一种植物EPSPS突变体及其在植物中的应用

摘要

本发明公开了一种植物EPSPS突变体的基因序列及其在植物中的应用。提供了使植物具有草甘膦除草剂抗性的突变体的蛋白质，与野生型相比，带有在位点362从E到R的氨基酸突变和在位点432从K到I的氨基酸突变。另外，本发明还提供了相应的获得具有草甘膦除草剂抗性的植物的方法和应用、以及鉴定本发明的抗除草剂植物或抗除草剂植物的方法。

权利要求

1.一组抗草甘膦除草剂水稻的EPSPS的突变体的氨基酸序列，与其野生型相比，带有E362R和K432I的突变；野生型水稻的EPSPS的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述的氨基酸序列，所述氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

3.一组抗草甘膦除草剂水稻的EPSPS的突变体的核酸序列，其编码权利要求1或者2所述的氨基酸序列。

4.权利要求3所述的核酸序列，所述核酸序列如SEQ ID NO：3所示。

5.获得具有抗草甘膦除草剂的水稻的方法，其包括如下步骤：(1)使水稻包含权利要求

3或4所述的核酸；或，(2)使水稻表达具有权利要求1或2所述的氨基酸序列的蛋白质。

6.鉴定具有抗草甘膦除草剂的水稻的方法，其包括如下步骤：(1)测试水稻是否包含权利要求3或4所述的核酸；或，(2)测试水稻是否表达具有权利要求1或2所述的氨基酸序列的蛋白质。

7.权利要求1或2所述的氨基酸、权利要求3或4所述的核酸在获得抗草甘膦除草剂的水稻中的应用。

说明书

一种植物EPSPS突变体及其在植物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物蛋白质领域，具体而言，本发明涉及能赋予水稻或者其他植物草甘膦除草剂抗性(耐受性)的蛋白及其在植物中的应用。

背景技术

[0002] 草甘膦是世界上使用量最大的广谱灭生性除草剂，是一种PEP的结构类似物，通过竞争性抑制PEP与EPSPS(5‑烯醇丙酮酸莽草酸‑3‑磷酸合酶，5‑enolpyruvylshikimate‑3‑phosphatesynthase)的结合而阻断莽草酸途径，导致芳香族氨基酸，即苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸的合成受阻和生物合成代谢失调，最终导致生物体死亡。由于草甘膦可有效杀死多种杂草，培育对草甘膦除草剂有抗性的农作物有极大的经济价值和商业用途。孟山都公司的科学家从CP4农杆菌菌株中得到抗草甘膦的基因，并用转基因的方法转入大豆，玉米等植物，获得抗草甘膦除草剂的转基因农作物。但是转基因农作物因为各样原因，无法得到广泛的应用。因此发现来源于植物的新的抗草甘膦的基因并将之用于植物中有着巨大的经济和商业价值。

[0003] 本发明人正是经过科学研究和实验，发现了植物的原有的EPSPS酶在某些位点的氨基酸突变可以使植物对草甘膦有抗性，同时并不影响自身的生物酶的原有功能。本发明人还开发了这些突变蛋白及其编码基因在转基因，基因编辑或者其它植物育种中的应用，可用于培育具有草甘膦除草剂抗性的植物，尤其是农作物，如其他农业植物等。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一个新的使植物具有草甘膦除草剂抗性的氨基酸序列，本领域人员可通过已知的生物技术，例如转基因，基因编辑或者突变技术，使得植物能够表达上述的蛋白质，该植物即可具有草甘膦除草剂的抗性。

[0005] 具体而言，在所述目的方面，本发明提供了使植物具有草甘膦除草剂抗性的氨基酸序列。使植物具有草甘膦除草剂抗性的氨基酸序列与野生型相比，其在362位点上带有从E到R的氨基酸突变和在432位点上带有从K到I的氨基酸突变。野生型水稻的EPSPS的氨基酸序列如SEQIDNO：2所述，突变后的EPSPS的氨基酸序列如SEQIDNO：4。本发明的另一个目的在于提供具有草甘膦除草剂抗性的x1)植物；x2)单子叶植物或双子叶植物；x3)水稻。示例性的植物包括水稻、玉米、小麦、黑麦、燕麦、大麦、大豆、马铃薯、油菜、甜菜、甘蔗、高粱、西红柿、南瓜、辣椒、生菜、向日葵、咖啡、茶、棉花、苜蓿、烟草或拟南芥等。

[0006] 本发明的另一个目的在于提供获得具有草甘膦除草剂抗性的x1)植物；x2)单子叶植物或双子叶植物；x3)水稻的方法。示例性的植物包括水稻、玉米、小麦、黑麦、燕麦、大麦、大豆、马铃薯、油菜、甜菜、甘蔗、高粱、西红柿、南瓜、辣椒、生菜、向日葵、咖啡、茶、棉花、苜蓿、烟草或拟南芥等。上述草甘膦除草剂抗性植物的获得，可通过生物技术，例如转基因，基因编辑，或者突变技术，或者通过传统育种，例如将已有草甘膦除草剂抗性植物与其他植物品种杂交产生的植物后代、以及回交或自交产生的植物后代等等的方法，将上述氨基酸突变在植物中表达，从而使植物获得草甘膦除草剂的抗性。

[0007] 本发明的另一个目的在于提供上述基因在x1)或x2)或x3)中获得草甘膦除草剂抗性的应用:x1)植物；x2)单子叶植物或双子叶植物；x3)水稻。示例性的植物包括水稻、玉米、小麦、黑麦、燕麦、大麦、大豆、马铃薯、油菜、甜菜、甘蔗、高粱、西红柿、南瓜、辣椒、生菜、向日葵、咖啡、茶、棉花、苜蓿、烟草或拟南芥等。该应用包括，通过生物技术，突变技术或者传统育种技术获得具有草甘膦除草剂抗性的植物过程中的应用，例如转基因植物中的应用，基因编辑植物中的应用或者其它的应用等等。

[0008] 本发明的另一个目的在于提供一个鉴定方法，本领域人员可通过已知的生物技术，通过检测是否在植物中是否含有上述的突变，来判断植物是否采用本发明方法获得的植物的鉴定方法。测定的步骤可以通过常规的核酸检测和/或蛋白质检测方法来进行，只需要能够检测出蛋白质带有E362R和K432I突变或其相应核酸突变的方法都可以。

[0009] 下面将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述，使本发明更容易理解。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。而在阅读本说明书之后，在不脱离本发明的目的和/或所附的权利要求书的范围的前提下，本领域技术人员可以提出本发明的其它实施方式，修改和等同物。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的了。此外，本发明提供的植物EPSPS突变体来源于水稻，具体的实验实例也是在垦香稻中实施的。但是所述的两个氨基酸的突变是可适用于其它植物，突变可发生在其它植物上的等同位点，产生的突变体植株拥有或者提高了植株对草甘膦的抗性。

附图说明

[0010] 图1：本发明实施例1中的大肠杆菌EPSPS、CP4的EPSPS，水稻野生型的EPSPS和水稻突变体的EPSPS氨基酸序列比对的部分结果；

[0011] 图2：含有CP4，野生型和突变体的EPSPS基因的大肠杆菌在含不同浓度的草甘膦的培养基上的生长图；

[0012] 图3：水稻转基因阳性苗与野生型水稻的草甘膦除草剂的抗性测试对比照片。

具体实施方式

[0013] 下述实施例子中所用方法如无特殊说明，均为本领域人员常用的方法。

[0014] 实施例1：大肠杆菌EPSPS，CP4的EPSPS，野生型水稻的EPSPS和突变体水稻的EPSPS的序列对比。

[0015] 如图1所示：Translationofcp4对应的是CP4的EPSPS的氨基酸序列(如SEQIDNO：6所示)。

[0016] TranslationofOsEPSPS对应的是水稻野生型的EPSPS的氨基酸序列(如SEQIDNO：2所示)。

[0017] TranslationofOsEPSPS‑ERKI对应的是水稻突变体的EPSPS的氨基酸序列(如SEQIDNO：4所示)。

[0018] TranslationofEcoliEPSPS对应的是大肠杆菌的EPSPS的氨基酸序列(如SEQIDNO：5所示)。

[0019] 与水稻野生型EPSPS的氨基酸序列比对，使水稻产生草甘膦抗性的突变，发生在位点362和位点432上，对应大肠杆菌的EPSPS的氨基酸序列位点为341和411。在水稻位点362或者大肠杆菌位点341上，氨基酸的变化是从E变成R。在水稻位点432或者大肠杆菌位点411上，氨基酸的变化是从K变成I。

[0020] 实施例2：CP4，水稻野生型和突变体的EPSPS基因在EPSPS缺陷型大肠杆菌中对不同浓度的草甘膦的抗性比较。

[0021] 依次将CP4的EPSPS编码基因(SEQIDNO：6)，野生型水稻的EPSPS(SEQIDNO：2)和突变体水稻的EPSPS(SEQIDNO：4)转入EPSPS缺陷型大肠杆菌中，通过检测被转化的大肠杆菌在含不同草甘膦浓度(0mM,5mM,20mM)的M9培养基上的生长情况，验证水稻EPSPS突变体在大肠杆菌中的抗草甘膦的能力。本实验所用EPSPS缺陷型大肠杆菌菌株采用公知的Red同源重组法构建(白光兴,孙志伟,黄莺,etal.利用Red重组系统对大肠杆菌ClpP基因的敲除[J].中国生物化学与分子生物学报(1):45‑48.)。所使用的大肠杆菌转化方法和检测方法均为本领域的常规公知的方法。

[0022] 结果如图2所示：

[0023] 在含0mM草甘膦的培养基上，含有CP4，野生型水稻和突变体水稻的EPSPS的缺陷型大肠杆菌均能生长，表明CP4，野生型水稻和突变体水稻的EPSPS蛋白都具有正常EPSPS的酶的活力。

[0024] 在含5mM草甘膦的培养基上，含有CP4和突变体水稻的EPSPS的缺陷型大肠杆菌均能生长，表明CP4和突变体水稻的EPSPS蛋白都具有抗草甘膦除草剂的能力，并且明显优于野生型水稻的EPSPS。

[0025] 在含20mM草甘膦的培养基上，只有含有CP4的EPSPS的缺陷型大肠杆菌能生长，表明CP4抗草甘膦的能力优于突变体水稻的EPSPS。

[0026] 以上结果显示突变体水稻的EPSPS比起野生型水稻的EPSPS对草甘膦是有抗性的，但是未达到CP4EPSPS对草甘膦抗性的水平。但是考虑到对草甘膦有抗性的突变体水稻的EPSPS的基因序列只有两个氨基酸突变，其对后续在农作物上的实际应用的范围比CP4的EPSPS的转基因的应用范围要广阔很多(如图1所示)，更容易推广应用，也更有经济商业价值。比如可利用基因编辑的技术引入上述突变，使得植株具有草甘膦除草剂抗性，大大缩短研发时间。

[0027] 实施例3：比较突变体转基因水稻与野生型水稻对不同浓度的草甘膦除草剂的抗性。

[0028] 3.1转基因载体的构建。

[0029] 本发明的发明人构建了转基因载体ERKI‑RICE，其序列如SEQIDNO：7所示。上述序列中，第93至277位为PolyA终止子的核苷酸序列，第318至1343位为潮霉素的核苷酸序列，第1378至3349位为UBI启动子的核苷酸序列，第3444至4482位为水稻EPSPS启动子的核苷酸序列，第4483‑6722位为水稻EPSPS突变体的核苷酸序列(如SEQIDNO：3所示)，第6723‑6958位为水稻EPSPS终止子的核苷酸序列，第6978‑7810位为LTP2启动子的核苷酸序列，第7811‑8495位为DsRED基因的核苷酸序列，第8540位‑8851位为TINPTII终止子的核苷酸序列。

[0030] 3.2在水稻愈伤中进行转基因实验。

[0031] 1、将转基因载体ERKI‑RICE导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。

[0032] 2、在转化实验之前1‑5天，在含50mg/L卡那霉素+15mg/L利富平的YEB固体培养基上接种重组农杆菌，用3M胶带封皿；28℃，倒置，暗培养1‑5天。

[0033] 3、用接菌环刮取“Z”字形尾部的菌体，温和悬于100μM含2mg/L2，4‑二氯苯氧乙酸的NB液体培养基中，使菌液浓度达到OD600＝0.1，制成农杆菌侵染液备用。

[0034] 4、将垦香稻种子去掉种皮后置于三角瓶中，无菌水洗3次，加入75％酒精浸没种子，轻轻晃动1min，倒掉酒精。加入2.5％氯酸钠水溶液，150‑170rpm振荡25min。加入无菌水轻摇振荡冲洗5‑8次，倒净水。将种子接种于愈伤诱导培养基上，于30℃暗培养4‑6周左右，得到水稻愈伤。

[0035] 5、将步骤4得到的水稻愈伤浸泡置于农杆菌侵染液中浸泡10min，然后，放在铺有两层灭菌滤纸的共培养基上，22℃暗培养3天。

[0036] 6、取步骤5得到的水稻愈伤放入恢复培养基上，30℃培养4‑7天。

[0037] 7、取步骤6得到的水稻愈伤，置于潮霉素筛选培养基，30℃培养2周。

[0038] 8、取步骤7得到的水稻愈伤，置于潮霉素筛选培养基，30℃培养2周。

[0039] 9、将旺盛生长的愈伤组织转移到再生培养基上,在30℃培养20‑30天。植株将从淡黄色或绿色的愈伤组织上产生。

[0040] 10、挑选健壮的大于3cm高的再生绿色幼苗，转移至生根培养基上，培养7‑14天后，得到水稻转基因苗。

[0041] 培养基的配方如下：

[0042] 共培养基：含有2mg/L2,4‑二氯苯氧乙酸的NB固体培养基。

[0043] 恢复培养基：含有200mg/L特美汀的NB固体培养基。

[0044] 潮霉素筛选培养基：含有30‑50mg/L潮霉素的NB固体培养基。

[0045] 分化培养基：含有0.5g/L谷氨酰胺、0.5g/L脯氨酸、2mg/L卡那霉素和0.2mg/Lα‑萘乙酸的NB固体培养基。

[0046] 生根培养基：含有0.5g/L谷氨酰胺、0.5g/L脯氨酸、0.2mg/Lα‑萘乙酸的MS固体培养基。

[0047] 垦香稻：公众可以从农垦水稻研究所获得。

[0048] 3.3水稻转基因苗的分子检测结果和筛选。

[0049] 对上述步骤中得到的所有水稻转基因苗进行了分子检测。具体步骤如下：取转基因水稻植株叶片10‑20mg，放入离心管中，加入钢珠后，置于液氮速冷，用组织研磨机将叶片充分震荡研磨至粉末状，采用SDS法提取样品DNA用于后续检测。PCR检测引物设定为F：CCATCAGCAAGGCACTCAAG，R：AATGCCCACCTGTTCGTGTC，其特点是：该引物对跨水稻内源EPSPS的一个内含子，对水稻内源EPSPS基因扩增产生的PCR产物大小为379bp，而我们构建的植物表达载体中不包含该段内含子序列，扩增产生PCR产物大小为102bp，因此，通过PCR产物片段长度可以明确所获得的转基因植株是否为阳性，同时PCR产物经过测序确认为阳性转基因植株，测序公司：英潍捷基(上海)贸易有限公司。

[0050] 3.4水稻转基因阳性苗的草甘膦除草剂的抗性检测。

[0051] 将经过分子检测筛选得到的水稻转基因阳性苗移栽到温室大盆中，均匀的排放在同一实验区域，按照840gae/ha为1X剂量来喷洒草甘膦(其中840gae/ha是草甘膦公认的田间推荐使用浓度)。

[0052] 如图3所示：

[0053] 对突变体水稻植株和野生型水稻植株分别喷洒1/2X，1X和2X，于第14天观察，记录各组植株的生长状况，从结果中可以看出，在喷洒1/2X草甘膦后，野生型水稻植株全无抗性，均死亡。突变体水稻植株在1/2X对草甘膦有明显的抗性。在喷洒1X草甘膦后，野生型植株均死亡。突变体水稻植株仍然对草甘膦有明显的抗性。在喷洒2X草甘膦后，突变体水稻对草甘膦的抗性减弱，无法正常存活。综上所述，含有E362R和K432I的水稻突变的EPSPS对草甘膦的抗性优于野生型。以上结果也说明，与大肠杆菌EPSPS序列相比，植物EPSPS突变体的氨基酸序列在对应与大肠杆菌EPSPS的发生E341R和K411I的突变也可以带给植物或者提高植物对草甘膦的抗性。

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