一种非小细胞肺癌致病基因及其应用

摘要

本发明公开了一种非小细胞肺癌致病基因及其应用。一种非小细胞肺癌致病基因，序列如SEQ ID NO.1所示。利用特异性反义寡核苷酸下调CTD‑2245E15.3表达，会在体外和体内显著抑制肺癌细胞生长。通过构建原位肺癌模型，观察lncRNA在体内的促癌作用，实验发现，CTD‑2245E15.3过表达显著增加肺部肿瘤负荷。CTD‑2245E15.3作为原癌基因lncRNA在合成代谢过程中起重要作用。因此，CTD‑2245E15.3可以作为治疗靶点在制备和筛选治疗NSCLC的药物中应用。能够抑制CTD‑2245E15.3或下调CTD‑2245E15.3表达的物质也可用于制备治疗NSCLC的药物。

权利要求

1.SEQ ID NO.1所示的LncRNA CTD‑2245E15.3作为致病基因在筛选非小细胞肺癌治疗药物中的应用。

2.抑制SEQ ID NO.1所示的LncRNA CTD‑2245E15.3或下调其表达的物质在制备非小细胞肺癌治疗药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的下调LncRNA CTD‑2245E15.3表达的物质为LncRNA CTD‑2245E15.3的特异性反义寡核苷酸。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的LncRNA CTD‑2245E15.3的特异性反义寡核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

说明书

一种非小细胞肺癌致病基因及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种非小细胞肺癌致病基因及其应用。

背景技术

[0002] 非小细胞肺癌(NSCLC)是近年来全球恶性肿瘤死亡的主要原因。早期NSCLC患者无明显症状，多数确诊时已表现为局部晚期或发生肿瘤转移。临床上对于早期患者多采用手
术为主的治疗原则；晚期NSCLC患者则多以放化疗、靶向药物及免疫治疗为主，然而患者的
预后较差，其5年生存率不足15％，多数患者对化疗药物最终产生耐药性。因此，针对肺癌早
期诊断及发病机制的研究是当前亟需解决的一大难题。

[0003] 长链非编码RNA(lncRNA)是大于200个碱基的长转录本，基本不具备蛋白质编码的潜能。越来越多的证据表明lncRNA在人类癌症的发生发展中起着关键的调节作用。深度测
序结果显示成千上万种lncRNA在不同类型的癌症中异常表达。目前，研究人员已鉴定出一
些具有致癌或抑癌功能的lncRNAs，它们可驱动许多重要的癌症表型，包括增殖，迁移，转移
和基因组不稳定性。LncRNA通过与其他细胞大分子(包括DNA，蛋白质和RNA)的相互作用，广
泛地参与了基因表达网络的多个层次。

[0004] 目前，尽管人们报道了几种lncRNA在NSCLC中的作用，但是仍然有相当多的lncRNA功能未知，包括完整序列、促癌或抑癌、作用机制等。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种非小细胞肺癌致病基因。

[0006] 本发明的另一目的是提供该基因的应用。

[0007] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：

[0008] 一种非小细胞肺癌致病基因LncRNA CTD‑2245E15.3，序列如SEQ ID NO.1所示。

[0009] SEQ ID NO.1所示的LncRNA CTD‑2245E15.3作为治疗靶点在制备非小细胞肺癌治疗药物中的应用。

[0010] SEQ ID NO.1所示的LncRNA CTD‑2245E15.3作为致病基因在筛选非小细胞肺癌治疗药物中的应用。

[0011] 抑制SEQ ID NO.1所示的LncRNA CTD‑2245E15.3或下调其表达的物质在制备非小细胞肺癌治疗药物中的应用。

[0012] 作为本发明的一种优选，所述的下调LncRNA CTD‑2245E15.3表达的物质为LncRNA CTD‑2245E15.3的特异性反义寡核苷酸、siRNA/shRNA、锌指核酸酶(ZNF)、转录激活因子样
效应核酸酶(TALENs)、CRISPR/Cas9基因编辑系统、小分子抑制剂或腺病毒、慢病毒。

[0013] 作为本发明的进一步优选，所述的LncRNA CTD‑2245E15.3的特异性反义寡核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

[0014] 有益效果：

[0015] 本发明首次报告一种新的lncRNA，CTD‑2245E15.3，它通过促进合成代谢酶乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)和丙酮酸羧化酶(PC)从而促进肺癌细胞生长。首先，基于lncRNA芯片的
应用，我们在NSCLC中鉴定了一组差异表达的lncRNA，并使用定量实时聚合酶链反应(qRT‑
PCR)进行验证。在验证的10条lncRNA中，CTD‑2245E15.3在NSCLC中上调的倍数最高。随后，
我们利用RACE技术鉴定出该lncRNA的全长序列‑685bp。利用特异性反义寡核苷酸
(antisense oligonucleotide,ASO)下调CTD‑2245E15.3表达，会在体外和体内显著抑制肺
癌细胞生长。通过向肺部注射肺癌细胞A549，构建原位肺癌模型，观察lncRNA在体内的促癌
作用，实验发现，CTD‑2245E15.3过表达显著增加肺部肿瘤负荷。通过RNA pull‑down联合质
谱检测，我们发现CTD‑2245E15.3通过与ACC1和PC结合来发挥其致癌功能；ACC1和PC是迅速
增殖的肿瘤细胞中生物分子合成的关键代谢因子。这些发现揭示了CTD‑2245E15.3作为原
癌基因lncRNA在合成代谢过程中的重要作用。因此，CTD‑2245E15.3可以作为治疗靶点在制
备和筛选治疗NSCLC的药物中应用。而能够抑制CTD‑2245E15.3或下调CTD‑2245E15.3表达
的物质也可用于制备治疗NSCLC的药物。

附图说明

[0016] 图1、A.Arraystar lncRNA芯片分析，B.qRT‑PCR验证根据芯片分析得到的10条差异表达lncRNA，C.qRT‑PCR分析CTD‑2245E15.3在15例NSCLC肿瘤及其配对的非肿瘤组织中
的表达

[0017] 图2、A.RACE技术分别得到的CTD‑2245E15.3 5'端、3'端以及全长序列电泳图，B.CTD‑2245E15.3在染色体上的位置示意图，C.人CTD‑2245E15.3完整全长序列，D.CTD‑
2245E15.3的编码能力分析

[0018] 图3、A.使用特异性ASO沉默肺癌细胞中的CTD‑2245E15.3，B.CCK8实验分析CTD‑2245E15.3下调抑制肺癌细胞生长，C.A549稳转细胞株中CTD‑2245E15.3过表达确认，
D.CCK8实验分析CTD‑2245E15.3过表达促进肺癌细胞生长

[0019] 图4、皮下植瘤模型，A.植瘤第14天起，每三天测量一次肿瘤大小，B.五周后，解剖取肿瘤称重

[0020] 图5、原位肺癌模型，A.肺肿瘤的CTD‑2245E15.3表达量，B.CTD‑2245E15.3过表达会显著增加肺部肿瘤负荷，C.CTD‑2245E15.3过表达组的肺肿瘤体积显著大于对照组

[0021] 图6、lncRNA pull‑down蛋白银染图

具体实施方式

[0022] 实施例1筛选NSCLC中差异表达的lncRNAs

[0023] 1.1 Arraystar LncRNA基因芯片分析：

[0024] lncRNA芯片分析是由Aksomics(中国上海)进行的。简而言之，将样品(五个NSCLC组织和五个对应的非肿瘤组织)用于合成双链互补DNA，将其进一步标记并与人LncRNA表达
微阵列(Arraystar，Rockville，MD)杂交。杂交和洗涤后，用安捷伦DNA微阵列扫描仪扫描处
理过的玻片。使用安捷伦特征提取软件来分析获取的阵列图像。使用GeneSpring GX v12.1
软件包(Agilent Technologies)执行分位数归一化和后续数据处理。通过P值/FDR过滤，鉴
定了两组之间具有统计学意义的差异表达lncRNA。上调和下调基因的阈值设置是倍数变化
>＝2.0和P值<＝0.05。结果见图1A，由图1A可见：CTD‑2245E15.3在NSCLC中上调。

[0025] 1.2 qRT‑PCR检测NSCLC与配对的非肿瘤组织之间差异表达的lncRNAs

[0026] 为了验证芯片的发现，我们选择了10个差异表达大的lncRNAs，采用实时定量逆转录PCR(qRT‑PCR)对芯片同批样本(五个NSCLC组织和五个对应的非肿瘤组织的总RNA)进行
分析(图1B)，其中，CTD‑2245E15.3在NSCLC肿瘤中的相对表达水平最高(肿瘤与正常组织的
倍数变化>10)。设计并委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成表1所示引物：

[0027] 表1引物序列信息

[0028]

[0029]

[0030] (1)逆转录反应

[0031] lncRNA和mRNA逆转录反应体系如下表2和表3所示：

[0032] 表2 lncRNA逆转录反应体系

[0033]

[0034] 表3 mRNA逆转录反应体系

[0035]

[0036] 其中，lncRNA在进行逆转录前，需要与Oligo(dT)、Random Primer(N9)及适量的DEPC水混匀，在70℃下加热10min以破坏其二级结构后，再与母液混合进行下述逆转录反
应。

[0037] lncRNA或mRNA逆转录反应程序如表4所示：

[0038] 表4 lncRNA或mRNA的逆转录反应程序

[0039]

[0040] 逆转录后的样品可保存于‑20℃或进行后续的qRT‑PCR实验。

[0041] (2)PCR反应

[0042] lncRNA或mRNA的PCR反应体系如表5所示：

[0043] 表5 lncRNA或mRNA的PCR反应体系

[0044]

[0045] lncRNA或mRNA的PCR反应程序如表6所示：

[0046] 表6 lncRNA或mRNA的PCR反应程序

[0047]

[0048]

[0049] PCR实验中所有反应均为一式三份，反应结束后，依据扩增曲线选取合适的阈值以得到每个复孔的Ct值，将lncRNA的表达水平相对于GAPDH mRNA进行归一化处理。

[0050] 结果见图1B，由图1B可见，较之正常肺部组织,10条lncRNA中，CTD‑2245E15.3在NSCLC中显著上调，且上调的倍数最高。

[0051] 1.3扩大样本量验证CTD‑2245E15.3在NSCLC中表达上调

[0052] 收集另一批NSCLC肿瘤及其配对的非肿瘤组织(n＝15)，采用qRT‑PCR检测CTD‑2245E15.3的表达，结果见图1C，进一步证实CTD‑2245E15.3在NSCLC肿瘤组织中表达上调。

[0053] 实施例2、鉴定完整全长序列——RACE技术：

[0054] 使用5'或3'RACE试剂盒(Clontech)快速扩增cDNA末端，进行5'RACE和3'RACE鉴定CTD‑2245E15.3末端的确切位置。

[0055] 5’RACE：根据数据库的预测序列设计合成特异性引物5'RACE‑GSP1、5'RACE‑GSP2，按照试剂盒的说明方法扩增5’端序列，测序；

[0056] 3’RACE：根据数据库的预测序列设计合成特异性引物3'RACE‑GSP1、3'RACE‑GSP2，按照试剂盒的说明方法扩增3’端序列，测序；

[0057] 全长扩增：根据5’、3’RACE的序列，使用两端引物PCR扩增出完整全长，测序。

[0058] 表7 RACE的引物

[0059] RACE primers Sequence5'RACE‑GSP1 GAACACGCGGGAAATTTTGGGGTG
5'RACE‑GSP2 GCTGGCATCTGAGTGTCACAGGGAT
3'RACE‑GSP1 CCGCAGGACTCCAGGGAACAAG
3'RACE‑GSP2 GATGGAATGAGAATTGAGAAGCAG

[0060] 结果见图2A，5'‑RACE(左)、3'‑RACE(中)以及全长CTD‑2245E15.3(右)PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。左侧显示分子量(碱基对)，右侧箭头标记了PCR产物主条带。

[0061] 图2B展示了CTD‑2245E15.3在染色体上的位置，并标出5'和3'末端；图2C显示了人CTD‑2245E15.3的完整全长序列(685bp,SEQ ID NO.1)。

[0062] 图2D使用编码潜能评估工具(http://lilab.research.bcm.edu/cpat/index.php)对CTD‑2245E15.3的编码能力进行了评估，结果显示该编码能力非常低，与众所
周知的lncRNA MALAT1，FENDRR和lincRNA‑p21相当，提示CTD‑2245E15.3转录本不编码蛋白
质。

[0063] 实施例3、利用反义寡核苷酸(ASO)特异性下调lncRNA表达：

[0064] 3.1 ASO的设计与序列信息

[0065] 本发明中所使用的ASO由广州锐博生物科技设计并合成，序列信息如表8所示。

[0066] 表8 ASO序列信息

[0067]

[0068] 3.2细胞转染

[0069] 细胞转染步骤如下：

[0070] A、在转染前一天，将细胞接种于6孔板中，24h后贴壁细胞密度至70‑80％；

[0071] B、用适量的opti‑MEM培养基稀释ASO‑1、ASO‑2、ncRNA(200pmol/孔)以及Lipofectamine 2000(5μl/孔)，移液枪吹打混匀，室温下孵育15min；

[0072] C、将6孔板从细胞培养箱中取出，吸除原细胞培养液，PBS润洗细胞表面后吸除细胞表面液体；

[0073] D、将上述孵育好的转染工作液加入6孔板中，使用opti‑MEM补齐体积至2ml/孔，轻轻摇匀后，置于37℃细胞培养箱中进行细胞转染；

[0074] E、转染4‑6h后，吸除原培养液，更换为新的含血清DMEM培养基或进行下一步实验处理。

[0075] F、换液后24h，提取细胞总RNA。

[0076] 3.3检测CTD‑2245E15.3表达量

[0077] 检测A549,H358,PC‑9细胞中CTD‑2245E15.3的沉默效率，具体如下：

[0078] A、如前所述进行细胞转染操作24h后，收集细胞，使用Trizol试剂提取总RNA；

[0079] B、使用qRT‑PCR方法检测细胞中CTD‑2245E15.3的表达量。

[0080] 结果见图3A，由图可见：与阴性对照RNA(ncRNA)相比，两条ASO能够显著下调CTD‑2245E15.3表达水平。

[0081] 3.4 CCK8实验：

[0082] 在A549,H358,PC‑9细胞中以细胞转染的方式沉默CTD‑2245E15.3后，采用CCK‑8实验分析细胞生长情况，具体步骤如下：

[0083] A、如前所述进行细胞转染操作，转染4h后，消化并收集细胞于1.5ml EP管，室温下800g离心3min，吸除上清液，每管加入1ml新的含血清DMEM培养基重悬细胞；

[0084] B、取10μl细胞悬液，并使用血细胞计数板进行细胞计数；

[0085] C、将细胞以5×103/孔的密度接种于96孔板中，置于37℃细胞培养箱中分别培养0/24/48/72h；

[0086] D、取出上述步骤中的96孔板，避光条件下配制CCK‑8工作液(含10％CCK‑8原液的DMEM培养基)，使用吸泵吸除96孔板中的培养液，并加入配制好的CCK‑8工作液，每孔100μl；

[0087] E、置于37℃的细胞培养箱中孵育1h后，使用酶标仪测定450nm波长下的OD值。

[0088] 结果见图3B，由图可见利用特异性反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)下调CTD‑2245E15.3表达，会在体外显著抑制肺癌细胞生长。

[0089] 实施例4构建lncRNA过表达的A549稳转细胞株：

[0090] 4.1 A549细胞株的细胞培养及传代

[0091] 细胞培养：A549细胞株购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所，使用DMEM培养基(10％胎牛血清，100U/ml青霉素和链霉素)，在温度为37℃、CO2浓度为5％的细
胞培养箱中进行细胞培养。

[0092] 细胞传代：A549是贴壁生长型细胞，当细胞密度达80‑90％时进行传代，倒掉原细胞培养液，使用PBS润洗细胞后吸除细胞表明液体，加入适量37℃下预热的胰酶，置于37℃
的细胞培养箱中消化3min，轻拍培养皿侧壁至细胞脱落，立即加入适量上述细胞培养基终
止消化，使用移液枪将细胞吹打混匀，转移至15ml离心管中，常温下800g离心3min，吸除上
清液，使用上述细胞培养基重悬细胞，并转移至新的细胞培养皿中进行细胞培养。

[0093] 4.2稳转细胞株构建

[0094] 对于CTD‑2245E15.3的过表达，GenePharma公司(中国上海)合成了根据RACE技术得到的人全长CTD‑2245E15.3 cDNA。

[0095] 委托GenePharma公司生产表达CTD‑2245E15.3的慢病毒以及阴性对照(NC)慢病毒：

[0096] 一、慢病毒包装

[0097] 1. 293T细胞在10cm培养皿中培养至80‑90％融合时，接种15cm培养皿。

[0098] 2.倾去培养液，用1ml D‑Hank’s solution洗涤细胞两次。

[0099] 3.加入1ml Trypsin‑EDTA solution,混匀后，37℃放置2‑3分钟。

[0100] 4.吸去胰酶溶液，加入2ml含10％FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。

[0101] 5.将细胞悬液接种15cm培养皿，加入18ml含10％FBS的DMEM培养液，混匀后37℃ 5％CO2培养过夜。

[0102] 6.在一支无菌的5ml离心管中加入1.5ml无血清DMEM，按比例加入穿梭质粒A8180和包装质粒(pGag/Pol、pRev、pVSV‑G)，混匀，取另一支无菌的5ml离心管，加入1.5ml无血清
DMEM，再加入300μl RNAi‑mate，混匀，室温放置5分钟后将两管混合，室温放置20～25分钟。

[0103] 7.除去15cm培养皿中的培养液，加入8ml无血清的DMEM培养液。

[0104] 8.将转染混合物逐滴加入15cm培养皿中，轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物，在37℃5％CO2培养箱中温育4‑6小时。

[0105] 9.弃转染液，加入18ml含10％FBS的DMEM培养液。37℃5％CO2继续培养72小时。

[0106] 二、慢病毒收集

[0107] 1.将培养皿中细胞上清液吸到50ml离心管中，4℃，4000rpm，4min。

[0108] 2.低速离心后，将离心管上清液倒入50ml注射器内，用0.45um过滤器过滤。

[0109] 3.滤液在离心机中进行超速离心，4℃，20000rpm，2h。

[0110] 4.将浓缩液收集分装至出货管中。

[0111] 5.分装的病毒液贴上标签，‑80℃冰箱保存。

[0112] 三、慢病毒滴度检测

[0113] 1. 293T细胞在10cm dish中培养至80‑90％融合时，倾去培养液，用3ml D‑Hank’s solution洗涤细胞两次。

[0114] 2.加1ml Trypsin‑EDTA solution,混匀后，吸去胰酶溶液，37℃放置3‑5分钟。

[0115] 3.在加入2ml含10％FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。

[0116] 4.按3×104细胞/孔的浓度接种96孔板，混匀后于37℃5％CO2培养24h。

[0117] 5.将慢病毒原液(10‑20ul),用10％FBS的DMEM培液十倍稀释3‑5个梯度(根据细胞状态，如有必要可加入终浓度为5ug/ul的Polybrene)。

[0118] 6.吸去96孔板中的培养液，每孔加入100μl稀释的病毒液，同时设立空白对照组，于37℃ 5％CO2培养24h。

[0119] 7.弃96孔板中的稀释病毒液，每孔加入100μl 10％FBS的DMEM培液，(根据细胞状态，如有必要可分出1/3‑1/5)于37℃ 5％CO2继续培养72h。

[0120] 8.通过荧光显微镜或FACS计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度。慢病毒侵5
染细胞：将A549细胞以每孔1x10 的密度接种在6孔板上，然后将10μl慢病毒添加到1ml 
DMEM培养基中，该培养基中添加了2％灭活的FBS和5μg/ml的Polybrene。24小时后，将1ml含
2％灭活FBS的DMEM培养基添加到6孔板中，感染后48h，用1μg/ml嘌呤霉素选择转导的细胞
48h。通过向培养基中添加1μg/ml嘌呤霉素培养3代来建立稳定的细胞系。通过qRT‑PCR验证
了CTD‑2245E15.3在稳转的A549细胞中的过表达效率，结果见图3C，由图可见稳转的A549细
胞中，CTD‑2245E15.3的表达量显著高于阴性对照。

[0121] 4.3 CCK8实验

[0122] 采用CCK‑8实验分析稳转的A549细胞生长情况，结果见图3D，由图可见CTD‑2245E15.3过表达会促进肺癌细胞生长。

[0123] 实施例5下调CTD‑2245E15.3表达，会在体内显著抑制肺癌细胞生长

[0124] 5.1皮下植瘤

[0125] 分别制备ncRNA和CTD‑2245E15.3 ASO处理的PC‑9细胞悬液，皮下注射到裸鼠的腹侧，从而评估CTD‑2245E15.3敲降对异种移植肿瘤形成的影响。结果见图4,CTD‑2245E15.3
敲降后异种移植的PC‑9细胞的生长速度明显慢于ncRNA对照(图4A)，解剖称量肿瘤也比对
照组更轻(图4B)。

[0126] 实施例6

[0127] 6.1原位肺癌模型：

[0128] 通过腹腔注射1％戊巴比妥纳麻醉BALB/c裸鼠，然后将小鼠仰卧位固定于无菌纱布上。剔除手术部位的毛发，碘伏消毒皮肤，95％酒精脱碘。在左腋前线肋弓上约1.5cm处做
一个5mm的皮肤切口，逐层分离皮肤和皮下组织，暴露胸壁，至观察左肺随着呼吸上下运动。
6
用胰岛素注射器抽取100μL细胞悬液(50ul 5×10 A549细胞混合50ul Matrigel基质胶)，
再注射入左肺，进针深度约3mm，注射后停留数秒，缓慢拔针，防止液体流出。逐层缝合切口。
术后用碘伏消毒创部，继续饲养，自由进食、饮水。在接种后第37天解剖肺组织，结果见图5。

[0129] 图5A通过qRT‑PCR确认了过表达组的肺肿瘤中CTD‑2245E15.3表达水平显著高于NC对照组(n＝3)。图5B‑C分析了每组每只小鼠的平均肺肿瘤面积(n＝8)，并将肿瘤面积计
算为总肺面积的百分比，结果显示，与NC相比，CTD‑2245E15.3的过表达导致总肿瘤负荷(图
5B)和平均肿瘤大小(图5C)显著增加。

[0130] 实施例7、通过RNA pull‑down找到lncRNA的结合蛋白：

[0131] 将生物素化的CTD‑2245E15.3或EGFP RNA与A549全细胞裂解液一起孵育；细胞裂解液制备：将1000万个细胞重悬于1ml IP缓冲液(20mM Tris pH 7.4、150mM NaCl，1％NP‑
40，1mM EDTA，0.5mM DTT，1mM NaF，蛋白酶抑制剂和RNase抑制剂)中，短暂超声处理。孵育
后，通过链霉亲和素磁珠回收RNA‑蛋白质复合物，在IP缓冲液中洗涤五次，并在SDS上样缓
冲液中洗脱。通过SDS‑PAGE分离结合蛋白，经银染可视化。结果见图6，图中箭头指示与阴性
对照EGFP RNA相比，仅在CTD‑2245E15.3样品中出现的特定蛋白条带。切下这五个条带进行
质谱分析，ACC1(乙酰辅酶A羧化酶1)和PC(丙酮酸羧化酶)被鉴定为丰度最高的蛋白。

[0132] 本发明的发明点在于发现LncRNA CTD‑2245E15.3为非小细胞肺癌致病基因,一切能够下调LncRNA CTD‑2245E15.3表达的物质均能够用于制备非小细胞肺癌治疗药物,比如
特异性反义寡核苷酸、siRNA/shRNA、锌指核酸酶(ZNF)、转录激活因子样效应核酸酶
(TALENs)、CRISPR/Cas9基因编辑系统、小分子抑制剂或腺病毒、慢病毒等,实施例中仅以两
条不同的特异性反义寡核苷酸为例降低LncRNA CTD‑2245E15.3表达量,探索LncRNA CTD‑
2245E15.3与非小细胞肺癌之间的关系,并不能因此限定本发明保护范围,更不能因此将本
发明保护范围限定为仅实施例中所述的两条特异性反义寡核苷酸用于制备非小细胞肺癌
治疗药物。