一种细胞色素氧化酶突变体及其应用

摘要

本发明涉及一种细胞色素氧化酶突变体及其应用，本发明首次将CYP153A M.aq.中229位置的丙氨酸突变为丝氨酸，利用该突变酶将癸酸转化为10‑羟基癸酸，提高了癸酸的转化率，为10‑羟基癸酸的工业化生产奠定了基础。

权利要求

1.一种细胞色素氧化酶CYP153A M. aq.的突变体A229S的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

2.一种细胞色素氧化酶CYP153A M. aq.的突变体A229S，其特征在于，所述突变体A229S的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

3.一种包含权利要求1所述突变酶的编码基因的重组表达载体。

4.一种包含权利要求1所述突变酶的编码基因的重组菌株。

5.权利要求3所述重组表达载体或权利要求4所述重组菌株在制备细胞色素氧化酶CYP153A M. aq. 的突变体A229S的应用。

6.权利要求2所述细胞色素氧化酶CYP153A M. aq. 的突变体A229S在制备10‑羟基癸酸中的应用。

7.如权利要求6所述应用，其特征在于，细胞色素氧化酶CYP153A M. aq. 的突变体A229S生产10‑羟基癸酸的方法，包括如下步骤：（1）构建重组质粒pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3；

所述CYP153A A229S‑CPRBM3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

（2）利用步骤(1) 制得的重组质粒pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，构建大肠杆菌BL21（DE3）pET21b‑CYP153A A229S ‑CPRBM3，工程菌经筛选，诱导培养，制得诱导细胞；

（3）将步骤（2）制得的诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向大肠杆菌BL21（DE3） pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3静息细胞中加入癸酸，培养制得10‑羟基癸酸。

8.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述步骤（1）中，构建重组质粒pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3，包括如下步骤：以经过密码子优化的海杆菌(Marinobacter aquaeolei) 的烷烃羟化酶CYP153A与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) P450 NADH还原酶CPRBM3的融合酶基因为模板进行PCR扩增，CYP153A的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，CPRBM3的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，然后将pET21b质粒用Nde I和Xho I进行双酶切，经多片段无缝克隆试剂盒连接，制得重组质粒pET21b‑CYP153A‑CPRBM3；以重组质粒pET21b‑CYP153A‑CPRBM3为模板进行反向PCR扩增pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；扩增完成的pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3 PCR产物经过Dpn I酶去除原始的模板，再将其转化到大肠杆菌感受态中使其环化，得到重组质粒pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3；

PCR扩增体系如下，总体系25μL：

100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μL phanta酶12.5μL，ddH2O 

9.5μL；

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸4min30s ，循环30次；72℃延伸

5min。

9.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述步骤（2）中，筛选为将转化后的大肠杆菌工程菌接入含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，在35～40℃振荡筛选培养至菌液OD600为0.8～1.2。

10.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述步骤（2）中，诱导培养为将筛选培养的菌液降温至18～20℃适应0.5～1小时后，加入IPTG使培养基中IPTG浓度为0.5mM、加入终浓度

0.5mM的FeCl3、终浓度0.5mM的5‑氨基乙酰丙酸盐酸盐继续诱导培养18小时，分离细胞，制得诱导细胞。

11.如权利要求10所述应用，其特征在于，所述步骤（2）中，分离细胞为在5000rpm条件下离心15min,收集沉淀，然后用质量百分比浓度为0.85％的盐水洗涤。

12.如权利要求7所述应用，其特征在于，步骤（3）中向大肠杆菌BL21（DE3） pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3静息细胞中加入癸酸至浓度为0.3‑0.7g/L，在28‑37℃条件下反应2‑

8h，制得10‑羟基癸酸。

13.如权利要求12所述应用，其特征在于，所述步骤（3）中，癸酸转化浓度为0.5g/L。

14.如权利要求13所述应用，其特征在于，步骤（3）中向大肠杆菌BL21 （DE3）pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3静息细胞中加入癸酸至浓度为0.5g/L，在30℃条件下反应2h，制得

10‑羟基癸酸。

15.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述步骤（3）中的转化培养基组分如下：甘油按质量分数计0.8～1.2％, 葡萄糖按质量分数计0.3～0.5％，氨苄青霉素100μg/mL，余量溶剂为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液。

16.如权利要求15所述应用，其特征在于，所述步骤（3）中，转化培养基组分如下：甘油按质量分数计1％, 葡萄糖按质量分数计0.4％,氨苄抗生素100μg/mL，余量溶剂为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液。

17.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述步骤（3）中，转化培养条件为在29～31℃条件下培养8小时。

18.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述步骤（3）中，癸酸溶解于二甲基亚砜。

说明书

一种细胞色素氧化酶突变体及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种细胞色素氧化酶突变体及其应用。

背景技术

[0002] 10‑羟基癸酸(10‑hydroxydecanoic acid)是一种同时含有羟基和羧基的饱和脂肪酸，10‑羟基癸酸是化妆品、医药产品和保健品行业的重要原料和中间体，可直接添加在化妆品中作为皮脂分泌抑制剂。此外10‑羟基癸酸也是高效抗氧化剂和制取蜂王浆中抗菌、抗癌和抗辐射的有效成分蜂王酸的重要原料。另外10‑羟基癸酸还应用在电子行业。因此10‑羟基癸酸具有诱人的开发应用前景和巨大的经济效益。

[0003] 鉴于10‑羟基癸酸广泛而重要的应用价值，寻找10‑羟基癸酸高效方便、低成本生产方法的研究被广泛重视。目前10‑羟基癸酸的生产方法主要是化学合成法，由10‑十一炔醇、正癸酸、蓖麻油经化学方法合成。但是化学方法存在成本高，过程复杂，操作困难以及对环境有污染等缺点，而酶法生产10‑羟基癸酸具有较高的特异性和快速温和等特点，已经成为研发10‑羟基癸酸工业化生产的热点并作为短期可见效的可行性途径之一。

[0004] 细胞色素氧化酶(cytochromeP450或CYP450)简称P450酶，细胞色素P450酶(cytochrome P450 enzymes)是一类含有B型血红素(heme B)的蛋白超家族，血红素作为P450酶的辅基与绝对保守的半胱氨酸相连，使得其还原态与一氧化碳结合时在450nm处产生特征吸收峰而得名。P450酶广泛分布于自然界不同阶元的生命体中，包括人类、动物、植物、微生物，甚至病毒等，在自然界中P450酶主要参与人体对药物和毒素的代谢反应、植物及微生物次级代谢产物的生物合成过程、以及一些微生物降解途径等；其催化反应类型多达20余类，如羟化、环氧化、脱烷基化、碳‑碳偶联、氧化裂解等。细胞色素P450酶能在温和条件下催化复杂化合物中惰性C‑H键的区域和立体选择性氧化反应，具有化学氧化难以比拟的优势，因而被广泛用于生产药物、维生素、香料、杀虫剂等高附加值产品。

[0005] 来自Marinobacter aquaeolei的CYP153A(CYP153A M.aq.)底物范围较广，对C9:0–C20:0都能显示活性。CYP153A M.aq.对ω位有较高的转移性，但它们的特异性取决于CYP和底物的链长。CYP153A M.aq.对ω位有较好的立体选择性(＞91％)(Bacterial CYP153A monooxygenases for the synthesis of omega‑hydroxylated fatty acids，2012年)。

[0006] 但CYP153A M.aq.对十个碳的脂肪酸(癸酸)的底物转化率相对于其他脂肪酸(碳数为12～14)低，CYP153A M.aq.由于其对癸酸转化率不高成为此方法未能广泛应用于工业生产的一大制约因素，因此提高CYP153A M.aq对癸酸的转化率将推动该酶在相关领域的更广泛应用。

发明内容

[0007] 针对现有技术的不足，本发明提供一种细胞色素氧化酶突变体及其应用。

[0008] 本发明利用基于结构的半理性设计对来源于Marinobacter aquaeolei的细胞色素氧化酶CYP153A M.aq.进行分子改造，将一个氨基酸进行定点突变，以获得对癸酸转化率提高的突变体。

[0009] 本发明技术方案如下：

[0010] 一种细胞色素氧化酶CYP153A M.aq.的突变体A229S的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

[0011] 所述突变体A229S是将CYP153A酶第229位的氨基酸由A突变为S，以下称为CYP153A A229S

[0012] 一种细胞色素氧化酶CYP153AM.aq.的突变体A229S的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

[0013] 一种重组表达载体包含上述突变酶的编码基因。

[0014] 一种重组菌株包含上述突变酶的编码基因。

[0015] 上述突变酶的编码基因、重组表达载体或重组表达菌株在制备上述细胞色素氧化酶CYP153A M.aq.的突变体A229S的应用。

[0016] 上述细胞色素氧化酶CYP153A M.aq.的突变体A229S在制备10‑羟基癸酸中的应用。

[0017] 根据本发明优选的，所述细胞色素氧化酶CYP153A M.aq.的突变体A229S在利用癸酸制备10‑羟基癸酸中的应用。

[0018] 根据本发明优选的，所述应用中，细胞色素氧化酶CYP153A M.aq.的突变体A229S生产10‑羟基癸酸的方法，包括如下步骤：

[0019] (1)构建重组质粒pET21b‑CYP153A A229L‑CPRBM3；

[0020] 所述CYP153A A229L‑CPRBM3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

[0021] (2)利用步骤(1)制得的重组质粒pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3转化到大肠杆菌BL21中，构建大肠杆菌BL21 pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3，工程菌经筛选，诱导培养，制得诱导细胞；

[0022] (3)将步骤(2)制得的诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向大肠杆菌BL21 pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3静息细胞中加入癸酸，培养制得10‑羟基癸酸。

[0023] 根据本发明优选的，所述步骤(1)中，构建重组质粒pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3，包括如下步骤：

[0024] 以经过密码子优化的海杆菌(Marinobacter aquaeolei)的烷烃羟化酶CYP153A与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)P450 NADPH还原酶的融合酶基因构建的质粒pET21b‑CYP153A‑CPRBM3为模板进行反向PCR扩增pET21b‑CYP153AA229S‑CPRBM3的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；扩增完成的pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3 PCR产物经过Dpn I酶去除原始的模板，再将其转化到大肠杆菌感受态中使其环化，得到重组质粒pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3。

[0025] PCR扩增体系如下，总体系25μL：

[0026] 100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μL phanta酶12.5μL，ddH2O 9.5μL。

[0027] PCR扩增条件如下：

[0028] 95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸4min30s，循环30次；72℃延伸5min。

[0029] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中，筛选为将转化后的大肠杆菌工程菌接入含有100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，在35～40℃振荡筛选培养至菌液OD600为0.8～1.2。

[0030] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中，诱导培养为将筛选培养的菌液降温至18～20℃适应0.5～1小时后，加入IPTG使培养基中IPTG浓度为0.5mM、加入终浓度0.5mM的FeCl3、终浓度0.5mM的5‑ALA继续诱导培养18小时，分离细胞，制得诱导细胞。

[0031] 进一步优选的，所述步骤(2)中，分离细胞为在5000rpm条件下离心15min，收集沉淀，然后用质量百分比浓度为0.85％的盐水洗涤。

[0032] 根据本发明优选的，步骤(3)中向大肠杆菌BL21 pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3静息细胞中加入癸酸至浓度为0.3‑0.7g/L，在28‑37℃条件下反应2‑8h，制得10‑羟基癸酸。

[0033] 进一步优选的，所述步骤(3)中，癸酸转化浓度为0.5g/L。

[0034] 更优选的，步骤(3)中向大肠杆菌BL21 pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3静息细胞中加入癸酸至浓度为0.5g/L，在30℃条件下反应2h，制得10‑羟基癸酸。

[0035] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中的转化培养基组份如下：

[0036] 甘油按质量分数计0.8～1.2％，葡萄糖按质量分数计0.3～0.5％，氨苄抗生素100μg/mL，余量溶剂为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液。

[0037] 进一步优选的，所述步骤(3)中，转化培养基组份如下：

[0038] 甘油按质量分数计1％，葡萄糖按质量分数计0.4％，氨苄抗生素100μg/mL，余量溶剂为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液。

[0039] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中，转化培养条件为在29～31℃条件下培养8小时。

[0040] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中，癸酸溶解于二甲基亚砜。

[0041] 有益效果

[0042] 本发明首次将Marinobacter aquaeolei的细胞色素氧化酶对十个碳的脂肪酸(癸酸)专一性进行分子改造，首次将CYP153A M.aq.中229位置的丙氨酸突变为丝氨酸，这为10‑羟基癸酸的工业化生产奠定了基础。

附图说明

[0043] 图1是氨基酸保守性分析；

[0044] 图中：灰色标记的129、131、143、深灰色标记的229为选定的非保守突变点，其中深灰色标记的229为自由能计算结果比WT的结合自由能降低的位点。

[0045] 图2突变酶与癸酸结合的自由能；

[0046] aΔEelec orΔEvdW＝Ecomplex‑Ereceptor‑Eligand；ΔGSUR orΔGPB＝Gcomplex‑Greceptor‑Gligand

[0047] bΔGbind＝ΔEelec+ΔEvdW+ΔGSUR+ΔGPB

[0048] WT和一个可能的候选突变体的结合自由能为粗体。

[0049] 图3是PCR扩增pET‑21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3产物的琼脂糖凝胶电泳图；

[0050] 其中M为Maker，泳道1‑4为CYP153A A229S‑CPRBM3反向PCR扩增产物，大小为8564bp。

[0051] 图4 CYP153A‑CPRBM3融合蛋白和CYP153A A229S‑CPRBM3融合蛋白的SDS‑PAGE图；

[0052] 图中M为Maker，1、2泳道为CYP153A‑CPRBM3蛋白条带，3、4泳道为CYP153A A229S‑CPRBM3蛋白条带。

[0053] 图5为野生融合酶催化癸酸产10‑羟基癸酸色谱图；

[0054] 图中：在保留时间10.005min处为癸酸TMS衍生物，保留时间12.754min处为10‑羟基癸酸TMS衍生物，所述TMS为三甲基硅烷。

[0055] 图6为分子改造后的融合酶催化癸酸产10‑羟基癸酸色谱图；

[0056] 图中：在保留时间10.005min处为癸酸TMS衍生物，保留时间12.754min处为10‑羟基癸酸TMS衍生物，所述TMS为三甲基硅烷。

[0057] 图7为癸酸TMS衍生物的质谱图。

[0058] 图8为10‑羟基癸酸TMS衍生物的质谱图。

具体实施方式

[0059] 下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护的范围不限于此。

[0060] 实施例中未详加说明的内容均按本领域现有技术。

[0061] 相关序列

[0062] SEQ ID NO.1 CYP153A A229S‑CPRBM3上游引物；

[0063] SEQ ID NO.2 CYP153A A229S‑CPRBM3下游引物；

[0064] SEQ ID NO.3 CYP153A‑CPRBM3核苷酸序列；

[0065] SEQ ID NO.4 CYP153A A229S‑CPRBM3核苷酸序列；

[0066] SEQ ID NO.5 CYP153A‑CPRBM3氨基酸序列；

[0067] SEQ ID NO.6 CYP153A A229S‑CPRBM3氨基酸序列；

[0068] SEQ ID NO.7突变体A229S核苷酸序列；

[0069] SEQ ID NO.8突变体A229S氨基酸序列；

[0070] SEQ ID NO.9 CYP153A的上游引物；

[0071] SEQ ID NO.10 CYP153A的下游引物；

[0072] SEQ ID NO.11 CPRBM3的上游引物；

[0073] SEQ ID NO.12 CPRBM3的下游引物。

[0074] 实施例1

[0075] 细胞色素氧化酶CYP153A M.aq.突变体的获得

[0076] (一)定点饱和突变基因库的获得

[0077] 基于CYP153A M.aq.三维结构挖掘C10底物专一性的P450酶基因，从PDB下载CYP153A M.aq.与底物癸酸结合三维结构，利用分子生物学工具PYMOL寻找酶与底物结合相关氨基酸，核对酶催化底物的关键氨基酸；其中关键的氨基酸为129Q、130I、131I、143M、
145I、146A、229A、303L、306V、307G、311T、354L、357M、418C、420G、455F。以CYP153AM.aq.氨基酸的序列作为探针，从NCBI上进行Blast比对，下载序列相似度在70％‑90％之间的序列。
对下载下来的同源氨基酸序列与CYP153A M.aq.进行对比，分析CYP153A M.aq.序列中氨基酸的保守性，发现不保守的氨基酸为129Q、131I、143M、229A，因此选用这几个点对为突变位点(见图1)。

[0078] (二)突变酶的构建

[0079] 使用Discovery Studio构建虚拟突变蛋白，随后对突变位点周围 的氨基酸进行局部能量最小化，以使突变位点区域的氨基酸处于能量和集合构象上都比较合理的状态。

[0080] 使用分子对接程序CDOCKER来寻找虚拟突变蛋白与底物的结合方式。

[0081] (三)计算突变酶与底物(癸酸)结合的自由能，确定需构建的突变酶菌体

[0082] 利用Discovery Studio对突变酶与底物结合的三维结构进行结合自由能的计算，寻找最优突变蛋白(见图2)。

[0083] (四)构建突变酶菌体

[0084] 海杆菌(Marinobacter aquaeolei)的烷烃羟化酶CYP153A与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)P450NADH还原酶CPRBM3的融合酶基因，即CYP153A‑CPRBM3，CYP153AA229S‑CPRBM3融合酶核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、4所示，对应表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、6所示，突变体A229S核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示、突变体A229S氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

[0085] 构建重组质粒pET21b‑CYP153A‑CPRBM3，包括如下步骤：

[0086] 以经过密码子优化的海杆菌(Marinobacter aquaeolei)的烷烃羟化酶CYP153A与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)P450 NADH还原酶CPRBM3的融合酶基因为模板进行PCR扩增，CYP153A的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，CPRBM3的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，然后将pET21b质粒用Nde I和Xho I进行双酶切，经多片段无缝克隆试剂盒连接，制得重组质粒pET21b‑CYP153A‑CPRBM3；

[0087] PCR扩增体系如下，总体系25μL：

[0088] 100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μL phanta酶12.5μL，ddH2O 9.5μL。

[0089] PCR扩增条件如下：

[0090] 95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸CYP153A 45S、CPRBM3 55S，循环30次；72℃延伸5min。

[0091] 细胞色素氧化酶基因突变体的构建是利用不依赖连接酶的快速克隆(quick change)的方法，在突变点处设计两条引物，利用反向PCR介导，以构建好的pET‑21b‑CYP153A‑CPRBM3的重组质粒为模板进行全序列体外扩增，PCR产物通过DpnⅠ酶进行酶切，去除重组质粒模板，之后，转入大肠杆菌感受态BL21(DE3)中进行环化，得到重组质粒pET21b‑CYP153AA229S‑CPRBM3。具体为：

[0092] 以之前实验中构建的pET‑21b‑CYP153A‑CPRBM3为模板，以CYP153A A229S‑CPRBM3SEQ ID NO.1为上游引物，以CYP153A A229S‑CPRBM3 SEQ ID NO.2为下游引物，PCR扩增pET‑21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3，PCR反应体系如下：

[0093]

[0094]

[0095] 上述PCR反应按照如下程序进行：

[0096] 95℃预变性3min；95℃变性15s，68℃退火15s，72℃延伸4min30s，30个循环；72℃终延伸5min。

[0097] PCR结束后通过1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短如图3，确定成功完成突变。

[0098] DpnI酶切原始模板

[0099] DpnI酶切体系：

[0100] PCR产物                      44μL

[0101] DpnI                         1μL

[0102] 10X QuickCut Buffer          5μL

[0103] 反应条件：37℃反应2h。

[0104] 反应完成后70℃15min失活DpnI。

[0105] 重组质粒的转化

[0106] 1.将购买的BL21(DE3)感受态细胞从‑80℃拿出，迅速置于冰上融化，加入10μL酶切产物，轻轻混匀，冰浴30min。

[0107] 2.42℃热激90s，然后迅速置于冰浴中冷却2min。

[0108] 3.加入900μL LB培养基，37℃，200rpm/min振荡培养60min，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。

[0109] 4.2500g离心3min，弃掉900μL上清，用剩余培养基将菌体重悬均匀涂布于带有抗性的LB固体培养基(氨苄青霉素100μg/mL)。

[0110] 5.待菌液被吸干后，倒置平板于37℃培养12～16h。

[0111] 挑取10个单菌落，37℃振荡培养6～8h，加入甘油保藏菌种。

[0112] 实施例2

[0113] 突变体的筛选

[0114] 将转有突变质粒的菌株接种于含有氨苄抗生素的平板(含有氨苄青霉素100μg/mL)，37℃恒温培养箱培养，挑取10个单菌落于含有1mL液体LB(含氨苄青霉素100μg/mL)的甘油管中培养过夜培养37℃，200rpm，得到我们实验所需的细胞色素氧化酶突变体库，取10个甘油管，每管加入800μL过夜活化的菌液，再加入800μL甘油，取其中两管标记好，送于生工科技有限公司进行测序，剩余8管冷冻保藏，获得大肠杆菌BL21 pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3。

[0115] 实施例3

[0116] 分离纯化细胞色素氧化酶重组蛋白

[0117] 种子培养：将筛选得到的正突变体置于50mL的含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃过夜振荡培养；

[0118] 扩大培养：将菌体接种于1L培养基中，当菌体浓度OD600达到1.0‑1.2范围，即对数期，加入终浓度为0.5mM FeCl3、5‑ALA，使菌体在20℃适应30min，再加入IPTG，使其终浓度为0.5mM进行诱导过夜(20h)表达目的蛋白。

[0119] 菌体收集：将发酵所得菌体倒入大离心瓶中，配平，5000rpm离心15min，倒掉上清收集菌体。

[0120] 菌体的破碎：每升菌离心所得的菌体中加入30mL的重悬缓冲液，充分悬匀，放入冰上进行超声破碎，超声4s，间隔6s，20min，功率400KW。

[0121] 可溶蛋白的获取：将破碎后的菌体倒入高速离心管中，配平，14000rpm离心1h，取上清。

[0122] Ni‑NTA亲和层析：将收集的含有可溶性蛋白的上清液体倒入再生好的Ni‑NTA柱中；上清液流净后，以wash buffer(20mM PBS，pH8.0，200mM NaCl)冲洗10个柱体积，除去非特异性吸附的蛋白；最后使用elution buffer(20mM PBS，pH8.0，200mM NaCl，250mM咪唑)将目的蛋白洗脱下来，用干净预冷烧杯收集，用超滤管离心浓缩，全程低温操作，将收集完成的粗酶液跑SDS‑PAGE蛋白电泳，见图4。

[0123] 实施例4

[0124] 大肠杆菌BL21 pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3融合酶工程菌发酵

[0125] (1)菌种活化：将实施例2中的大肠杆菌BL21 pET21b‑CYP153AA229S‑CPRBM3以1％的接种量接种至50mL的含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，在37℃、200rpm振荡培养12h；

[0126] (2)菌体转接：取上述活化菌株3mL接入300mL含有氨苄青霉素的液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养至菌液OD600为1.0时，降温至20℃适应1小时后，加入IPTG使培养基中IPTG浓度为0.5mM、加入终浓度0.5mM的FeCl3、0.5mM终浓度5‑ALA(5‑氨基乙酰丙酸盐酸盐)继续诱导培养18小时，分离细胞，制得诱导细胞；

[0127] (3)收集菌体：取上述菌液300mL，5000rpm，4℃离心15min，收集菌体；

[0128] (4)用0.85％生理盐水洗涤沉淀三次，并用转化培养基重悬菌体制备菌悬液。转化培养基包含100mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)，质粒浓度1％的甘油，质量浓度0.4％的葡萄糖，100μg/mL的氨苄抗生素，总体积为30mL，加入0.5g/L的癸酸进行反应，30℃反应2h并在2h取样，反应终止后加入1mL 0.4mol/L HCl终止反应，加入0.1g/L月桂酸作为内标。

[0129] 发酵液硅烷化处理：取1mL发酵液于1.5mL离心管中，每个样品用1.5mL乙酸乙酯萃取样品溶液中的脂肪酸(每次750μL)，旋流混合器混合60s，室温下4000r/m离心10min。取提取液蒸发干燥，干燥后的样品重新溶解在0.5mL乙酸乙酯(色谱纯)、0.5mL正己烷(色谱纯)中，100μL BSTFA‑TMCS(99:1，v/v)衍生化试剂加入后室温放置5min，在70℃的烤箱中孵育50min。

[0130] 气相质谱检测生成产物：气相色谱以氦气为载气，恒流模式，进样体积1μL，分流进样，分流比为1：5，进样温度250℃，50℃保持1min，以15℃/min升至250℃，保持10min。产物色谱图如图5、图6、图7、图8所示。

[0131] 从气质结果我们能够得知，在底物癸酸为0.5g/L时，2h取样气质结果表示，大肠杆菌BL21 pET21b‑CYP153AA229S‑CPRBM3对癸酸转化为10‑羟基癸酸的转化率为36.22％。

[0132] 对比例

[0133] 与大肠杆菌BL21 pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3融合酶工程菌的构建方法相同，构建大肠杆菌BL21 pET21b‑CYP153A‑CPRBM3融合酶工程菌，与实施例4的发酵条件相同，将癸酸转化为10‑羟基癸酸的转化率为35.04％。

[0134] 从对比例的实验结果我们能够发现，经过定点突变的大肠杆菌BL21 pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3融合酶工程菌催化癸酸转化为10‑羟基癸酸的转化率比大肠杆菌BL21 pET21b‑CYP153A ‑CPRBM3融合酶工程菌提高1.18％。

[0135] CYP153A M.aq.对十个碳的脂肪酸(癸酸)的底物转化率相对于其他脂肪酸(碳数为12～14)低，CYP153A M.aq.由于其对癸酸转化率不高，造成利用该酶生产10‑羟基癸酸未能广泛应用于工业生产的一大制约因素，因此提高CYP153A M.aq对癸酸的转化率将推动该酶在相关领域的更广泛应用；10‑羟基癸酸是化妆品、医药产品和保健品行业的重要原料和中间体，并且价格昂贵，本发明涉及的CYP153A M.aq.突变体A229S提高了癸酸转化为10‑羟基癸酸的转化率，对该酶以及酶法生产10‑羟基癸酸具有重要的意义。