠树苗木需求量也越来越大。

[0003] 目前，粗糠树的繁育方式主要包括扦插、播种等，例如：耿翠芳等人首次采用播种的形式进行育苗并获得成功(耿翠芳,王利.粗糠树播种育苗技术[J].中国林副特产,2005,000(006):32‑33.)，路买林等人对粗糠物候期、生物学特性，抗逆性、进行了观测记录，对优良单株进行了标记、繁育(路买林,万卉敏.粗糠树种质资源收集及育苗技术研究[J].河南林业科技,2018,v.38；No.139(001):22‑23.)。随后路买林等人又深入研究了不同播种时间、不同的基质、不同种子处理对粗糠树发芽的影响(路买林,徐海霞.粗糠树播种及幼苗移栽关键技术优化研究[J].河南林业科技,2020.)。郝改莲以成年粗糠树母树根为材料，设计了不同粗度和长度的根穗进行根插育苗试验，结果表明粗糠树的根易形成愈伤组织，极易形成根蘖，根插育苗是较好的营养繁育方法(郝改莲.粗糠树的扦插育苗技术[J].濮阳职业技术学院学报,2014,27(02):154‑155.)。

[0004] 与传统的繁殖方式相比，组织培养可以不受时间、空间限制且增殖系数高，可以在较短时间内，大量快速地培养无菌苗。但从目前的研究进展来看，关于粗糠树繁育技术的研究还处于刚刚开展的时期，传统的繁育技术仅少数人有所涉及，而利用组织培养技术进行粗糠树的繁育还处于空白。粗糠树所属的紫草科中，已进行过组织培养研究的物种基本都是草本或灌木植物，例如紫草(周立刚,郑光植,徐纯.滇紫草愈伤组织培养的初步研究[J].云南植物研究,1991(02):237‑240.张倩怡,张丽莎,郑宏丽,李永德,姜长阳.紫草的组织培养及快速繁殖研究[J].河南科学,2009,27(01):55‑58.)、蓝蓟(吴月亮.蓝蓟的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学通讯,2008(02):304.)、琉璃苣(张红梅,李思颖,蔡宝宏,杨文平,李明,张红,吴鹏.琉璃苣体外培养技术研究[J].安徽农业科学,2014,42(21):6941‑6977.)、轮冠木(Martin K.Rapid in vitro multiplication and ex vitro rooting of Rotula aquatica Lour.a rare rhoeophytic woody medicinal plant[J].Plant Cell Reports,2003,21(5):415‑420.)。

[0005] 据资料显示，扦插最快约50天出现不定根，扦插生根率若为100％，也只能做到一枝一苗，而组织培养技术能实现大规模、工厂化育苗。但是，木本植物的生理构造远比草本植物复杂，生长繁殖周期远远长于草本植物，筛选适宜外源激素浓度及培养条件，对扩繁意义重大。

发明内容

[0006] 为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的目的在于提供一种粗糠树组织培养快速生根的方法，该方法具有周期短、成本低、生根速度快、生根率高和增殖系数高等优点。

[0007] 本发明的目的通过下属技术方案实现：

[0008] 一种粗糠树组织培养快速生根的方法，包含如下步骤：

[0009] (1)剪切粗糠枝条，选取粗糠树当年生春季4月初的幼嫩带芽茎段作为外植体并进行预处理和消毒处理；

[0010] (2)将步骤(1)中消毒处理后的外植体接种于生根培养基上，在培养温度为22‑25℃、光照强度为1800‑2400lx，每日光照12h的条件下培养至不定根长出；

[0011] (3)生根培养40‑50天后，剪取步骤(2)中培养基上的带芽茎段接种于新的生根培养基中，进行二次生根培养，以扩大繁殖数量；

[0012] (4)将步骤(2)或步骤(3)生根培养后的组培苗进行炼苗移栽；

[0013] 步骤(1)中所述的幼嫩带芽茎段优选为长度为3‑4cm、带2个芽的幼嫩带芽茎段；

[0014] 步骤(1)中所述的预处理优选为将粗糠树当年生春季4月初的幼嫩带芽茎段用流水冲洗4h；

[0015] 步骤(1)中所述的消毒处理的具体操作优选为：

[0016] 将粗糠树当年生春季4月初的幼嫩带芽茎段用体积分数为75％的酒精浸洗20‑40s，再用0.1wt.％的氯化汞溶液消毒8min，无菌水冲洗3‑4次；无菌水冲洗后，吸干表面水分并切去切口与消毒液的接触部分；

[0017] 步骤(2)中所述的生根培养基为：WPM培养基+IBA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+AC 3g/L+琼脂4.9g/L，pH＝5.8；

[0018] 步骤(3)中所述的带芽茎段的长度优选为3‑4cm；

[0019] 步骤(3)中所述的生根培养基为：WPM培养基+IBA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+AC 3g/L+琼脂4.9g/L，pH＝5.8；

[0020] 步骤(3)中所述的二次生根培养的条件优选为：培养温度为22‑25℃，光照强度为1800‑2400lx，每日光照12h；

[0021] 步骤(4)中所述的组培苗优选生有3‑4条、3‑5cm长的新根；

[0022] 步骤(4)中所述的炼苗移栽的具体操作优选为：

[0023] 将生根后的幼苗移至温室，置于自然光照下7‑10天，使幼苗健壮并木质化，壮苗后开瓶炼苗1‑2天，以便适应外界环境；移栽前用水洗净根部培养基，洗去根部培养基后，移栽到高锰酸钾消毒过的珍珠岩中，移栽后即时浇水；移栽后，环境湿度保持在80‑90％，环境温度为20‑26℃，前期需要适当遮光，后期要多见阳光；

[0024] 本发明的原理：

[0025] 为快速繁殖粗糠树，本发明以不同时间的粗糠树幼嫩茎段、新芽为外植体材料，以MS、1/2MS、WPM培养基为基础培养基，同时添加NAA、IAA、IBA等外源激素，开展组织培养实验，最后确定快速生根的外植体取材类型及时间、消毒条件、基础培养基种类、激素种类及浓度等。多次结果表明，用幼嫩带芽茎段(3‑4cm)做外植体培养，无需启动分化培养，可在生根培养中直接生根，且生根快，仅需20天左右即可生根。

[0026] 多年组织培养研究表明，木本植物组培生根慢，生根难。本发明解决了粗糠树的组培技术问题，外植体能在短时间内(20天左右)生根，比扦插生根时间缩短了一半时间，并且在生根培养40‑50天左右，又可剪切无菌苗的带芽茎段(3‑4cm)转接到生根培养基中，20天后再次生根。

[0027] 本发明中粗糠树生根培养过程简单，无需愈伤组织脱分化、再分化培养，因此本发明加快了生根速度，缩短了组织培养周期，降低了生产成本，也极大地扩大了繁殖数量。

[0028] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0029] (1)本发明提供了粗糠树组织培养快速生根的方法，该方法组织培养周期短，生产成本低：与常见快繁技术相比，生根速度是粗糠树扦插快繁的两倍，而与常见木本植物组织培养周期相比，生根培养过程简单，无需愈伤组织脱分化、再分化培养，培养时间大大缩短。

[0030] (2)本发明提供的粗糠树组织培养快速生根的方法苗木扩繁数量大：生根培养过程中，能在第一次生根后剪切茎段再次生根，达到二次快繁的目的。

[0031] (3)本发明提供的粗糠树组织培养快速生根的方法生根效果显著：组培过程中，与常见木本植物组织培养相比，污染率低，为30％，生根培养过程中，茎段迅速伸长，新叶茂盛，长势良好，根系发达，生根率达100％。

[0032] (4)本发明历时两年完成粗糠树组织培养快繁过程，成功建立其快速生根体系。

附图说明

[0033] 图1是以春季(3‑4月)萌发的新芽为外植体，采用WPM培养基+NAA 1.0mg/L+6‑BA 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.9g/L(pH＝5.8)进行分化培养后获得的丛生芽的展示图。

[0034] 图2是以粗糠幼嫩带芽茎段为外植体，采用1/2MS培养基+IBA1.0 mg/L+蔗糖30g/L+AC 3g/L+琼脂4.9g/L(pH＝5.8)进行生根培养后的展示图。

[0035] 图3是以粗糠幼嫩带芽茎段为外植体，采用WPM培养基+IBA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.9g/L(pH＝5.8)(无活性炭)生根培养第30天的展示图。

[0036] 图4是实施例5中生根培养和二次生根培养的幼苗展示图，其中，A：生根培养第7天，B：生根培养第30天，C：生根培养第40天，D：无菌苗茎段二次生根培养第30天。

具体实施方式

[0037] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0038] 实施例1当年生春季(3‑4月)萌发的新芽作为外植体

[0039] 一、实验过程

[0040] 1、外植体取材和消毒

[0041] (1)外植体采集：当年生春季(3‑4月)萌发的粗糠新芽；

[0042] (2)外植体预处理：将当年生春季(3‑4月)萌发的粗糠新芽用流水冲洗4h；

[0043] (3)外植体消毒：用体积分数为75％的酒精浸洗30s，再用0.1wt.％的氯化汞溶液消毒8min，无菌水冲洗4次，采用无菌滤纸吸干水分；

[0044] 2、接种和分化培养

[0045] 将步骤1消毒后的的外植体(粗糠新芽)接种于分化培养基(具体组成见表1‑表3，另含琼脂4.9g/L)中，在室内培养温度为22～25℃、光照强度为1800～2400lx、每日光照12h的条件下进行分化培养；

[0046] 3、生根培养

[0047] 将步骤2获得的丛芽转至生根培养基(具体组成见表4‑表7，另含琼脂4.9g/L)中，在室内培养温度为22～25℃、光照强度为1800～2400lx、每日光照12h的条件下进行生根培养。

[0048] 二、实验结果及分析

[0049] NAA、IAA和IBA属于生长素，6‑BA属于细胞分裂素，其中，6‑BA可以促进芽的分化和侧芽萌发，本实施例以1/2MS培养基、MS培养基和WPM培养基为基础培养基，添加不同种类、不同浓度的外源激素研究以春季(3‑4月)萌发的新芽为外植体进行粗糠组织培养的可能性，结果见表1～3。

[0050] 以春季(3‑4月)萌发的新芽为外植体，采用1/2MS培养基为基础培养基即使添加不同种类、不同浓度的外源激素进行分化培养，无论如何调整外源激素的种类和浓度，所有外植体均无明显分化，部分结果见表1。

[0051] 以春季(3‑4月)萌发的新芽为外植体，采用MS培养基为基础培养基添加不同种类、不同浓度的外源激素进行分化培养，部分结果见表2，其中，处理组3由于污染率极高，没有得到有效统计数据；当NAA、IAA和IBA总含量不超过2mg/L时，6‑BA含量即使仅为1mg/L，也可以促进芽的分化和侧芽萌发，进而产生较多的丛生芽；而当NAA、IAA和IBA总含量超过3mg/L时，即使6‑BA含量达到2mg/L(处理组7)，芽的分化和侧芽萌发也受到影响，仅有少量丛生芽产生，进一步说明了生长素和细胞分裂素的共同添加，在一定范围内是可以促进芽的分化和侧芽萌发。当两者浓度不合适时，即使添加较高浓度的细胞分裂素，仍然不能有效促进丛生芽的生长。

[0052] 以春季(3‑4月)萌发的新芽为外植体，采用WPM培养基为基础培养基添加不同种类、不同浓度的外源激素进行分化培养，部分结果见表3，与采用MS培养基为基础培养基添加不同种类、不同浓度的外源激素进行分化培养的结果相似，其中，图1是表3处理组1获得的丛生芽。

[0053] 在分化培养的基础上，将表2和表3中获得的丛生芽转至不同生根培养基(表4‑表5)中，结果显示：再分化培养生根困难，生根率极低，很难出现再分化现象(表4‑表5)；将表2和表3中获得的丛生芽转至表6和表7中的生根培养基中进行生根培养，同样出现无法生根的情况。

[0054] 表1不同1/2MS培养基配方及分化培养结果(以新芽为外植体)

[0055]

[0056] 表2不同MS培养基配方及分化培养结果(以新芽为外植体)

[0057]

[0058] 表3不同WPM培养基配方及分化培养结果(以新芽为外植体)

[0059]

[0060] 表4不同WPM培养基配方及生根培养结果(以新芽为外植体)

[0061]

[0062] 表5不同1/2MS培养基配方及生根培养结果(以新芽为外植体)

[0063]

[0064] 上述实验结果说明：以春季(3‑4月)萌发的新芽为外植体，采用MS或WPM培养基为基础培养基添加不同种类、不同浓度的外源激素进行分化培养虽然获得了丛生芽，但是丛生芽在生根培养基上无法生根。

[0065] 实施例2粗糠幼嫩带芽茎段为外植体

[0066] 一、实验过程

[0067] 1、外植体取材和消毒

[0068] (1)外植体采集：当年生春季4月初的幼嫩带芽茎段；

[0069] (2)外植体预处理：将当年生春季4月初的幼嫩带芽茎段用流水冲洗4h；其中，粗糠幼嫩带芽茎段的制备方法为：剪切粗糠枝条并剪去叶片，得到粗糠幼嫩带芽茎段，其中，每个粗糠幼嫩带芽茎段的长度为3‑4cm、带有2个芽；

[0070] (3)外植体消毒：用体积分数为75％的酒精浸洗30s，再用0.1wt.％的氯化汞溶液消毒8min，无菌水冲洗4次，采用无菌滤纸吸干表面水分并切去切口与消毒液的接触部分；

[0071] 2、接种和生根培养

[0072] 将步骤1消毒后的的外植体不进行分化培养，直接接种于生根培养基(表6和表7)中，在室内培养温度为22～25℃、光照强度为1800～2400lx、每日光照12h的条件下培养；

[0073] 3、炼苗移栽

[0074] 当步骤2生根培养后的幼苗生有3‑4条3cm左右长的新根时，即可进行炼苗。具体方法为：将生根后的幼苗移至温室，置于自然光照下7‑10天，使幼苗健壮并木质化，壮苗后开瓶炼苗1‑2天，以便适应外界环境；移栽前用自来水洗净根部培养基，水流不能大，以防伤根；洗去根部培养基后，移栽到高锰酸钾消毒过的珍珠岩中，移栽后即时浇水；移栽后，要将环境湿度保持在80‑90％，环境温度控制在24℃±2℃，前期需要适当遮光，后期要多见阳光。

[0075] 二、实验结果及分析

[0076] 本实施例以1/2MS培养基、MS培养基和WPM培养基为基础培养基，添加不同种类、不同浓度的外源激素以及不同浓度的蔗糖等研究以当年生春季4月初的幼嫩带芽茎段为外植体进行粗糠组织培养的可能性，结果见表6～7。

[0077] 以当年生春季4月初的幼嫩带芽茎段为外植体，采用1/2MS培养基为基础培养基即使添加不同种类、不同浓度的外源激素(NAA、IAA和IBA)进行生根培养，无论如何调整激素的种类和浓度，所有外植体均无法生根(部分结果见表6)。其中，图2是采用1/2MS培养基+IBA1.0 mg/L+蔗糖30g/L+AC 3g/L+琼脂4.9g/L(pH＝5.8)(表6中处理组2)进行生根培养后的展示图。

[0078] 以当年生春季4月初的幼嫩带芽茎段为外植体，采用MS培养基为基础培养基即使添加不同种类、不同浓度的外源激素(NAA、IAA和IBA)进行生根培养，无论如何调整激素的种类和浓度，所有外植体均无法生根。

[0079] 以当年生春季4月初的幼嫩带芽茎段为外植体，采用WPM培养基为基础培养基(见表7)添加不同种类、不同浓度的外源激素(NAA、IAA和IBA)进行生根培养，结果表明添加激素后可促进生根。但是NAA、IAA对粗糠外植体无明显的生根效果；与NAA、IAA相比，IBA的促进生根作用强，且茎伸长和新叶生长快，能在较短时间内形成根原基；另外，根生长对激素浓度非常敏感：IBA浓度分别为0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L时，根生长差异明显，IBA为1.0mg/L时，根数量多，根长，IBA浓度高时却无生根现象。

[0080] 一般情况下，适当降低蔗糖浓度有利于生根。但在本实验过程中，发现蔗糖浓度(20g/L)低时，根脆且细，叶缘褐化严重，卷曲呈失水状。

[0081] 活性炭提供暗培养环境的同时，能有效地减少褐变的发生率，有利于诱导不定根。实验中，处理组9(添加活性炭，3g/L)和处理组10(无活性炭)(图3)相比，生根率高达100％，处理组10无生根。

[0082] 多次生根实验证实：在WPM培养基中添加IBA 1.0mg/L、蔗糖30g/L、AC3g/L时生根效果显著，生根率100％，而且污染率低，因此，最佳生根培养基为：WPM培养基+IBA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+AC 3g/L+琼脂4.9g/L，pH＝5.8。

[0083] 表6不同1/2MS培养基配方及生根培养结果(以粗糠幼嫩带芽茎段为外植体)[0084]

[0085] 表7不同WPM培养基配方及生根培养结果(以粗糠幼嫩带芽茎段为外植体)[0086]

[0087] 实施例3最佳取材时间的选择

[0088] 一、实验过程

[0089] 为了进一步确定最佳的取材时间，本发明又分别在当年生春季3月中旬(3月11日‑20日)、3月底(3月21日‑31日)、4月初(4月1日‑10日)、4月中旬(4月11日‑20日)时间段取幼嫩带芽茎段进行实验。生根培养基为实施例2获得的最佳生根培养基，其他步骤具体方法同实施例2。

[0090] 二、实验结果及分析

[0091] 结果表明：以当年生春季3月份(中旬和月底)的幼嫩带芽茎段做为外植体进行组织培养生根缓慢，需要约60天，同时生根率低，仅为20％；以当年生春季4月份(月初和中旬)的幼嫩带芽茎段做为外植体进行组织培养生根情况良好。其中，取自4月初的幼嫩带芽茎段做为外植体污染率低(污染率为30％)，生根快，根系发达，接种30～40天后，根系发达，最长约4cm，生根率高(100％)；取自4月中旬的幼嫩带芽茎段做为外植体的污染率为34％，生根率为85％。

[0092] 因此，用于粗糠树组织培养的最佳外植体取材时间为当年生春季4月初的幼嫩带芽茎段。

[0093] 实施例4消毒剂种类、浓度和消毒时间的选择

[0094] 本实施例研究了消毒剂种类、浓度和消毒时间对粗糠树组织培养的影响，具体方法如下：

[0095] 一、实验过程

[0096] 1、外植体取材和消毒

[0097] (1)外植体预处理：以当年生春季4月初的幼嫩带芽茎段为外植体，预处理方法同实施例2；

[0098] (2)外植体消毒：每种消毒处理接种30个外植体，每个处理实验重复3次，具体处理为：用体积分数为75％的酒精浸洗30s，然后再用0.1wt.％的氯化汞溶液(消毒6min、8min或10min)或次氯酸钠(5wt.％消毒20min或10wt.％消毒15min)或84(10wt.％消毒30min或
15wt.％消毒20min)，最后用无菌水冲洗4次；采用无菌滤纸吸干表面水分并切去切口与消毒液的接触部分；

[0099] 2、接种和生根培养

[0100] 具体培养同实施例2；其中，接种3天后开始观察并分别统计每个处理的污染数、死亡数，接种30天后统计每种处理的芽正常萌发数。

[0101] 3、炼苗移栽

[0102] 同实施例2。

[0103] 二、实验结果及分析

[0104] 本实施例研究了各种消毒剂对外植体消毒的不同效果。从表8中可以看出，常用的次氯酸钠(5wt.％消毒20min、10wt.％消毒15min)和84(10wt.％消毒30min或15wt.％消毒20min)，即使高浓度消毒较长时间(超过15min)，外植体污染率仍很高，并不适于粗糠外植体的消毒，这也说明了粗槺树外植体消毒难度较大。

[0105] 从表8可以看出，采用0.1wt.％的氯化汞溶液的消毒效果明显优于高浓度的次氯酸钠和84，且0.1wt.％的氯化汞溶液的消毒时间十分关键，时间短污染率高，时间长褐化严重，死亡率高。其中，0.1wt.％的氯化汞溶液消毒8min后外植体的污染率最低，不超过30％，同时褐化情况也较轻；0.1wt.％的氯化汞溶液消毒6min后外植体的污染率最高，达到69％；0.1wt.％的氯化汞溶液消毒10min后外植体的污染率虽然仅为20％，但褐化比较严重，最后死亡，而且，消毒时间过长，对外植体的伤害非常大，严重影响生长分化。

[0106] 因此，采用体积分数为75％的酒精浸洗30s后采用0.1wt.％的氯化汞溶液消毒8min这一处理的消毒效果显著，污染率最低，外植体褐化情况较轻，适用于粗糠外植体的消毒。

[0107] 表8外植体消毒结果

[0108]

[0109] 实施例5

[0110] 一、实验过程

[0111] 1、外植体取材和消毒

[0112] (1)外植体采集：当年生春季4月初的幼嫩带芽茎段；

[0113] (2)外植体预处理：将当年生春季4月初的幼嫩带芽茎段用流水冲洗4h；其中，粗糠幼嫩带芽茎段的制备方法为：剪切粗糠枝条并剪去叶片，得到粗糠幼嫩带芽茎段，其中，每个粗糠幼嫩带芽茎段的长度为3‑4cm、带有2个芽；

[0114] (3)外植体消毒：用体积分数为75％的酒精浸洗30s，再用0.1wt.％的氯化汞溶液消毒8min，无菌水冲洗4次，采用无菌滤纸吸干表面水分并切去切口与消毒液的接触部分；

[0115] 2、接种和生根培养

[0116] 将步骤1消毒后的的外植体不进行分化培养，直接接种于生根培养基(WPM培养基+IBA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+AC 3g/L+琼脂4.9g/L，pH＝5.8)中，在室内培养温度为22～25℃，光照强度为1800～2400lx，每日光照12h的条件下培养；

[0117] 3、二次生根培养

[0118] 生根培养约50天后，可再次剪切茎段(长约3‑4cm)，进行二次生根培养，以扩大繁殖数量。

[0119] 4、炼苗移栽

[0120] 当步骤2生根培养或步骤3二次生根培养后的幼苗生有3‑4条3cm左右长的新根时，即可进行炼苗。具体方法为：将生根后的幼苗移至温室，置于自然光照下7‑10天，使幼苗健壮并木质化，壮苗后开瓶炼苗1‑2天，以便适应外界环境；移栽前用自来水洗净根部培养基，水流不能大，以防伤根；洗去根部培养基后，移栽到高锰酸钾消毒过的珍珠岩中，移栽后即时浇水；移栽后，要将环境湿度保持在80‑90％，环境温度控制在24℃±2℃，前期需要适当遮光，后期要多见阳光。

[0121] 二、实验结果及分析

[0122] 步骤2中生根培养第7天(图4A)，茎段伸长，生根培养20天开始生根，生根培养30天后，有数条不定根，最长约4cm(图4B)；生根培养40天后，根系发达，根增多增长，茎段伸长，生根率达100％(图4C)；图4D是生根培养约50天后，剪切无菌苗茎段进行二次生根培养后第30天的幼苗展示图，从图中可以看出，幼苗长势良好，长有数条不定根。

[0123] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。