一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法

摘要

本发明涉及医用材料技术领域，尤其涉及一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法。现有发酵法生产的PHAs中内毒素含量较高，且分子量分布过宽，无法满足其在医疗领域的应用。针对上述方法，本发明提供一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法，其采用的提取溶剂为无机酸或有机酸与氯代烃按照体积比0.01‑0.5:100形成的混合溶液，使用小分子醇类化合物进行分级离心沉淀后所获PHAs中的内毒素含量大幅度降低至0.005EU/mg以下，使其PDI处于1.1‑1.5之间，获得了较好的技术效果。

权利要求

1.一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法，其特征在于，以重量份数计，按照以下步骤进行：

（1）将1份PHAs与5‑100份溶剂混合均匀，室温、50‑500rpm下搅拌0.5‑5h，在3000‑

12000rpm下离心3‑30min，分别收集沉淀Ⅰ和上清液Ⅰ，用无热源水清洗除沉淀Ⅰ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅰ冻干后，即得组分A；

（2）在步骤（1）收集得到的上清液Ⅰ中加入乙醇或甲醇，使得乙醇或甲醇在上清液Ⅰ中的体积百分含量达到25‑30%，室温、50‑500rpm下搅拌混合均匀，之后在3000‑12000rpm下离心

3‑30min，分别收集沉淀Ⅱ和上清液Ⅱ，用无热源水清洗除沉淀Ⅱ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅱ冻干后，即得组分B；

（3）在步骤（2）收集得到的上清液Ⅱ中加入乙醇或甲醇，使得乙醇或甲醇在上清液Ⅱ中的体积百分含量达到45‑50%，室温、50‑500rpm下搅拌混合均匀，之后在3000‑12000rpm下离心3‑30min，分别收集沉淀Ⅲ和上清液Ⅲ，用无热源水清洗除沉淀Ⅲ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅲ冻干后，即得组分C；

（4）在步骤（3）收集得到的上清液Ⅲ中加入乙醇或甲醇，使得乙醇或甲醇在上清液Ⅲ中的体积百分含量达到65‑70%，室温、50‑500rpm下搅拌混合均匀，之后在3000‑12000rpm下离心3‑30min，分别收集沉淀Ⅳ和上清液Ⅳ，用无热源水清洗除沉淀Ⅳ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅳ冻干后，即得组分D；

步骤（1）中所述的溶剂为无机酸溶液或有机酸溶液与氯代烃按照体积比0.01‑0.5:100形成的混合溶液；

所述氯代烃为二氯甲烷、二氯乙烷或三氯甲烷。

2.根据权利要求1所述的去除发酵法PHAs中内毒素的方法，其特征在于：所述无机酸为硼酸溶液、盐酸溶液或硫酸溶液。

3.根据权利要求1述的去除发酵法PHAs中内毒素的方法，其特征在于：所述有机酸为甲酸溶液、乙酸溶液、草酸溶液、乳酸溶液。

4.根据权利要求1所述的去除发酵法PHAs中内毒素的方法，其特征在于：所述氯代烃为二氯甲烷。

说明书

一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医用材料技术领域，尤其涉及一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法。

背景技术

[0002] 多聚羟基烷酸（PHAs）是一类由微生物合成的天然高分子聚酯，因其具有优良的生物可降解性、生物相容性、生物可再生性、以及降解产物无毒性等生物学特性，已成为当前
生物医用材料的重要候选材料之一。

[0003] 目前，多数PHAs的生产菌株为革兰氏阴性细菌，而革兰氏阴性细菌细胞壁中含有一种蛋白质、多糖和脂类的抗原复合物，即细菌内毒素，当细胞破裂或溶解时这类物质会被
释放出来。内毒素可以使人体产生各种临床反应，如果将含有大量内毒素的PHAs用于医疗
卫生，特别是医学组织工程方面，会使人体发热、头痛、恶心、呕吐和休克，严重时甚至会导
致死亡。因此，国内外对于应用于临床的医疗器械材料都有严格的要求，例如：美国食品与
药品管理局（FDA）要求医疗器械用具的内毒素含量不得超过20 EU/g（即0.02EU/mg）。

[0004] PHAs为胞内产物，所以必须经破壁或改变细胞透性才能被分离纯化。如果用革兰氏阴性细菌发酵生产PHAs，在破壁提取产物的同时也会致使内毒素释放而污染PHAs产品，
进而影响该产品在医学组织工程方面的应用。然而，现有发酵法生产的PHAs中内毒素含量
高，且PHAs分子量分布范围过大，其降解速率难以控制，物理性质均一性差，不利于其在医
疗器械领域的应用。因此，在PHAs材料用于临床之前必须进行内毒素的去除，使之符合FDA
规定的要求，对其进行分子量分级后更有利于其医疗领域应用。

发明内容

[0005] 针对现有技术中存在的问题，本发明要解决的技术问题是：现有发酵法生产的PHAs中内毒素含量较高，无法满足其在医疗领域的应用。

[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：本发明提供一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法，以重量份数计，按照以下步骤进行：

[0007] （1）将1份PHAs与5‑100份溶剂混合均匀，室温、50‑500rpm下搅拌0.5‑5h，在3000‑12000rpm下离心3‑30min，分别收集沉淀Ⅰ和上清液Ⅰ，用无热源水清洗除沉淀Ⅰ表面的溶剂，
之后将沉淀Ⅰ冻干后，即得组分A；

[0008] （2）在步骤（1）收集得到的上清液Ⅰ中加入乙醇或甲醇，使得乙醇或甲醇在上清液Ⅰ中的体积百分含量达到25‑30%，室温、50‑500rpm下搅拌混合均匀，之后在3000‑12000rpm下
离心3‑30min，分别收集沉淀Ⅱ和上清液Ⅱ，用无热源水清洗除沉淀Ⅱ表面的溶剂，之后将
沉淀Ⅱ冻干后，即得组分B；

[0009] （3）在步骤（2）收集得到的上清液Ⅱ中加入乙醇或甲醇，使得乙醇或甲醇在上清液Ⅱ中的体积百分含量达到45‑50%，室温、50‑500rpm下搅拌混合均匀，之后在3000‑12000rpm
下离心3‑30min，分别收集沉淀Ⅲ和上清液Ⅲ，用无热源水清洗除沉淀Ⅲ表面的溶剂，之后
将沉淀Ⅲ冻干后，即得组分C；

[0010] （4）在步骤（3）收集得到的上清液Ⅲ中加入乙醇或甲醇，使得乙醇或甲醇在上清液Ⅲ中的体积百分含量达到65‑70%，室温、50‑500rpm下搅拌混合均匀，之后在3000‑12000rpm
下离心3‑30min，分别收集沉淀Ⅳ和上清液Ⅳ，用无热源水清洗除沉淀Ⅳ表面的溶剂，之后
将沉淀Ⅳ冻干后，即得组分D。

[0011] 具体地，步骤（1）中所述的溶剂为无机酸溶液或有机酸溶液与氯代烃按照体积比0.01‑0.5:100形成的混合溶液。

[0012] 具体地，所述无机酸为硼酸溶液、盐酸溶液或硫酸溶液。

[0013] 具体地，所述有机酸为甲酸溶液、乙酸溶液、草酸溶液、乳酸溶液。

[0014] 具体地，所述氯代烃为二氯甲烷、二氯乙烷或三氯甲烷。

[0015] 具体地，所述氯代烃为二氯甲烷。

[0016] 本发明的有益效果是：

[0017] （1）本发明提供的一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法，其采用的提取溶剂为无机酸或有机酸与氯代烃按照体积比0.01‑0.5:100形成的混合溶液，使得离心沉淀后所获
PHAs中的内毒素含量大幅度降低至0.005EU/mg以下，完全满足了其在医疗领域的应用，获
得了非常显著的技术效果；

[0018] （2）实验中还发现，PHAs第一步离心沉淀时获得的上清液，在其中加入不同体积百分含量的乙醇或甲醇后，可以获得不同分子量分布范围的PHAs，而且PHAs离心沉淀后的分
子量分布范围与乙醇或甲醇在其上清液中的体积百分含量具有一定的关系，可以通过调节
乙醇或甲醇在上清液中的体积百分含量实现对上清液中的残余PHAs分子量分级。

具体实施方式

[0019] 现在结合实施例对本发明作进一步详细的说明。

[0020] 本发明以下实施例中的组分A、组分B、组分C、组分B均指的是各步骤纯化后所获得不同分子量的PHAs。

[0021] 本发明以下实施例和对比例中的组分A、组分B、组分C、组分B中的内毒素含量均根据《中国药典》所述的内毒素检查法分析检测。其中，组分A、组分B、组分C、组分B的重均分子
量以及分子量分布指数根据GPC检测分析获取。

[0022] 本发明以下实施例所采用的P3HB4HB、PHBV、P4HB原始重均分子量分别为599KD，621KD和583KD；其分子量分布指数分别为2.12，2.23和1.97。

[0023] 本发明中的有机酸溶液或无机酸溶液是将有机酸或无机酸溶解在水溶液中形成的溶液，以下实施例和对比例中所采用的有机酸溶液或无机酸溶液的浓度为2.4mmol/L。

[0024] 实施例1

[0025] 一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法，以重量份数计，按照以下步骤进行：

[0026] （1）将1份P3HB4HB与20份溶剂混合均匀，室温下200rpm搅拌0.5h，在8000rpm下离心5min，分别收集沉淀Ⅰ和上清液Ⅰ，用无热源水清洗除沉淀Ⅰ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅰ冻干
后，即得组分A，组分A中的内毒素含量低于0.004EU/mg，组分A的重均分子量为559KD，PDI为
1.15；

[0027] （2）在步骤（1）收集得到的上清液Ⅰ中加入乙醇，使得乙醇在上清液Ⅰ中的体积百分含量达到25%，室温下200rpm搅拌混合均匀，之后在8000rpm下离心5min，分别收集沉淀Ⅱ和
上清液Ⅱ，用无热源水清洗除沉淀Ⅱ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅱ冻干后，即得组分B，组分B
中内毒素的含量低于0.005EU/mg，组分B的重均分子量为324KD，PDI为1.19；

[0028] （3）在步骤（2）收集得到的上清液Ⅱ中补加乙醇，使得乙醇在上清液Ⅱ中的体积百分含量达到45%（考虑步骤（2）中已加入乙醇的量，且乙醇的损失忽略不计），室温下250rpm
搅拌混合均匀，之后在8000rpm下离心5min，分别收集沉淀Ⅲ和上清液Ⅲ，用无热源水清洗
除沉淀Ⅲ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅲ冻干后，即得组分C，组分C中内毒素的含量低于
0.005EU/mg，组分C的重均分子量为137KD，PDI为1.21；

[0029] （4）在步骤（3）收集得到的上清液Ⅲ中补加乙醇，使得乙醇在上清液Ⅲ中的体积百分含量达到65%（考虑步骤（3）中已加入乙醇的量，且乙醇的损失忽略不计），室温下250rpm
搅拌混合均匀，之后在8000rpm下离心5min，分别收集沉淀Ⅳ和上清液Ⅳ，用无热源水清洗
除沉淀Ⅳ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅳ冻干后，即得组分D，组分D中内毒素的含量低于
0.005EU/mg，组分D的重均分子量为58KD，PDI为1.25。

[0030] 上述溶剂为盐酸溶液与二氯甲烷按照体积比0.5:100形成的混合溶液。

[0031] 实施例2

[0032] 一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法，以重量份数计，按照以下步骤进行：

[0033] （1）将1份PHBV与5份溶剂混合均匀，室温下300rpm搅拌2h，在5000rpm下离心5min，分别收集沉淀Ⅰ和上清液Ⅰ，用无热源水清洗除沉淀Ⅰ表面的溶剂，之后将沉淀冻干后，即得
组分A，组分A的内毒素含量为0.004EU/mg，其重均分子量和分子量分布指数分别为554KD和
1.14；

[0034] （2）在步骤（1）收集得到的上清液Ⅰ中加入乙醇，使得乙醇在上清液Ⅰ中的体积百分含量达到30%，室温下搅拌混合均匀，之后在7000rpm下离心150min，分别收集沉淀Ⅱ和上清
液Ⅱ，用无热源水清洗除沉淀Ⅱ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅱ冻干后，即得组分B，组分B的内
毒素含量为0.003EU/mg，其重均分子量和分子量分布指数又是406KD和1.18；

[0035] （3）在步骤（2）收集得到的上清液Ⅱ中补加乙醇，使得乙醇在上清液Ⅱ中的体积百分含量达到48%（考虑步骤（2）中已加入乙醇的量，且乙醇的损失忽略不计），室温下搅拌混
合均匀，之后在6000rpm下离心200min，分别收集沉淀Ⅲ和上清液Ⅲ，用无热源水清洗除沉
淀Ⅲ表面的溶剂，之后将沉淀冻干后，即得组分C，组分C的内毒素含量为0.003EU/mg，其重
均分子量和分子量分布指数分别是237KD和1.21；

[0036] （4）在步骤（3）收集得到的上清液Ⅲ中补加乙醇，使得乙醇在上清液Ⅲ中的体积百分含量达到68%（考虑步骤（3）中已加入乙醇的量，且乙醇的损失忽略不计），室温下搅拌混
合均匀，之后在12000rpm下离心3min，分别收集沉淀Ⅳ和上清液Ⅳ，用无热源水清洗除沉淀
Ⅳ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅳ冻干后，即得组分D，组分D的内毒素含量为0.003EU/mg，其重
均分子量和分子量分布指数分别是96KD和1.25。

[0037] 上述溶剂为硼酸溶液与二氯甲烷按照体积比1:100形成的混合溶液。

[0038] 实施例3

[0039] 一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法，以重量份数计，按照以下步骤进行：

[0040] （1）将1份P4HB与50份溶剂混合均匀，室温下搅拌1h，在3000rpm下离心30min，分别收集沉淀Ⅰ和上清液Ⅰ，用无热源水清洗除沉淀Ⅰ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅰ冻干后，即得组分
A，组分A的内毒素含量为0.003EU/mg，其重均分子量和分子量分布指数分别为530KD和
1.15；

[0041] （2）在步骤（1）收集得到的上清液Ⅰ中加入乙醇，使得乙醇在上清液Ⅰ中的体积百分含量达到25%，室温下搅拌混合均匀，之后在4000rpm下离心25min，分别收集沉淀Ⅱ和上清
液Ⅱ，用无热源水清洗除沉淀Ⅱ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅱ冻干后，即得组分B，组分B的内
毒素含量为0.002EU/mg，组分B的重均分子量为370KD，分子量分布指数为1.18；

[0042] （3）在步骤（2）收集得到的上清液Ⅱ中补加乙醇，使得乙醇在上清液Ⅱ中的体积百分含量达到46%（考虑步骤（2）中已加入乙醇的量，且乙醇的损失忽略不计），室温下搅拌混
合均匀，之后在5000rpm下离心20min，分别收集沉淀Ⅲ和上清液Ⅲ，用无热源水清洗除沉淀
Ⅲ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅲ冻干后，即得组分C，组分C的内毒素含量为0.002EU/mg，其重
均分子量为210KD，分子量分布指数为1.21；

[0043] （4）在步骤（3）收集得到的上清液Ⅲ中补加乙醇，使得乙醇在上清液Ⅲ中的体积百分含量达到65%（考虑步骤（3）中已加入乙醇的量，且乙醇的损失忽略不计），室温下搅拌混
合均匀，之后在7000rpm下离心15min，分别收集沉淀Ⅳ和上清液Ⅳ，用无热源水清洗除沉淀
Ⅳ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅳ冻干后，即得组分D，组分D的内毒素含量为0.001EU/mg，其重
均分子量和分子量分布指数分别为90KD和1.26。

[0044] 上述溶剂为硫酸溶液与二氯甲烷按照体积比0.5:100形成的混合溶液。

[0045] 实施例4

[0046] 一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法，以重量份数计，按照以下步骤进行：

[0047] （1）将1份P4HB与80份溶剂混合均匀，室温下搅拌5h，在12000rpm下离心3min，分别收集沉淀Ⅰ和上清液Ⅰ，用无热源水清洗除沉淀Ⅰ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅰ冻干后，即得组分
A，组分A的内毒素含量为0.004EU/mg，其重均分子量和分子量分布指数分别为551KD和
1.15；

[0048] （2）在步骤（1）收集得到的上清液Ⅰ中加入甲醇，使得甲醇在上清液Ⅰ中的体积百分含量达到25%，室温下搅拌混合均匀，之后在9000rpm下离心5min，分别收集沉淀Ⅱ和上清液
Ⅱ，用无热源水清洗除沉淀Ⅱ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅱ冻干后，即得组分B，组分B的内毒
素含量为0.003EU/mg，其重均分子量和分子量分布指数分别为330KD和1.16；

[0049] （3）在步骤（2）收集得到的上清液Ⅱ中补加甲醇，使得甲醇在上清液Ⅱ中的体积百分含量达到45%（考虑步骤（2）中已加入乙醇的量，且乙醇的损失忽略不计），室温下搅拌混
合均匀，之后在9000rpm下离心5min，分别收集沉淀Ⅲ和上清液Ⅲ，用无热源水清洗除沉淀
Ⅲ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅲ冻干后，即得组分C，组分C的内毒素含量为0.003EU/mg，其重
均分子量和分子量分布指数分别为184KD和1.19；

[0050] （4）在步骤（3）收集得到的上清液Ⅲ中补加甲醇，使得甲醇在上清液Ⅲ中的体积百分含量达到60%（考虑步骤（3）中已加入乙醇的量，且乙醇的损失忽略不计），室温下搅拌混
合均匀，之后在8000rpm下离心8min，分别收集沉淀Ⅲ和上清液Ⅳ，用无热源水清洗除沉淀
Ⅳ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅳ冻干后，即得组分D，组分D的内毒素含量为0.002EU/mg，其重
均分子量和分子量分布指数分别为89KD和1.27。

[0051] 上述溶剂为甲酸溶液与二氯甲烷按照体积比0.25:100形成的混合溶液。

[0052] 实施例5

[0053] 一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法，以重量份数计，按照以下步骤进行：

[0054] （1）将1份PHBV与100份溶剂混合均匀，室温下搅拌2h，在7000rpm下离心10min，分别收集沉淀Ⅰ和上清液Ⅰ，用无热源水清洗除沉淀Ⅰ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅰ冻干后，即得组
分A，组分A的内毒素含量为0.04EU/mg，其重均分子量和分子量分布指数分别为547KD和
1.12；

[0055] （2）在步骤（1）收集得到的上清液Ⅰ中加入乙醇，使得乙醇在上清液Ⅰ中的体积百分含量达到30%，室温下搅拌混合均匀，之后在3000rpm下离心30min，分别收集沉淀Ⅱ和上清
液Ⅱ，用无热源水清洗除沉淀Ⅱ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅱ冻干后，即得组分B，组分B的内
毒素含量为0.003EU/mg，其重均分子量和分子量分布指数分别为372KD和1.16；

[0056] （3）在步骤（2）收集得到的上清液Ⅱ中补加乙醇，使得乙醇在上清液Ⅱ中的体积百分含量达到50%（考虑步骤（2）中已加入乙醇的量，且乙醇的损失忽略不计），室温下搅拌混
合均匀，之后在3000rpm下离心30min，分别收集沉淀Ⅲ和上清液Ⅲ，用无热源水清洗除沉淀
Ⅲ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅲ冻干后，即得组分C，组分C的内毒素含量为0.003EUmg，其重均
分子量和分子量分布指数分别为210KD和1.22；

[0057] （4）在步骤（3）收集得到的上清液Ⅲ中补加乙醇，使得乙醇在上清液Ⅲ中的体积百分含量达到70%（考虑步骤（3）中已加入乙醇的量，且乙醇的损失忽略不计），室温下搅拌混
合均匀，之后在7000rpm下离心10min，分别收集沉淀Ⅳ和上清液Ⅳ，用无热源水清洗除沉淀
Ⅳ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅳ冻干后，即得组分D，组分D的内毒素含量为0.003EU/mg，其重
均分子量和分子量分布指数分别为52KD和1.25。

[0058] 上述溶剂为盐酸溶液与二氯甲烷按照体积比0.1:100形成的混合溶液。

[0059] 实施例6

[0060] 一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法，以重量份数计，按照以下步骤进行：

[0061] （1）将1份PHBV与20份溶剂混合均匀，室温下搅拌4h，在6000rpm下离心15min，分别收集沉淀Ⅰ和上清液Ⅰ，用无热源水清洗除沉淀Ⅰ表面的溶剂，之后将沉淀冻干后，即得组分
A，组分A的内毒素含量为0.004EU/mg，其重均分子量和分子量分布指数分别为568KD和
1.15；

[0062] （2）在步骤（1）收集得到的上清液Ⅰ中加入乙醇，使得乙醇在上清液Ⅰ中的体积百分含量达到25%，室温下搅拌混合均匀，之后在6000rpm下离心15min，分别收集沉淀Ⅱ和上清
液Ⅱ，用无热源水清洗除沉淀Ⅱ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅱ冻干后，即得组分B，组分B的内
毒素含量为0.003EU/mg，其重均分子量和分子量分布指数分别为358KD和1.18；

[0063] （3）在步骤（2）收集得到的上清液Ⅱ中补加乙醇，使得乙醇在上清液Ⅱ中的体积百分含量达到45%（考虑步骤（2）中已加入乙醇的量，且乙醇的损失忽略不计），室温下搅拌混
合均匀，之后在8000rpm下离心80min，分别收集沉淀Ⅲ和上清液Ⅲ，用无热源水清洗除沉淀
Ⅲ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅲ冻干后，即得组分C，组分C的内毒素含量为0.002EU/mg，其重
均分子量和分子量分布指数分别为160KD和1.21；

[0064] （4）在步骤（3）收集得到的上清液Ⅲ中加入乙醇，使得乙醇在上清液Ⅲ中的体积百分含量达到65%（考虑步骤（3）中已加入乙醇的量，且乙醇的损失忽略不计），室温下搅拌混
合均匀，之后在8000rpm下离心8min，分别收集沉淀Ⅳ和上清液Ⅳ，用无热源水清洗除沉淀
Ⅳ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅳ冻干后，即得组分D，组分D的内毒素含量为0.002EU/mg，其重
均分子量和分子量分布指数分别为63KD和1.25。

[0065] 上述溶剂为乳酸溶液与二氯甲烷按照体积比0.5:100形成的混合溶液。

[0066] 实施例7

[0067] 上述溶剂为盐酸与二氯甲烷按照体积比0.5:100形成的混合溶液。

[0068] 一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法，以重量份数计，按照以下步骤进行：

[0069] （1）将1份P4HB与20份溶剂混合均匀，室温下搅拌4h，在5000rpm下离心20min，分别收集沉淀Ⅰ和上清液Ⅰ，用无热源水清洗除沉淀Ⅰ表面的溶剂，之后将沉淀冻Ⅰ干后，即得组分
A，组分A的内毒素含量0.004EU/mg，其重均分子量和分子量分布指数分别为533KD和1.15；

[0070] （2）在步骤（1）收集得到的上清液Ⅰ中加入甲醇，使得甲醇在上清液Ⅰ中的体积百分含量达到28%，室温下搅拌混合均匀，之后在8000rpm下离心10min，分别收集沉淀Ⅱ和上清
液Ⅱ，用无热源水清洗除沉淀Ⅱ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅱ冻干后，即得组分B，组分B的内
毒素含量0.003EU/mg，其重均分子量和分子量分布指数分别为353KD和1.20；

[0071] （3）在步骤（2）收集得到的上清液Ⅱ中补加甲醇，使得甲醇在上清液Ⅱ中的体积百分含量达到47%（考虑步骤（2）中已加入甲醇的量，且甲醇的损失忽略不计），室温下搅拌混
合均匀，之后在8000rpm下离心10min，分别收集沉淀Ⅲ和上清液Ⅲ，用无热源水清洗除沉淀
Ⅲ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅲ冻干后，即得组分C，组分C的内毒素含量为0.003EU/mg，其重
均分子量和分子量分布指数分别为183KD和1.22；

[0072] （4）在步骤（3）收集得到的上清液Ⅲ中补加甲醇，使得甲醇在上清液Ⅲ中的体积百分含量达到70%（考虑步骤（3）中已加入甲醇的量，且甲醇的损失忽略不计），室温下搅拌混
合均匀，之后在8000rpm下离心10min，分别收集沉淀Ⅳ和上清液Ⅳ，用无热源水清洗除沉淀
Ⅳ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅳ冻干后，即得组分D，组分D的内毒素含量为0.002EU/mg，其重
均分子量和分子量分布指数分别为65KD和1.23。

[0073] 上述溶剂为草酸溶液与三氯甲烷按照体积比0.5:100形成的混合溶液。

[0074] 实施例8

[0075] 一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法，以重量份数计，按照以下步骤进行：

[0076] （1）将1份P3HB4HB与20份溶剂混合均匀，室温下搅拌5h，在10000rpm下离心50min，分别收集沉淀Ⅰ和上清液Ⅰ，用无热源水清洗除沉淀Ⅰ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅰ冻干后，即得
组分A，组分A的内毒素含量为0.002EU/mg，其重均分子量和分子量分布指数分别为553KD和
1.16；

[0077] （2）在步骤（1）收集得到的上清液Ⅰ中加入乙醇，使得乙醇在上清液Ⅰ中的体积百分含量达到25%，室温下搅拌混合均匀，之后在10000rpm下离心5min，分别收集沉淀Ⅱ和上清
液Ⅱ，用无热源水清洗除沉淀Ⅱ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅱ冻干后，即得组分B，组分B的内
毒素含量为0.002EU/mg，其重均分子量和分子量分布指数分别为353KD和1.24；

[0078] （3）在步骤（2）收集得到的上清液Ⅱ中补加乙醇，使得乙醇在上清液Ⅱ中的体积百分含量达到46%（考虑步骤（2）中已加入乙醇的量，且乙醇的损失忽略不计），室温下搅拌混
合均匀，之后在10000rpm下离心5min，分别收集沉淀Ⅲ和上清液Ⅲ，用无热源水清洗除沉淀
Ⅲ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅲ冻干后，即得组分C，组分C的内毒素含量为0.002EU/mg，其重
均分子量和分子量分布指数分别为163KD和1.27；

[0079] （4）在步骤（3）收集得到的上清液Ⅲ中补加乙醇，使得乙醇在上清液Ⅲ中的体积百分含量达到65%（考虑步骤（3）中已加入乙醇的量，且乙醇的损失忽略不计），室温下搅拌混
合均匀，之后在10000rpm下离心5min，分别收集沉淀Ⅳ和上清液Ⅳ，用无热源水清洗除沉淀
Ⅳ表面的溶剂，之后将沉淀Ⅳ冻干后，即得组分D，组分D的内毒素含量为0.002EU/mg，其重
均分子量和分子量分布指数分别为58KD和1.31。

[0080] 上述溶剂为盐酸溶液与二氯乙烷按照体积比0.5:100形成的混合溶液。

[0081] 实施例9同实施例1，不同之处在于，实施例9步骤（2）中的乙醇在上清液Ⅰ中的体积百分含量为10%，其组分B的内毒素含量为0.004EU/mg，其重均分子量和分子量分布指数分
别是457KD和1.11。

[0082] 实施例10同实施例1，不同之处在于，实施例10步骤（2）中的乙醇在上清液Ⅰ中的体积百分含量为45%，其组分B的内毒素含量为0.003EU/mg，其重均分子量为325KD，分子量分
布指数为1.29。

[0083] 对比例1同实施例1，不同之处在于，对比例1步骤（1）中的溶剂仅为盐酸溶液，其组分A的内毒素含量为0.125EU/mg，其重均分子量和分子量分布指数分别是538KD和2.18。

[0084] 对比例2将1份P3HB4HB与20份二氯甲烷混合均匀，室温下200rpm搅拌0.5h，在8000rpm下离心5min，减压蒸馏去除二氯甲烷，即得组分A，其组分A的内毒素含量为0.25EU/
mg，其重均分子量和分子量分布指数分别是546KD和2.02。

[0085] 对比例3将1份P3HB4HB与20份四氯甲烷混合均匀，室温下200rpm搅拌0.5h，在8000rpm下离心5min，减压蒸馏去除四氯甲烷，即得组分A，其组分A的内毒素含量为0.3EU/
mg，其重均分子量和分子量分布指数分别是529KD和2.12。

[0086] 对比例4同实施例1，不同之处在于，对比例4步骤（1）中的溶剂为盐酸溶液与二氯甲烷按照体积比1:100形成的混合溶液，其组分A的内毒素含量为0.005EU/mg，其重均分子
量和分子量分布指数分别是498KD和1.54。

[0087] 对比例5同实施例1，不同之处在于，对比例7步骤（1）中的溶剂为盐酸溶液与四氯甲烷按照体积比0.5:100形成的混合溶液，其组分A的内毒素含量为0.025 EU/mg，其重均分
子量和分子量分布指数分别是579KD和2.21。

[0088] 对比例6同实施例1，不同之处在于，对比例6中乙醇在上清液Ⅰ中的体积百分含量为0%，其步骤（2）所获组分B中内毒素的含量为0.004EU/mg，组分B的重均分子量为547KD，
PDI为2.67。

[0089] 对比例7同实施例1，不同之处在于，对比例7中乙醇在上清液Ⅰ中的体积百分含量为5%，其步骤（2）所获组分B中内毒素的含量为0.004EU/mg，组分B的重均分子量为538KD，
PDI为1.11。

[0090] 对比例8同实施例1，不同之处在于，对比例8中乙醇在上清液Ⅰ中的体积百分含量为10%，其步骤（2）所获组分B中内毒素的含量为0.003EU/mg，组分B的重均分子量为519KD，
PDI为1.15；

[0091] 对比例9同实施例1，不同之处在于，对比例9中乙醇在上清液Ⅰ中的体积百分含量为45%，其步骤（2）所获组分B中内毒素的含量为0.003EU/mg，组分B的重均分子量为402KD，
PDI为1.52。

[0092] 对比例10同实施例1，不同之处在于，对比例10中乙醇在上清液Ⅰ中的体积百分含量为65%，其步骤（2）所获组分B中内毒素的含量为0.002EU/mg，组分B的重均分子量为
261KD，PDI为1.95。

[0093] 对比例11同实施例1，不同之处在于，对比例11中乙醇在上清液Ⅱ中的体积百分含量为35%，其步骤（2）所获组分C中内毒素的含量为0.003EU/mg，组分B的重均分子量为
309KD，PDI为1.28。

[0094] 对比例12同实施例1，不同之处在于，对比例12中乙醇在上清液Ⅱ中的体积百分含量为65%，其步骤（2）所获组分C中内毒素的含量为0.002EU/mg，组分B的重均分子量为
218KD，PDI为1.85。

[0095] 以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术
性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。