一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法

摘要

本发明属于农业生物学技术领域，涉及一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法，该方法首先合成人工多肽，并将该人工多肽偶联到血蓝蛋白KLH上，以此为抗原对实验级日本大耳白兔和新西兰大白兔进行免疫，经过多次加强免疫后从兔子体内获得血清进行效价检测，效价达到预期目标后即可分离血清，提纯获得多克隆抗体；本发明获得的多克隆抗体特异性强，可用于免疫沉淀、免疫组化等分子生物学实验及相关研究，为深入研究植物细胞自噬相关机理提供了有力的工具。

权利要求

1.一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所采用的抗原为人工合成多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码该多肽的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）将5 mg人工合成多肽偶联到1 mg血蓝蛋白KLH；

（2）饲养实验级日本大耳白兔和新西兰大白兔各1只，待兔子长至1‑2kg时，用注射器将充分混匀的1mL完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.7 mg/mL的步骤（1）偶联后的多肽在每只兔子皮下注射第1针，标记为第1天；

（3）第12天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35 mg/mL的步骤（1）偶联后的多肽在兔子皮下注射第2针；

（4）第26天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35mg/mL的步骤（1）偶联后的多肽在兔子肌肉注射第3针；

（5）第40天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35 mg/mL的步骤（1）偶联后的多肽在兔子肌肉注射第4针；

（6）第54天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35 mg/mL的步骤（1）偶联后的多肽在兔子肌肉注射第5针；

（7）第66天，取兔子血清进行Western blot验证。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的完全弗氏佐剂为液体石蜡：羊毛脂的体积比为2:1的组合物。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的不完全弗氏佐剂为含有20mg/mL卡介苗的完全弗氏佐剂。

说明书

一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备

方法

技术领域

[0001] 本发明属于农业生物学技术领域，涉及一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法。

背景技术

[0002] 细胞自噬是一种进化上非常保守的溶酶体/液泡降解途径，对生物有机体适应各种生物或非生物胁迫，以及维持自身生长发育具有重要意义。在细胞自噬发生过程中，由于
自噬相关基因8(autophagy related gene 8，ATG8)的蛋白始终标记在自噬泡的膜状结构
上，所以被用作自噬检测的金标准。在所有植物中，目前只制备出了拟南芥抗内源性ATG8蛋
白的多克隆抗体，但其特异性较差，同时拟南芥的抗原序列至今未对外公开，更加限制了其
在检测植物ATG8基因表达中的广泛应用。由于缺乏特异性较好的ATG8抗体，致使小麦细胞
自噬研究进展相对缓慢。

[0003] 因此，能否提供一种具有较好特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8的多克隆抗体成为本领域亟待解决的问题。

发明内容

[0004] 针对现有技术中的上述情况，本发明的发明人提供了一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8的多克隆抗体制备方法，该方法首先合成人工多肽，并将其偶联到血蓝蛋白
KLH上，以此为抗原对实验级日本大耳白兔和新西兰大白兔进行免疫，经过多次加强免疫后
从兔子体内获得血清进行效价检测，效价达到预期目标后即可分离血清，提纯获得多克隆
抗体；本发明获得的多克隆抗体特异性强，可以用于免疫沉淀、免疫组化等分子生物学实验
及相关研究，为深入研究植物细胞自噬相关机理提供了有力的工具。

[0005] 本发明的具体技术方案如下：

[0006] 发明人首先利用小麦ATG8基因编码区N端第7‑24位共18个氨基酸的人工合成多肽作为抗原，由于这18个氨基酸组成的多肽具有亲水性，免疫原性较好，故选其做抗原；

[0007] 上述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码该多肽的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

[0008] 在上述人工合成多肽的基础上，发明人提供了一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法，具体操作步骤如下：

[0009] (1)将5mg人工合成多肽(KTEHPLERRQAESARIRE)偶联到1mg血蓝蛋白KLH(Keyhole Limpet Hemocyaninn)；

[0010] (2)饲养实验级日本大耳白兔和新西兰大白兔各1只，待兔子长至1‑2kg左右时，用注射器将充分混匀的1mL完全弗氏佐剂(液体石蜡：羊毛脂＝2:1)和1mL浓度为0.7mg/mL的
纯多肽在每只兔子皮下注射第1针，标记为第1天；

[0011] (3)第12天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂(完全弗氏佐剂+终浓度20mg/mL的卡介苗)和1mL浓度为0.35mg/mL的多肽在兔子皮下注射第2针；

[0012] (4)第26天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35mg/mL的多肽在兔子肌肉注射第3针；

[0013] (5)第40天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35mg/mL的多肽在兔子肌肉注射第4针；

[0014] (6)第54天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35mg/mL的多肽在兔子肌肉注射第5针；

[0015] (7)第66天，取兔子血清进行Western blot验证。

[0016] 其中，选择的两个种类的兔子都可以用来做抗体的，为了提高成功率，防止兔子在免疫过程中出现死亡，发明人选择了两只种类不同的兔子，本发明最终获得抗体的兔子选
自新西兰大白兔，免疫前需待兔子长至1‑2kg，同时生长状态良好的情况下方可免疫。

[0017] 与现有技术相比，本发明的特点在于选取了免疫原性好的抗原多肽序列，最终获得的多克隆抗体特异性强。上述获得的抗血清用上述多肽作抗原亲和纯化后，可得到浓缩
后的抗体；

[0018] 利用上述兔子多抗进行Western blot验证，具体是对小麦根、叶和种子蛋白进行了Western blot检测，结果显示制备的小麦ATG8抗体均能识别各个组织中的目的蛋白
ATG8，在上样1mg总蛋白的情况下，整张纤维素薄膜上只显示目的蛋白一条带，进一步证明
本发明制备的抗体特异性强，可以用于免疫沉淀、免疫组化等分子生物学实验及相关研究，
为深入研究植物细胞自噬相关机理提供了有力的工具，填补了本领域的空白。

附图说明

[0019] 图1为小麦根部抗体特异性检测电泳图，

[0020] 其中1为1mg总蛋白，2为0.4mg总蛋白，3为0.2mg总蛋白，4为marker；

[0021] 图2为小麦叶部抗体特异性检测电泳图，

[0022] 其中1为1mg总蛋白，2为0.4mg总蛋白，3为marker；

[0023] 图3为小麦种子抗体特异性检测电泳图，

[0024] 其中1为1mg济麦379总蛋白，2为1mg济麦70总蛋白，最右侧为marker；

[0025] 由图可知，本发明制备的小麦ATG8多克隆抗体能识别小麦各个组织中的目的蛋白ATG8，在上样1mg总蛋白的情况下，整张纤维素薄膜上只显示目的蛋白一条带，特异性强。

具体实施方式

[0026] 实施例1

[0027] 一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法，

[0028] 发明人首先利用小麦ATG8基因编码区N端第7‑24位共18个氨基酸的人工合成多肽作为抗原，由于这18个氨基酸组成的多肽具有亲水性，免疫原性较好，故选其做抗原；

[0029] 上述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码该多肽的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

[0030] 实施例2

[0031] 一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法，具体操作步骤如下：

[0032] (1)将5mg人工合成多肽偶联到1mg血蓝蛋白KLH；

[0033] (2)饲养实验级日本大耳白兔和新西兰大白兔各1只，待兔子长至1‑2kg时，用注射器将充分混匀的1mL完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.7mg/mL的纯多肽在每只兔子皮下注射第1
针，标记为第1天；

[0034] (3)第12天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35mg/mL的多肽在兔子皮下注射第2针；

[0035] (4)第26天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35mg/mL的多肽在兔子肌肉注射第3针；

[0036] (5)第40天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35mg/mL的多肽在兔子肌肉注射第4针；

[0037] (6)第54天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35mg/mL的多肽在兔子肌肉注射第5针；

[0038] (7)第66天，取兔子血清进行Western blot验证；

[0039] 其中所述的完全弗氏佐剂为液体石蜡：羊毛脂的体积比为2:1的组合物；不完全弗氏佐剂为含有20mg/mL卡介苗的完全弗氏佐剂。

[0040] 上述抗血清利用多肽KTEHPLERRQAESARIRE作为抗原亲和纯化获得纯化后的多抗，具体步骤可参考现有技术“多克隆抗体的制备,纯化及检测”，可参考如下公开文件：
https://wenku.baidu.com/view/07200936eefdc8d376ee320d.html。

[0041] 实施例3

[0042] 利用上述纯化后的兔子多抗进行Western blot验证，具体是对小麦根、叶和种子蛋白进行了Western blot检测，其中所选的小麦为鲁麦21和济麦70；

[0043] 在SDS胶浓度12.5％，电泳时间1.5h，电压100V，电流45mA；转膜时间2h，200V的实验条件下，结果如图1‑3所示，在总蛋白为1mg情况下，能够检测到根、叶片和种子部位表达
的ATG8蛋白，而且背景清晰，只显示目的条带，证明纯化的多抗具有非常强的特异性。

[0044] 普通小麦中共有8个ATG8蛋白多肽类型，对该抗体识别到的蛋白进行质谱鉴定，结果显示该抗体可识别小麦所有ATG8蛋白多肽类型，证明对各小麦品种都有较好的特异性。