水产品中三种常用麻醉剂的快速检测方法

摘要

本发明公开了一种水产品中三种常用麻醉剂的快速检测方法，属于检验技术领域。本发明利用单四级杆气质联用仪(GC‑MS)筛选、定量和确证，采用Thermo TG 1701MS毛细管柱为分析柱，在正离子选择离子监测模式(SIM)下建立测定水产品中丁香酚(Eugenol，CAS：97‑53‑0)、异丁香酚(Isoeugenol，CAS：97‑57‑1)、3‑氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐(MS‑222，CAS：886‑86‑2)三种麻醉剂含量的方法。方法检出限丁香酚和异丁香酚为25.0μg/kg、3‑氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐为50.0μg/kg。该检测方法较传统仪器分析方法更为简单快捷，且线性相关性良好、具有灵敏度高、抗基质干扰、高准确性和高稳定性的特点。

权利要求

1.水产品中三种常用麻醉剂的快速检测方法，所述的三种麻醉剂分别为3‑氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐、丁香酚和异丁香酚，方法包括下列步骤：第一步：从水产品中提取麻醉剂并进行净化，得到待测样液：

1)将均质样品置于第一离心管中，加入提取液，样品和提取液的质量体积比为1:6.5‑

7.5g/ml，所述提取液为乙腈：二氯甲烷体积比＝8.5:1.5‑7.5:2.5的混合液；提取液和样品混匀后超声提取5～8min，3000‑4000转/min离心5‑15min，移取上清液至第二离心管中；

2)液‑液萃取净化，包括下列步骤：

S1、向第二离心管清液中依次加入二氯甲烷，0.005‑0.015M的NaOH溶液，有机相中二氯甲烷含量大于35％，充分混合后静置；NaOH溶液的加入量为使上清液的pH为9‑12之间；

S2、3000‑4000转/min离心4‑10min；离心分层后用pH试纸测上层水相溶液，如pH接近中性，用0.05‑0.15M的NaOH溶液调节pH至9～10之间，并重新混合、离心；

S3、将步骤S2得到下层有机清液转到第四离心管中，该下层有机清液浓缩后为待测样液；

第二步：对第一步得到的待测样液采用单四级杆气质联用仪进行分析；

气相色谱分析条件为：色谱柱：Thermo TG 1701MS毛细管柱,30m×0.32mm×0.25μm；GC条件：载气：高纯氦气，纯度为99.9995％，恒流流速1.0mL/min；进样口温度：270℃；升温程序：初始温度为80℃，保持0.5min，然后以7℃/min升至122℃，保持15min，再以7℃/min升至

150℃，并保持8.5min，以35℃/min升至240℃，保持4min；进样方式：不分流；进样体积：1.0μL；

选择离子监测模式；离子源：EI源；离子源温度：270℃；离子化能量：70eV；溶剂延迟：

15.0min；传输线温度：260℃。

2.根据权利要求1所述的水产品中三种常用麻醉剂的快速检测方法，其特征在于：第一步所述的提取液为按体积比，乙腈：二氯甲烷＝8：2。

3.根据权利要求1所述的水产品中三种常用麻醉剂的快速检测方法，其特征在于：第一步从水产品中提取麻醉剂的方法包括：将1.00g均质样品置于第一离心管中，加入提取液

5mL，涡旋混匀后超声提取5～8min，3500转/min离心10min，移取上清液至第二离心管中，再向第一离心管加入提取液2mL，涡旋混匀后超声提取5～8min，3500转/min离心10min，合并上清液于第二离心管中，待液‑液萃取净化。

4.根据权利要求3所述的水产品中三种常用麻醉剂的快速检测方法，其特征在于：所述液‑液萃取净化包括下列步骤：

S1、向第二离心管清液中依次加入3.5mL二氯甲烷，0.01M的NaoH溶液2ml，充分混合后静置5min；

S2、3500转/min离心5min；离心分层后用pH试纸测上层水相溶液应为弱碱性，pH>9，如pH接近中性，用0.1M的NaoH溶液调节pH至9～10之间，并重新混合、离心；

S3、将上层水相溶液转到另外一支15mL塑料离心管中；下层有机清液转到15mL玻璃离心管中；

S4、向装上层水相溶液塑料离心管中加入4mL二氯甲烷，充分混合后静置3min，3500转/min离心3min，用一次性塑料吸管去掉上层水相；合并下层有机相清液于玻璃离心管中。

5.根据权利要求4所述的水产品中三种常用麻醉剂的快速检测方法，其特征在于：还包括如下步骤：

S5、用氮吹仪40℃加热，氮气吹到1mL，加入2ug/mL内标液200uL，用乙酸乙酯定容到

2mL，涡旋混合后过0.22μm有机微孔滤膜，滤液采用单四级杆气质联用仪进行分析。

6.根据权利要求5所述的水产品中三种常用麻醉剂的快速检测方法，其特征在于：内标液为甲基丁香酚和甲基‑3‑氨基苯甲酸酯的混合物。

说明书

水产品中三种常用麻醉剂的快速检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于产品安全与检测技术领域，具体涉及一种水产品中三种常用麻醉剂的快速检测方法。

背景技术

[0002] 随着人们生活水平提高，对鲜活水产品需求日益增加。长途运输活体水产品，容易导致活体水生动物产生应激反应，出现碰伤及大量死亡现象。运输过程对活体水生动物进
行麻醉是提高运量和成活率的有效手段，因此在流通过程使用麻醉剂已成为常态。欧盟、美
国、日本、韩国、澳大利亚、新西兰、智利等国均批准了几种麻醉剂用于食用水产品。目前，国
外批准使用的麻醉剂有：3‑氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐(MS222)、丁香酚(Eugenol)和异丁
香酚(Isoeugenol)。MS222麻醉效果好、代谢速度快，多数国家均允许使用；异丁香酚是许多
商品渔用麻醉剂的主要成分；丁香酚以其高效、低价、方便购买的特点在国内水产运输领域
广泛使用。当前我国尚未批准麻醉剂用于食用水产品，也未制定相关限量标准。水产经销商
在使用上往往是凭经验，只要不造成大量死亡，并不顾及使用量。活体水产品运输到达目的
地后，销售商也只等到鱼、虾苏醒就进行销售，没有进行必要的停药期暂养，卖到消费者手
中的活鱼体内仍然有较高麻醉剂残留。

[0003] 因此，需要开发制定水产品中麻醉剂的高效检测方法，以便为相关科研工作提供检测手段，还可为行业主管部门掌握水产品中麻醉剂残留状况，开展渔用麻醉剂风险管理
提供技术支持。

[0004] CN 202010138679.6公开了一种快速检测水产品中丁香酚类麻醉剂的方法，包括分离液制备、待测液制备、烯烃双键结构检测、生成氨基甲酸酯结构及其检测和判定，利用
高锰酸钾的显色反应、转化生成氨基甲酸酯结构、检测氨基甲酸酯结构来判定水产品中是
否含有丁香酚类麻醉剂。本发明在不使用大型仪器的情况下，可以准确检测水产品中是否
添加丁香酚类麻醉剂。该发明的不足在于三个方面：(1) 利用显色反应进行检测，需要目标
物的浓度水平较高，难以实现高灵敏度的检测，该专利中未提及方法灵敏度的具体数值。
(2)依据该检测方法原理，实际为检测提取液中烯烃双键结构的化合物，而烯烃双键结构并
非丁香酚所特有，因此该方法在低浓度水平容易产生假阳性。(3)MS222是目前国际允许使
用范围最广的麻醉剂，该方法不能检测该化合物。

[0005] CN 201811030195.9本发明公开了一种水产品中七种麻醉剂分析快速检测方法，属于检验技术领域。利用三重四级杆气质联用质谱(GC‑MS/MS)筛选、定量和确证的原理，采
用硅胶固相萃取柱，HP‑5MSUI 毛细管柱为分析柱，在电喷雾正离子多反应监测模式(MRM)
下建立测定水产品中丁香酚、甲基丁香酚、异丁香酚、乙酸丁香酚酯、甲基异丁香酚、乙酸异
丁香酚酯和三卡因7种麻醉剂的方法。该检测方法较传统仪器分析方法更为简单快捷，且线
性相关性良好、检出限低至2.0μg/kg、具有灵敏度高、抗基质干扰、高准确性和高稳定性的
特点。该发明的不足在两个方面：(1)前处理过程采用硅胶固相萃取柱，操作较为繁琐，短时
间内难以实现大批量样品前处理。(2)三重四级杆气质联用质谱仪设备昂贵，在科研和检测
机构配备并不普及，方法难以推广使用。

发明内容

[0006] 本发明目的在于提供采用水产品中三种常用麻醉剂的快速检测的方法。

[0007] 为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种采用单四级杆气质联用仪检测水产品中三种麻醉剂的方法，所述的三种麻醉剂分别为3‑氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐、丁
香酚和异丁香酚，方法包括下列步骤：

[0008] 第一步：从水产品中提取麻醉剂并进行净化，得到待测样液；

[0009] 1)将均质样品置于第一离心管中，加入提取液，样品和提取液的质量体积比为1:6.5‑7.5g/ml，所述提取液为乙腈：二氯甲烷体积比＝8.5:1.5‑7.5:2.5的混合液；提取液和
样品混匀后超声提取5～8min，3000‑4000转 /min离心5‑15min，移取上清液至第二离心管
中；

[0010] 2)液‑液萃取净化，包括下列步骤：

[0011] S1、向第二离心管清液中依次加入二氯甲烷，0.005‑0.015M的NaOH溶液，充分混合后静置；二氯甲烷的加入量为使上清液中有机相中二氯甲烷含量超过35％，NaOH溶液的加
入量为使上清液的pH为8‑12之间；

[0012] S2、3000‑4000转/min离心4‑10min；离心分层后用pH试纸测上层水相溶液，如pH接近中性，用0.05‑0.15M 的NaOH溶液调节pH至9～10之间，并重新混合、离心；

[0013] S3、将步骤S2得到下层有机清液转到第四离心管中，该下层有机清液为待测液；

[0014] 第二步：对第一步得到的待测样液采用单四级杆气质联用仪进行分析。

[0015] 优选的技术方案为：所述提取液为：乙腈+二氯甲烷＝8+2(V/V)。

[0016] 优选的技术方案为：从水产品中提取麻醉剂的方法的第一步1)中，包括：将1.00g均质样品置于第一离心管中，加入提取液5mL，涡旋混匀后超声提取5～8min，3500转/min离
心10min，移取上清液至第二离心管中，再向第一离心管加入提取液2mL，涡旋混匀后超声提
取5～8min，3500rp转/min离心10min，合并上清液于第二离心管中，用于液‑液萃取净化。

[0017] 优选的技术方案为：第一步2)中，所述液‑液萃取净化包括下列步骤：

[0018] S1、向第二离心管清液中依次加入3.5mL二氯甲烷，0.01M的NaoH溶液2ml，充分混合，静置5min。

[0019] S2、3500转/min离心5min。离心分层后用pH试纸测上层溶液应为弱碱性(pH>9，如pH接近中性，用0.1M的NaoH溶液调节pH至9～10之间，并重新混匀离心)；

[0020] S3、将上层水相溶液转到另外一支15mL塑料离心管中。下层有机清液转到15mL玻璃离心管中；

[0021] S4、向装上层水相溶液塑料离心管中加入4mL二氯甲烷，充分混合后静置3min，3500转/min 离心3min，用一次性塑料吸管去掉上层水相，合并下层有机相清液于玻璃离心
管中.

[0022] 优选的技术方案中，第一步2)中，还包括如下步骤：S5、用氮吹仪40℃加热，氮气吹到1mL 左右，加入2ug/mL内标液200uL(乙酸乙酯稀释)，用乙酸乙酯定容到2mL，涡旋混合后
过0.22μm有机微孔滤膜，滤液采用单四级杆气质联用仪进行分析。

[0023] 优选的技术方案为：所述液‑液萃取采用二氯甲烷和0.01M的NaoH溶液，萃取时水相pH>9；

[0024] 优选技术方案为：所述内标液为甲基丁香酚和3‑氨基苯甲酸酯的混合物.

[0025] 优选技术方案为：液‑液萃取时，有机相中二氯甲烷含量大于35％；例如40％，45％，50％， 60％，70％。优选为35‑50％。

[0026] 优选的技术方案为：气相色谱分析条件为：色谱柱：Thermo TG 1701MS毛细管柱 (30m×0.320mm×0.25μm)；GC条件：载气：高纯氦气(99.9995％)，恒流流速1.0mL/min；进样
口温度：270℃；升温程序：初始温度为80℃，保持0.5min，然后以7℃/min升至122℃，保持
15min，再以7℃/min升至 150℃，并保持8.5min，以35℃/min升至240℃，保持4min；进样方
式：不分流；进样体积：1.0μL。

[0027] 优选的技术方案为：单四级杆气质联用仪分析条件为：选择离子监测模式；离子源：EI源；离子源温度：270℃；离子化能量：70eV；溶剂延迟：15.0min；传输线温度：260℃。

[0028] 由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

[0029] 1、本发明对水产品中三种麻醉剂残留检测的前处理，采用小体积液‑液萃取的净化方式，操作简便、快速。避免使用成本较高、操作繁琐的固相萃取柱，对大批量样品的检
测，周期短、成本低。

[0030] 2、本发明同时对水产品中三种麻醉剂残留检测，采用单四级杆气质联用仪进行分析。避免使用价格昂贵的串联四级杆质谱仪进行检测。单四级杆质谱仪在开展渔用麻醉剂
相关研究的大多数科研部门和检测机构均配备，该方法较易推广使用。

[0031] 3.采用乙腈与二氯甲烷体积比例为8:2作为提取液提取三种麻醉剂，不仅能克服分层时凝胶层形成，同时提取液的极性也兼顾到丁香酚、异丁香酚与MS222的差别，提取效
率高；

[0032] 4.液‑液萃取时，有机相中二氯甲烷含量大于35％，能实现有效分层。

[0033] 5.pH>8的环境条件能有效抑制MS222进入水相，因此控制分层时水相pH>9。

附图说明

[0034] 下面结合附图和实施例对本发明 作进一步说明。

[0035] 图1为单四级杆气质联用仪检测三种麻醉剂标准溶液总离子流图

[0036] 图2为单四级杆气质联用仪检测三种麻醉剂标准溶液选择离子流图

[0037] 图3为四级杆气质联用检测水产品中三种麻醉剂选择离子流图(空白鱼肉基质理论定量限水平添加)

具体实施方式

[0038] 以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

[0039] 下述实施例中所用的器材、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0040] 实施例1：单四级杆气质联用仪检测水产品中三种常用麻醉剂的方法

[0041] 1材料与方法

[0042] (1)仪器与试剂

[0043] 单四级杆气质联用仪(Thermofisher DSQ)；氮吹仪(天津恒奥HGC‑24)；涡旋混合器(IKA MS2)；离心机(北京医用)；超纯水器Milli‑Q(Milliporeco)；电子天平(METTLER)。

[0044] 标准品:丁香酚(Eugenol，CAS：97‑53‑0，纯度99.5％)，甲基丁香酚(Methyl eugenol，CAS：93‑15‑2，纯度99.5％)，异丁香酚(Isoeugenol，CAS：97‑57‑1，纯度98.8％)，
购自Dr.Ehrenstorfer；3‑氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐(MS‑222，CAS：886‑86‑2，纯度98％)，
3‑氨基苯甲酸酯(Methyl‑3‑aminobenzoate，CAS： 4518‑10‑9，纯度98.5％)购自Merck；乙
腈、二氯甲烷、乙酸乙酯为色谱纯，NaoH为分析纯，所有用水均为超纯水。

[0045] (2)溶液配制

[0046] 标准储备溶液(1000μg/mL)：准确称取丁香酚、异丁香酚、3‑氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐、甲基丁香酚、3‑氨基苯甲酸甲酯标准品各10.0mg，分别用乙腈溶解后定容至10mL，
配置成1000μg/mL标准储备溶液，置于‑18℃冰箱冷藏保存。

[0047] 标准稀释溶液(10.0μg/mL)：准确吸取100μL丁香酚、异丁香酚、3‑氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐等三种麻醉剂标准储备溶液，用乙酸乙酯定容至10mL，配置成10.0μg/mL标准稀
释溶液，置于4℃冰箱冷藏保存。

[0048] 内标稀释溶液(10.0μg/mL)：准确吸取100μL甲基丁香酚、3‑氨基苯甲酸甲酯两种麻醉剂标准储备溶液，用乙酸乙酯定容至10mL，配置成10.0μg/mL内标稀释溶液，置于4℃冰
箱冷藏保存。

[0049] 提取液：将400mL乙腈与100mL二氯甲烷混合。

[0050] (3)前处理方法

[0051] 称取1.00g均质样品置于第一离心管中，加入提取液5mL，涡旋混匀后超声提取5min，再3500 转/min离心10min，离心结束后移取上清液至第二离心管中，再向第一离心管
加入提取液2mL，涡旋混匀后超声提取5min，3500转/min离心10min，合并上清液于第二离心
管中，待液‑液萃取净化。

[0052] 向第二离心管清液中依次加入3.5mL二氯甲烷，0.01M的NaoH溶液2ml，充分混合后静置5min， 3500转/min离心5min。离心分层后用pH试纸测上层水相溶液应为碱性(pH>9，如
pH接近中性，用0.1M 的NaoH溶液调节pH至9～10之间，并重新混匀、离心)；将上层水相溶液
转到另外一支15mL塑料离心管中，下层有机清液转到15mL玻璃离心管中；向装上层水相溶
液塑料离心管中加入4mL二氯甲烷，充分混合后静置3min，3500转/min离心3min，用一次性
塑料吸管去掉上层水相，合并下层有机相清液于玻璃离心管中；用氮吹仪40℃加热，氮气吹
到1mL左右，加入2ug/mL内标液200uL(乙酸乙酯稀释)，用乙酸乙酯定容到2mL，涡旋混合后
过0.22μm有机微孔滤膜，得到的滤液采用单四级杆气质联用仪进行分析。

[0053] (4)仪器条件

[0054] 气相色谱条件：色谱柱：Thermo TG 1701MS毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)；GC条件：载气：高纯氦气(99.9995％)，恒流流速1.0mL/min；进样口温度：270℃；升温程序：初
始温度为80℃，保持0.5min，然后以7℃/min升至122℃，保持15min，再以7℃/min升至150
℃，并保持8.5min，以35℃/min升至240℃，保持4min；进样方式：不分流；进样体积：1.0μL。

[0055] 单四级杆质谱条件：选择离子监测模式；离子源：EI源；离子源温度：270℃；离子化能量：70eV；溶剂延迟：15.0min；传输线温度：260℃。监测离子如表1所示

[0056] 表1三种麻醉剂及其内标的监测离子

[0057]

[0058]

[0059] 注：*为定量离子Note:*Quantitative Ion。

[0060] 2、结果

[0061] 2.1总离子流图

[0062] 在上述仪器条件下，三种麻醉剂总离子流图见图1。从图中可以看出目标化合物不仅达到完全分离，峰形良好，而且保留时间合理，在目标物出峰处无杂质干扰。

[0063] 2.2专属性分析

[0064] 三种麻醉剂和两种内标在选择离子监测(SIM)模式下质谱图见图2。在本实验条件下质谱数据采用分段选择离子监测模式，根据目标物出峰时间分成5段，缩短扫描所需的循
环时间，使每个峰上得到的数据点数增多，确保了结果的稳定性和灵敏度。35min后将柱温
快速提升到240℃，使柱内高沸点的杂质残留流出，避免杂质干扰下一个样品分析。由各目
标物的选择离子流(SIM)图谱可以看出，虽然不同目标物有相同的监测离子，但是它们色谱
保留时间相差较大，不影响各目标物的定性和定量。

[0065] 2.3线性关系和检出限、定量限

[0066] 标准溶液按(4)中仪器条件进行分析，以目标物浓度为横坐标，其峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数(详见表2)。其相关系数R均大于0.999，说明在
0.005～1.0μg/mL范围内三种麻醉剂的浓度和峰面积线性关系良好。

[0067] 依据定量离子色谱峰的信噪比(S/N)大于10为，且回收率、相对标准偏差在范围内确定为本方法的定量限(LOQ)，丁香酚和异丁香酚为25.0μg/kg、MS222为50.0μg/kg；定量离
子色谱峰的信噪比(S/N)大于3为检出限(LOD)，丁香酚和异丁香酚为10.0μg/kg、MS222为
20.0μg/kg。图3为空白鱼肉基质理论定量限水平添加，各样品中目标物出峰位置附近并没
有杂质峰干扰且峰型良好，因此能够进行定性及定量。

[0068] 表2三种麻醉剂线性回归方程

[0069]

[0070] 2.4准确度及精密度

[0071] 分别对鲈鱼、鳗鲡、南美白对虾和青蟹基质，在空白样品中添加待测物，使丁香酚和异丁香酚的理论含量为25.0μg/kg、100.0μg/kg和250.0μg/kg；MS222的理论含量为50.0μ
g/kg、200.0μg/kg和500.0μg/kg 经上述实验步骤处理后，对3个水平进行回收率测试(见表
3)，每种空白基质、每个浓度平行测定6次，分别考察6天。以相对标准偏差(RSD)计算批内和
批间精密度。结果表明，方法的回收率在80.8％～109％之间，相对标准偏差在3.24％～
14.2％之间，满足GB/T27404‑2008要求，说明本方法的准确度和精密度较高，可以满足检测
需求。

[0072] 表3不同基质空白样三种麻醉剂回收率和精密度

[0073]

[0074] 丁香酚、异丁香酚与MS222极性差别大，如果用极性比较弱的二氯甲烷提取，MS222回收偏低；用极性较强的甲醇提取，又无法分层萃取净化。采用纯乙腈提取，可以通过加入
二氯甲烷使得有机相能与水相分层。但完全采用纯乙腈提取，液‑液分层萃取时某些种类的
水产品在两相间会产生很厚的凝胶层，影响目标物的回收率。分别采用乙腈与二氯甲烷体
积比为：9:1、8:2、7:3、6:4四种比例的混合液超声萃取。结果表明，采用乙腈与二氯甲烷体
积比例为8:2比较合适，不仅能克服分层时凝胶层形成，同时提取液的极性也兼顾到丁香
酚、异丁香酚与MS222的差别，提取效率高。

[0075] 液‑液萃取过程需确保机相(乙腈+二氯甲烷)和水相分层，二氯甲烷与乙腈的比例很重要。实验结果表明，有机相中二氯甲烷含量超过35％，能实现有效分层。本实施例中，提
取时用7mL的提取液(二氯甲烷为1.4mL)，液‑液净化时加入3.5mL的二氯甲烷，有机相总体
积为10.5mL，二氯甲烷体积为4.9mL，二氯甲烷在有机相中含量约为46％，确保分层效果。

[0076] 液‑液萃取过程中水相pH值对目标物回收率影响大。丁香酚和异丁香酚在弱酸、碱环境下不易电离，而MS222在中性和酸性环境中都会因电离进入到水相。液‑液萃取过程中，
水相分别采用pH＝5、6、7、 7.6、8、9、10、11、12的溶液，加入标准品，测定有机相中三种麻醉
剂的浓度。结果表明，pH在5～12 之间，丁香酚和异丁香酚都保留在有机相中；酸性和中性
条件下MS222会部分进入到水相中，pH>8的环境条件能有效抑制MS222进入水相，因此控制
分层时水相pH>9。

[0077] 本实施例基于单四级杆气相色谱质谱联用技术，采用选择离子监测模式，根据保留时间、特征离子及其丰度比可对鱼、虾、蟹等水产品中三种麻醉剂同时进行筛选、定量和
确证，具有灵敏度高、抗基质干扰、高准确性和高稳定性的特点，能满足水产品中丁香酚、异
丁香酚和MS‑222麻醉剂残留量检测要求，对保障消费者健康，维护我国水产品行业安全具
有一定的意义。