牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用

摘要

本发明涉及食品检验技术领域，公开了一种牛源性成分定量分析标准质粒的制备方法，将beef基因与ref基因串联得beef‑ref基因，再将beef‑ref基因克隆入pUC 57质粒中，即得beef基因和ref基因含量为1:1的标准质粒；还公开了标准质粒，分析方法和应用。本发明本发明建立了深加工肉制品中牛源性成分定量分析的方法，能够定量分析样品中牛源性成分含量，满足了食品检测领域对肉制品中肉源性成分定量分析的需求，能够有效区分交叉污染、原料带入和恶意掺假，为市场监管提供了有力的技术支撑，进一步保障了肉制品食品安全。

权利要求

1.一种标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：将标准质粒转化入宿主细菌E .coli TOP10中，形成标准菌株；

S2：以标准质粒为模板，分别绘制beef基因标准曲线和ref基因标准曲线，beef基因标准曲线和ref基因标准曲线的制作方法均如下：将从步骤S1的标准菌株中提取的标准质粒

2 8

进行10倍系列稀释，形成10‑10 拷贝数/μl的7个浓度梯度的标准浓度样品作为模板，按照下表配制PCR扩增体系，并按照下表中的PCR扩增程序用SYBR green试剂进行PCR扩增，之后以靶基因拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，其中靶基因拷贝数通过数字PCR检测获得；

PCR扩增体系

PCR扩增程序

S3：以提取的标准样品DNA为模板，配置20μl如下反应体系对beef基因与ref基因含量进行RT‑PCR检测：SYBR green Mix 10μl，10μM上游引物1μl，10μM下游引物1μl，模板1μl，ddH2O 7μl；扩增程序见下表：之后根据步骤S2中绘制的标准曲线计算提取的标准样品中的beef基因与ref基因的相对含量，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，具体计算公式如下：p％＝k×(bt÷rt)×

100其中p％为样品中牛肉成分含量；k为校正系数；bt为样品中beef基因绝对拷贝数；rt为样品中ref基因绝对拷贝数；校正系数计算公式：k＝bs÷rs，其中bs为标准牛肉样品中beef基因绝对拷贝数，rs为标准牛肉样品中ref基因绝对拷贝数；

所述标准质粒的制备步骤如下：

将beef基因与ref基因串联得beef‑ref基因，beef‑ref基因的核苷酸序列见SEQ ID NO .1，利用EcoR I和Bgl II内切酶酶切beef‑ref基因和pUC 57质粒，再用T4 DNA连接酶将酶切后的beef‑ref基因与酶切后的pUC 57质粒连接，即得beef基因和ref基因含量为1:1的标准质粒，标准质粒的核苷酸序列见SEQ ID NO .2。

2.一种标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：将标准质粒转化入宿主细菌E .coli TOP10中，形成标准菌株；

S2：以标准质粒为模板，分别绘制beef基因标准曲线和ref基因标准曲线，beef基因标准曲线和ref基因标准曲线的制作方法均如下：将从步骤S1的标准菌株中提取的标准质粒

2 8

进行10倍系列稀释，形成10‑10 拷贝数/μl的7个浓度梯度的标准浓度样品作为模板，按照下表配制PCR扩增体系，按照下表中的PCR扩增程序用Taqman试剂进行PCR扩增，之后以靶基因拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，其中靶基因拷贝数通过数字PCR检测获得；

PCR扩增体系

PCR扩增程序

S3：以提取的标准样品DNA为模板，配置20μl如下反应体系对beef基因与ref基因含量进行RT‑PCR检测：Taqman master Mix 10μl，900nM上游引物1μl，900nM下游引物1μl，200nM探针1μl，模板1μl，ddH2O 6μl；扩增程序见下表：之后根据步骤S2中绘制的标准曲线计算提取的标准样品中的beef基因与ref基因的相对含量，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，具体计算公式如下：p％＝k×(bt÷rt)×100

其中p％为样品中牛肉成分含量；k为校正系数；bt为样品中beef基因绝对拷贝数；rt为样品中ref基因绝对拷贝数；校正系数计算公式：k＝bs÷rs，其中bs为标准牛肉样品中beef基因绝对拷贝数，rs为标准牛肉样品中ref基因绝对拷贝数；

所述标准质粒的制备步骤如下：

将beef基因与ref基因串联得beef‑ref基因，beef‑ref基因的核苷酸序列见SEQ ID NO .1，利用EcoR I和Bgl II内切酶酶切beef‑ref基因和pUC 57质粒，再用T4 DNA连接酶将酶切后的beef‑ref基因与酶切后的pUC 57质粒连接，即得beef基因和ref基因含量为1:1的标准质粒，标准质粒的核苷酸序列见SEQ ID NO .2。

3.一种标准质粒在制备检测肉制品中牛源性成分含量的试剂盒中的应用，其中所述应用为采用权利要求1‑2任一所述的标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法。

说明书

牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及食品检验技术领域，具体涉及牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用。

背景技术

[0002] 我国及欧盟食品标准均要求肉制品包装中应明确标识产品中动物源成分组成及含量，但市场上肉制品中动物源性成分含量虚标、掺假事件屡禁不止。肉制品掺假给消费者的身体健康(过敏反应)、宗教信仰等方面均带来了风险。在肉类掺假形式层出不穷的情势下，对动物源性成分定性、定量鉴别技术的研究成为食品安全领域的研究热点。

[0003] 目前使用的动物源性成分鉴定分析方法主要基于蛋白质和DNA分析。蛋白质分析技术包括免疫、色谱和质谱，肉制品加工过程中的热处理工艺、酸碱盐环境变化使蛋白质变性，生物活性丧失，很难满足检测的需要，且亲缘关系较近的物种蛋白质分析易出现交叉反应，限制了蛋白质分析技术在这一领域的应用。基于DNA分析的检测方法可以克服这些困难，DNA的热稳定性、酸碱稳定性优于蛋白质，并且DNA有更丰富的种间多态性，高温处理过的食品中仍能提取出片段化的DNA，在深加工肉制品的鉴别检测中DNA分析方法具有灵敏度高和特异性强的明显优势。但现行标准中的检测方法主要存在以下局限性：第一，只能进行定性检测，无法完成定量分析；第二，检测灵敏度过高，在检测过程中，无法排除在生产、储存、运输、销售等过程中样品交叉污染或原料带入所带来的阳性结果，很难为市场监管提供有力的技术支撑。

[0004] 现行检测技术无法定量分析样品中动物源性成分的根本原因在于检测使用的引物和探针是针对线粒体基因设计的。线粒体基因进化速度快，对物种的区分度较高，常用于物种的细致分类，研究生物的进化过程。但是，线粒体基因在不同组织细胞中拷贝数不同，因此针对线粒体DNA的检测方法只能进行定性检测，无法完成定量分析；线粒体的拷贝数普遍较高，以线粒体基因作为检测靶位进行检测时灵敏度过高，在检测过程中，无法区分产品交叉污染、原料带入和生产者恶意掺假造成的阳性检测结果。以细胞核染色体基因组中单拷贝基因作为检测靶位设计引物和探针，建立动物源性成分定量分析方法，可以克服现有定性检测方法的缺点。但已报道的定量分析方法存在以下不足，严重限制了这些方法的推广应用。第一，用于定量的基因拷贝数与样品质量分数之间的对应关系无法准确计算；第二，以质量分数计算样品中牛肉含量时要求DNA提取效率接近100％，但由于不同肉制品肉源性成分、加工工艺、原辅料不同，DNA提取效率很难达到100％；第三，定量过程需要绘制标准曲线，但无法获得定量准确的标准品。因此，建立基于细胞核染色体基因组中单拷贝基因的相对定量Q‑PCR方法对肉制品中动物源性成分进行定量分析，准确鉴别肉制品掺假，可为市场监管、执法检验提供可靠的技术支撑。

发明内容

[0005] 基于以上问题，本发明提供牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用，本发明可满足牛肉制品掺假鉴别的检测需求，有效区分交叉污染、原料带入和恶意掺假，为市场监管提供了有力的技术支撑，进一步保障了肉制品食品安全。

[0006] 为解决以上技术问题，本发明提供了以下技术方案：

[0007] 一种牛源性成分定量分析标准质粒的制备方法，步骤如下：将beef基因与ref基因串联得beef‑ref基因，beef‑ref基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.1，利用EcoR I和Bgl II内切酶酶切beef‑ref基因和pUC 57质粒，再用T4 DNA连接酶将酶切后的beef‑ref基因与酶切后的pUC 57质粒连接，即得beef基因和ref基因含量为1:1的标准质粒，标准质粒的核苷酸序列见SEQ ID NO.2。

[0008] 为解决以上技术问题，本发明还提供了标准质粒。

[0009] 为解决以上技术问题，本发明还提供了利用标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法，包括如下步骤：

[0010] S1：将标准质粒转化入宿主细菌E.coli TOP10中，形成标准菌株；

[0011] S2：配置20μl如下反应体系对提取的标准样品中的beef基因与ref基因含量进行数字PCR检测：不含dUTP的ddPCR Supermix for Probes 10μl，10μM上游引物1.8μl，10μM下游引物1.8μl，10μM探针0.5μl，模板1μl，ddH2O 4.9μl；数字PCR扩增程序见下表：

[0012]

[0013] 之后根据beef基因与ref基因的数字PCR绝对定量结果，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，计算公式如下：

[0014] p％＝bt÷rt×100

[0015] 其中p％为样品中牛肉成分含量；bt为样品中beef基因绝对拷贝数；rt为样品中ref基因绝对拷贝数。

[0016] 进一步的，步骤S2中提取的标准样品中beef基因和ref基因的的定量限均为100拷贝数/μl，检测限为10拷贝数/μl。

[0017] 为解决以上技术问题，本发明还提供了利用标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法，包括如下步骤：

[0018] S1：将标准质粒转化入宿主细菌E.coli TOP10中，形成标准菌株；

[0019] S2：以标准质粒为模板，分别绘制beef基因标准曲线和ref基因标准曲线，beef基因标准曲线和ref基因标准曲线的制作方法均如下：将从步骤S1的标准菌株中提取的标准2 8
质粒进行10倍系列稀释，形成10‑10拷贝数/μl的7个浓度梯度的标准浓度样品作为模板，按照下表配制PCR扩增体系，并按照下表中的PCR扩增程序用SYBR green试剂进行PCR扩增，之后以靶基因拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；

[0020] PCR扩增体系

[0021]

[0022] PCR扩增程序

[0023]

[0024] S3：以提取的标准样品DNA为模板，配置20μl如下反应体系对beef基因与ref基因含量进行RT‑PCR检测：SYBR green Mix 10μl，10μM上游引物1μl，10μM下游引物1μl，模板1μl，ddH2O 7μl；扩增程序见下表：

[0025]

[0026]

[0027] 之后根据步骤S2中绘制的标准曲线计算提取的标准样品中的beef基因与ref基因的相对含量，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，具体计算公式如下：

[0028] p％＝k×(bt÷rt)×100

[0029] 其中p％为样品中牛肉成分含量；k为校正系数；bt为样品中beef基因绝对拷贝数；rt为样品中ref基因绝对拷贝数；校正系数计算公式：k＝bs÷rs，其中bs为标准牛肉样品中beef基因绝对拷贝数，rs为标准牛肉样品中ref基因绝对拷贝数。

[0030] 为解决以上技术问题，本发明还提供了利用标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法，包括如下步骤：

[0031] S1：将标准质粒转化入宿主细菌E.coli TOP10中，形成标准菌株；

[0032] S2：以标准质粒为模板，分别绘制beef基因标准曲线和ref基因标准曲线，beef基因标准曲线和ref基因标准曲线的制作方法均如下：将从步骤S1的标准菌株中提取的标准2 8
质粒进行10倍系列稀释，形成10‑10拷贝数/μl的7个浓度梯度的标准浓度样品作为模板，按照下表配制PCR扩增体系，按照下表中的PCR扩增程序用Taqman试剂进行PCR扩增，之后以靶基因拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；

[0033] PCR扩增体系

[0034]

[0035] PCR扩增程序

[0036]

[0037] S3：以提取的标准样品DNA为模板，配置20μl如下反应体系对beef基因与ref基因含量进行RT‑PCR检测：Taqman master Mix 10μl，900nM上游引物1μl，900nM下游引物1μl，200nM探针1μl，模板1μl，ddH2O 6μl；扩增程序见下表：

[0038]

[0039] 之后根据步骤S2中绘制的标准曲线计算提取的标准样品中的beef基因与ref基因的相对含量，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，具体计算公式如下：

[0040] p％＝k×(bt÷rt)×100

[0041] 其中p％为样品中牛肉成分含量；k为校正系数；bt为样品中beef基因绝对拷贝数；rt为样品中ref基因绝对拷贝数；校正系数计算公式：k＝bs÷rs，其中bs为标准牛肉样品中beef基因绝对拷贝数，rs为标准牛肉样品中ref基因绝对拷贝数。

[0042] 为解决以上技术问题，本发明还提供了标准质粒在制备检测肉制品中牛源性成分含量的试剂盒中的应用。

[0043] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明建立了深加工肉制品中牛源性成分定量分析的方法，能够定量分析样品中牛源性成分含量，满足了食品检测领域对肉制品中肉源性成分定量分析的需求，能够有效区分交叉污染、原料带入和恶意掺假，为市场监管提供了有力的技术支撑，进一步保障了肉制品食品安全。

附图说明

[0044] 图1为本发明的实施例1、实施例2和实施例3中的定量分析方法技术路线图；

[0045] 图2为本发明的实施例1的ref引物和beef引物特异性扩增曲线及熔解度曲线图；

[0046] 图3为本发明的实施例1的Ct值比较法beef基因和ref基因扩增效率图；

[0047] 图4为本发明的实施例1的beef基因与ref基因串联策略示意图；

[0048] 图5为本发明的实施例2的beef基因和ref基因检测限(10copies/μl)DNA扩增及熔解度曲线图。

具体实施方式

[0049] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

[0050] 实施例1：

[0051] 本实施例以Genbank中普通牛(Bos taurus)肌肉生长抑制素基因(myostatin,GDF8)全长序列为模板，设计内参基因(ref)扩增引物。以牛科动物(Bovine)基因组中单拷贝环GMP磷酸二酯酶基因(cyclic GMPphosphodiesterase，PDE)非编码区为模板，设计牛肉特异性基因(beef)扩增引物。利用NCBI的BLAST工具对引物设计模板DNA序列进行比对分析，结果表明ref基因在100多种哺乳动物中广泛存在，beef基因在普通牛(Bos taurus)、瘤牛(Bos indicus)、牦牛(Bos mutus)、北美野牛(Bison)中均存在。将设计的引物输入Primer Premier6软件进行引物特异性验证，结果表明ref引物在肌肉生长抑制素基因全长序列中存在唯一的特异性结合位点，beef引物在环GMP磷酸二酯酶基因全长序列中存在唯一的特异性结合位点，表明本实施例设计的检测引物能够特异性扩增靶基因，符合实验要求。

[0052] 本实施例设计的内参ref基因及牛肉特异性beef基因扩增引物见表1：

[0053] 表1内参ref基因及牛肉特异性beef基因扩增引物

[0054]

[0055] 本实施例用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)，按照说明书操作分别提取黄牛肉、牦牛肉、水牛肉、麻辣牛肉、猪肉、羊肉、鸡肉、鸭肉基因组DNA。以提取的DNA为模板，用本实施例设计的引物分别进行PCR扩增，以验证本实施例设计的引物对靶基因的选择性。ref引物和beef引物的SYBR green试剂扩增曲线及熔解度曲线见附图2，结果表明，本实施例设计的beef引物能够特异性扩增黄牛肉、牦牛肉和麻辣牛肉基因组中的PDE基因，且未发现非特异性扩增；ref引物能够特异性扩增黄牛肉、牦牛肉、水牛肉、麻辣牛肉、猪肉、羊肉、鸡肉、鸭肉基因组中的GDF8基因，且未发现非特异性扩增。说明本研究设计的beef引物和ref引物能够特异性扩增靶基因，且靶基因在目标样品中存在，引物选择性符合实验要求。

[0056] 由于目前尚无用于构建标准定量准确的标准品，本研究前期设计拟采用不依赖标准曲线的Ct值比较法分析样品中beef基因和ref基因的相对含量。见附图3，通过PCR扩增体系优化，当PCR体系中引物为浓度900nM，探针浓度为200nM时，beef基因的扩增效率为96.537％，ref基因的扩增效率为96.721％。使用优化的PCR反应条件分别扩增牛肉含量为
50％的人工制备样品中beef基因和ref基因，比较两者Ct值，计算标准牛肉中牛源性成分含量。结果表明ref基因的量是beef基因的17倍，样品中牛源性成分含量为5.8％，实验结果不可靠。Ct值比较法的原理基础是beef基因和ref基因的Ct值之差ΔCt恒定不变。随着样品中牛肉含量的减少，beef基因减少，ref基因增加，导致ΔCt值随着牛肉含量的不同而变化，因此Ct值比较法用于相对定量分析结果不可靠，不能满足实验要求。

[0057] 前期实验数据表明本研究拟采用的不依赖标准曲线的Ct值比较相对定量分析方法不适用，因而本实施例改用标准曲线相对定量分析方法对肉制品中牛源性成分进行定量分析。由于目前尚无准确标定牛源性成分含量的标准物质，因而本实施例为制备用于绘制标准曲线的标准品，将beef基因和ref基因串联后得beef‑ref基因(图4)，beef‑ref基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.1，克隆入pUC 57质粒中，成功制备了beef基因和ref基因含量为1:1的标准质粒，标准质粒的核苷酸序列见SEQ ID NO.2，并将标准质粒转化入宿主细菌(E.coli TOP10)中形成了配套的标准菌株，见附图4，为本实施例的beef基因与ref基因串联策略示意图。

[0058] 标准质粒pUC57‑beef‑ref的构建及鉴定方法见下文。本实施例将含有载体质粒pUC57的宿主大肠杆菌Top10过夜培养后，按照质粒提取试剂盒说明书提取载体质粒pUC57。beef‑ref串联基因的双酶切体系如下：10×Q‑Cut Buffer 5μl，EcoR I 1μl，Bgl II 1μl，beef‑ref串联基因30μl，ddH2O 13μl，总体积50μl，混匀后置37℃酶切3h；取5μl酶切产物
1％琼脂糖凝胶电泳验证酶切效果；胶回收试剂盒纯化酶切后的beef‑ref串联基因；载体质粒pUC57的双酶切体系如下：10×Q‑Cut Buffer 5μl，EcoR I 1μl，Bgl II 1μl，pUC5730μl，ddH2O 13μl，总体积50μl，混匀后置37℃酶切3h；取5μl酶切产物1％琼脂糖凝胶电泳验证酶切效果；胶回收试剂盒纯化酶切后的pUC57载体；beef‑ref串联基因与pUC57载体的连接体系如下：beef‑ref基因7μl，pUC571μl，T4 DNAligase 1μl，10×T4 DNAligase buffer 1μl，总体积10μl，混匀后置16℃连接过夜。

[0059] 见附图1，利用本实施例构建的标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法(数字PCR法)，具体包括如下步骤：

[0060] S1：将标准质粒转化入宿主细菌E.coli TOP10中，形成标准菌株，具体方法如下：从‑80℃冰柜中取出大肠杆菌Top10感受态细胞，冰浴解冻；缓慢加入上述全部连接产物，混匀后冰上静置30min，42℃热激90s，取出置冰浴中静置2min；加入37℃预热的1ml LB液体培养基(不含Amp抗生素)，上下颠倒混匀后，置37℃、160rpm条件下振荡培养1h；取200μl转化的感受态细胞，涂布于含100μg/mlAmp的LB固体培养皿中(含X‑Gal)；37℃倒置培养，12h后观察结果；

[0061] pUC57‑beef‑ref质粒阳性转化子的鉴定：挑取白色单菌落于含100μg/mlAmp的液体LB培养基中，37℃摇床震荡过夜培养；离心收集部分菌体沉淀，按照质粒提取试剂盒说明书提取重组菌质粒；以提取质粒为模板，用beef上游引物和ref下游引物扩增beef‑ref串联基因；配制如下PCR扩增体系：SYBR green Mix10μl，10μM上游引物1μl，10μM下游引物1μl，模板1μl，ddH2O 7μl；之后用SYBR green试剂进行PCR扩增，扩增程序如下：55℃2min；95℃15s；95℃15s；95℃10min；60℃1min，信号采集，40循环；60℃1min，0.05℃/s升温至95℃，信号采集；将验证正确的重组质粒命名为pUC57‑beef‑ref，取部分交由上海生工公司测序鉴定；

[0062] S2：配置20μl如下反应体系对提取的标准样品中的beef基因与ref基因含量进行数字PCR检测：ddPCR Supermix for Probes(No dUTP)10μl，10μM上游引物1.8μl，10μM下游引物1.8μl，10μM探针0.5μl，模板1μl，ddH2O 4.9μl；数字PCR扩增程序见下表：

[0063]

[0064] 之后根据beef基因与ref基因的数字PCR绝对定量结果，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，计算公式如下：

[0065] p％＝bt÷rt×100

[0066] 其中p％为样品中牛肉成分含量；bt为样品中beef基因绝对拷贝数；rt为样品中ref基因绝对拷贝数。

[0067] 本实施例制备的标准质粒可应用于制备检测肉制品中牛源性成分含量的试剂盒中。

[0068] 本实施例使用天根生化科技(北京)有限公司的质粒小提试剂盒(DP103)，按照说明书操作提取构建的标准质粒，使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)，按照说明书操作分别提取黄牛肉、猪肉、羊肉、鸡肉、鸭肉基因组DNA。将提取的标准质粒及基因组DNA送生工生物工程(上海)股份有限公司进行数字PCR检测，准确标定beef基因和ref基因拷贝数，见表2，结果表明，猪肉(16.36％)、羊肉(10.62％)、鸡肉(2.34％)、鸭肉(3.51％)在销售或DNA提取过程中存在不同程度的牛肉基因组DNA污染，可作为牛肉低水平含量样品进行后续方法比对实验。

[0069] 表2标准质粒及样品基因组DNA数字PCR定标结果

[0070]

[0071] 实施例2：

[0072] 见附图1，本实施例利用实施例1中构建的标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法(SYBR green染料法)，具体包括如下步骤：

[0073] S1：将标准质粒转化入宿主细菌E.coli TOP10中，形成标准菌株，具体方法如下：从‑80℃冰柜中取出大肠杆菌Top10感受态细胞，冰浴解冻；缓慢加入上述全部连接产物，混匀后冰上静置30min，42℃热激90s，取出置冰浴中静置2min；加入37℃预热的1ml LB液体培养基(不含Amp抗生素)，上下颠倒混匀后，置37℃、160rpm条件下振荡培养1h；取200μl转化的感受态细胞，涂布于含100μg/mlAmp的LB固体培养皿中(含X‑Gal)；37℃倒置培养，12h后观察结果；

[0074] pUC57‑beef‑ref质粒阳性转化子的鉴定：挑取白色单菌落于含100μg/ml Amp的液体LB培养基中，37℃摇床震荡过夜培养；离心收集部分菌体沉淀，按照质粒提取试剂盒说明书提取重组菌质粒；以提取质粒为模板，用beef上游引物和ref下游引物扩增beef‑ref串联基因；配制如下PCR扩增体系：SYBR green Mix 10μl，10μM上游引物1μl，10μM下游引物1μl，模板1μl，ddH2O 7μl；之后用SYBR green试剂进行PCR扩增，扩增程序如下：55℃2min；95℃15s；95℃15s；95℃10min；60℃1min，信号采集，40循环；60℃1min，0.05℃/s升温至95℃，信号采集；将验证正确的重组质粒命名为pUC57‑beef‑ref，取部分交由上海生工公司测序鉴定；

[0075] S2：提取步骤S1中的标准菌株中的标准质粒，以标准质粒为模板，分别绘制beef基因标准曲线和ref基因标准曲线，beef基因标准曲线和ref基因标准曲线的制作方法均如2 8
下：将从步骤S1的标准菌株中提取的标准质粒进行10倍系列稀释，形成10‑10拷贝数/μl的
7个浓度梯度的标准浓度样品作为模板，按照表3配制PCR扩增体系，按照表4中的PCR扩增程序用SYBR green试剂进行PCR扩增，之后以靶基因拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；

[0076] 表3PCR扩增体系

[0077]

[0078] 表4PCR扩增程序

[0079]

[0080] S3：以提取的标准样品DNA为模板，配置20μl如下反应体系对beef基因与ref基因含量进行RT‑PCR检测：SYBR green Mix 10μl，10μM上游引物1μl，10μM下游引物1μl，模板1μl，ddH2O 7μl；扩增程序见下表：

[0081]

[0082]

[0083] 之后根据步骤S2中绘制的标准曲线计算提取的标准样品中的beef基因与ref基因的相对含量，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，具体计算公式如下：

[0084] p％＝k×(bt÷rt)×100

[0085] 其中p％为样品中牛肉成分含量；k为校正系数；bt为样品中beef基因绝对拷贝数；rt为样品中ref基因绝对拷贝数；校正系数计算公式：k＝bs÷rs，其中bs为标准牛肉样品中beef基因绝对拷贝数，rs为标准牛肉样品中ref基因绝对拷贝数。

[0086] 本实施例对上述方式制备的标准曲线的线性范围及线性进行了确认，利用上述方2
法绘制标准曲线，经6次实验分别统计beef基因和ref基因的相关系数(R)值评价标准曲线
2 2
性能。见表5，经检测，beef基因6次实验R 均值为0.9985，ref基因6次实验R 均值为0.9977，
2
标准曲线R总均值为0.9981，说明标准曲线性能符合实验要求。

[0087] 表5标准曲线线性性能统计

[0088]

[0089] 见附图5，标准曲线分析结果表明，在beef基因和ref基因DNA最低浓度为2
100copies/μl时标准曲线线性R 为0.9981，线性符合实验要求，故本方法定量限为
100copies/μl。当样品中beef基因和ref基因DNA浓度为10copies/μl时依然能够检测到DNA扩增，本方法检测限为10copies/μl。

[0090] 根据数字PCR定标结果，人工混合提取的DNA样品，制备牛肉含量分别为2.34％、3.51％、10.62％、16.36％、28.93％、40.17％、49.35％、80.28％的8份样品。采用前期研究确定的实验条件检测8份样品中牛肉含量，用beef基因含量为100.83％的标准牛肉样品校正测量值，每份样品重复6次测量，以校正测量值对约定参考值(牛肉理论含量)的偏差作为本方法正确度的评价指标。见表6，实验结果表明，各样品6次测量的偏差均值在1.88％～
7.68％之间，偏差总均值为4.78％，本方法正确度符合实验要求。

[0091] 根据数字PCR定标结果，人工混合提取的DNA样品，制备牛肉含量分别为2.34％、3.51％、10.62％、16.36％、28.93％、40.17％、49.35％、80.28％、100％的9份样品，采用本研究前期确定的实验条件，重复测量9份样品中beef基因和ref基因拷贝数，每份样品重复测量3次，每次3个平行，分别计算每次平行测量beef基因和ref基因拷贝数的相对标准偏差(RSD)及均值，评价本方法的重复性精密度。结果表明，beef基因的重复性测量精密度为
9.96％，ref基因的重复性测量精密度为9.29％，总平均重复性精密度为9.62％，本方法重复性精密度符合实验要求。

[0092] 根据数字PCR定标结果，人工混合提取的DNA样品，制备牛肉含量分别为2.34％、3.51％、10.62％、16.36％、28.93％、40.17％、49.35％、80.28％的8份样品，采用本研究前期确定的实验条件，重复测量8份样品中牛肉校正含量，每份样品重复测量3次，每次3个平行，计算每份样品牛肉校正含量的再现性测量相对标准偏差(RSD)及均值，评价本方法的再现性精密度。结果表明，本方法再现性精密度在7.9％～25.18％之间，平均再现性精密度为
17.60％，符合实验要求。

[0093] 表6 8份不同牛肉含量样品检测正确度结果统计

[0094]

[0095]

[0096] 以质量分数计算肉源性成分含量时，要求样品中靶标DNA充分提取，以便将靶标DNA拷贝数与肉源性成分质量进行换算。不同肉制品肉源性成分、加工工艺、原辅料不同，导致不同样品DNA提取效率不相同，需要复杂的样品前处理以充分提高DNA提取效率。深加工肉制品中基质成分复杂，样品前处理过程并不能完全消除基质对DNA提取的干扰。本研究建立的牛源性成分定量分析方法，通过计算细胞中beef基因和ref基因的相对含量，检测样品中牛肉源性成分含量，不要求100％的DNA提取效率，仅要求样品中不同肉源性成分DNA提取效率相同。基质对样品中所有肉源性DNA提取的干扰是等效的，当样品中牛肉DNA提取效率降低时，其他肉源性成分DNA的提取效率同时降低。本研究在鲜牛肉、香辣牛肉干中掺入不同比例的猪肉，制备牛肉含量为15％左右和85％左右的检测样品，由两名实验员，重复3次提取检测样品DNA，评价DNA提取效率对本方法的影响。实验结果表明，与鲜牛肉相比深加工手撕牛肉干(香辣味)样品的DNA提取效率显著降低，但对定量结果影响不显著；含有不同比例的猪肉成分样品DNA提取效率对定量结果影响不显著(表7)。基质对定量结果影响的总体偏差为12.73％，符合实验要求。

[0097] 表7不同牛肉含量样品DNA提取效率对结果的影响统计

[0098]

[0099] 本实施例为测试本方法对实际样品的检测能力，本实施例购买市售鲜牛肉(n＝13)、麻辣牛肉(n＝1)、牛排(n＝6)、牛肉粒(n＝5)、牛丸(n＝4)、牛肉卷(n＝1)样品共30份样品，用本方法对样品中牛源性成分含量进行定量检测分析。检测结果表明，13份牛肉样品中，当样品DNA提取效率太低(牛肉4、牛肉5、牛肉11)，beef基因拷贝数接近定量限时，定量结果不可靠；其余10份牛肉样品定量偏差≤25％。6份牛排样品中，有2份(牛排4、牛排5)牛肉含量＜50％，存在掺假问题。5份牛肉粒样品中，牛肉含量在4.57％～41.55％之间，均存在掺假问题。4份牛丸样品中，均不含有牛肉成分，存在掺假问题。1份牛肉卷样品中，牛肉含量为73.09％，有可能掺假。

[0100] 参考国际食品法典《检测、鉴定和量化食品中特定基因序列和蛋白质的执行标准和方法确认准则CAC/GL 74‑2010》、欧盟GMO网络实验室发布的(European Network ofGMO Laboratories,ENGL)《GMO检测分析方法最低性能要求‑2015(Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing‑2015)》和《GMO检测分析方法验证‑‑实验室内部方法确认第二版‑2017(Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods Version 2‑2017)》中关于PCR方法确认的指导原则，对本方法的检测限、定量限、选择性、正确度、重复性精密度、再现性精密度、线性范围、线性、DNA提取效率影响等方法学性能开展了方法确认研究，同时利用该方法对实际样品进行了检测。结果数据显示，本方法性能指标符合实验要求，样品检测结果稳定可靠，初步建立了深加工肉制品中牛源性成分定量分析方法。

[0101] 本实施例针对方法的选择性、检测限、定量限、正确度、重复性精密度、再现性精密度、线性范围、线性、DNA提取效率影响等方法学性能开展了方法确认研究，同时利用该方法对实际样品进行了检测。初步建立了深加工肉制品中牛源性成分定量分析方法，能够定量分析样品中牛源性成分含量，满足了食品检测领域对肉制品中肉源性成分定量分析的需求，能够有效区分交叉污染、原料带入和恶意掺假，为市场监管提供了技术支撑。

[0102] 实施例3：

[0103] 见附图1，本实施例利用实施例1中构建的标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法(Taqman探针法)，具体包括如下步骤：

[0104] S1：将标准质粒转化入宿主细菌E.coli TOP10中，形成标准菌株，具体方法如下：从‑80℃冰柜中取出大肠杆菌Top10感受态细胞，冰浴解冻；缓慢加入上述全部连接产物，混匀后冰上静置30min，42℃热激90s，取出置冰浴中静置2min；加入37℃预热的1ml LB液体培养基(不含Amp抗生素)，上下颠倒混匀后，置37℃、160rpm条件下振荡培养1h；取200μl转化的感受态细胞，涂布于含100μg/mlAmp的LB固体培养皿中(含X‑Gal)；37℃倒置培养，12h后观察结果；

[0105] pUC57‑beef‑ref质粒阳性转化子的鉴定：挑取白色单菌落于含100μg/mlAmp的液体LB培养基中，37℃摇床震荡过夜培养；离心收集部分菌体沉淀，按照质粒提取试剂盒说明书提取重组菌质粒；以提取质粒为模板，用beef上游引物和ref下游引物扩增beef‑ref串联基因；配制如下PCR扩增体系：SYBR green Mix10μl，10μM上游引物1μl，10μM下游引物1μl，模板1μl，ddH2O 7μl；之后用SYBR green试剂进行PCR扩增，扩增程序如下：55℃2min；95℃15s；95℃15s；95℃10min；60℃1min，信号采集，40循环；60℃1min，0.05℃/s升温至95℃，信号采集；将验证正确的重组质粒命名为pUC57‑beef‑ref，取部分交由上海生工公司测序鉴定；

[0106] S2：提取步骤S1中的标准菌株中的标准质粒，以标准质粒为模板，分别绘制beef基因标准曲线和ref基因标准曲线，beef基因标准曲线和ref基因标准曲线的制作方法均如2 8
下：将从步骤S1的标准菌株中提取的标准质粒进行10倍系列稀释，形成10‑10拷贝数/μl的
7个浓度梯度的标准浓度样品作为模板，按照表8配制PCR扩增体系，按照表9中的PCR扩增程序用Taqman试剂进行PCR扩增，之后以靶基因拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；

[0107] 表8PCR扩增体系

[0108]

[0109] 表9PCR扩增程序

[0110]

[0111] S3：以提取的标准样品DNA为模板，配置20μl如下反应体系对beef基因与ref基因含量进行RT‑PCR检测：Taqman master Mix 10μl，900nM上游引物1μl，900nM下游引物1μl，200nM探针1μl，模板1μl，ddH2O 6μl；扩增程序见下表：

[0112]

[0113] 之后根据步骤S2中绘制的标准曲线计算提取的标准样品中的beef基因与ref基因的相对含量，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，具体计算公式如下：

[0114] p％＝k×(bt÷rt)×100

[0115] 其中p％为样品中牛肉成分含量；k为校正系数；bt为样品中beef基因绝对拷贝数；rt为样品中ref基因绝对拷贝数；校正系数计算公式：k＝bs÷rs，其中bs为标准牛肉样品中beef基因绝对拷贝数，rs为标准牛肉样品中ref基因绝对拷贝数。

[0116] 本实施例对上述方式制备的标准曲线的线性范围及线性进行了确认，见表10，并对方法的选择性、检测限、定量限、正确度、重复性精密度、再现性精密度进行了分析，数据结果见表11。

[0117] 表10标准曲线线性性能统计

[0118]

[0119] 表11方法性能统计

[0120]

[0121]

[0122] 本实施例针对方法的选择性、检测限、定量限、正确度、重复性精密度、再现性精密度、线性范围、线性、DNA提取效率影响等方法学性能开展了方法确认研究。建立了深加工肉制品中牛源性成分定量分析方法，能够定量分析样品中牛源性成分含量，满足了食品检测领域对肉制品中肉源性成分定量分析的需求，能够有效区分交叉污染、原料带入和恶意掺假，为市场监管提供了技术支撑。

[0123] 如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。