HAK基因在调控植物性状中的作用

摘要

本发明提供了一种HAK基因在调控植物性状中的作用。具体地，本发明提供了一种物质的用途，用于改进植物的性状或制备调控植物形状的制剂或组合物，其中，所述植物的性状包括选自下组的一种或多种性状：(i)根长、根分枝和/或根重；(ii)株高；和(iii)耐盐性；其中，所述物质选自下组：(a)HAK蛋白；(b)编码HAK蛋白的核酸序列；(c)HAK蛋白及其编码核酸序列的促进剂；或其组合。本发明的HAK蛋白或其突变蛋白以及相应的方法，可实现对抗倒伏、生物量、抗盐等性状的调控，对于培育优质、高产、耐逆的植物新品种具有重要的科学价值。

权利要求

+

1.HAK20蛋白或HAK20蛋白促进剂的用途，其特征在于，用于调控植物体内Na 转运或制+备调控植物体内Na转运的制剂或组合物；

所述HAK20蛋白来源于番茄，所述HAK20蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；

并且，所述植物为番茄。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途还包括下组的任意一种或其组合：+

i、调节植物根部Na离子的积累；

+

ii、促进Na向木质部的转运及从木质部卸载；

+ +

iii、降低根部和地上部位的Na/K比。

3.一种突变蛋白的用途，所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: + + + +14所示，其特征在于，用于降低植物体内Na/K比或制备降低植物体内Na /K比的制剂或组合物，其中所述植物为番茄。

4.一种改良植物性状的方法，其特征在于，包括步骤：(i) 提供一植物或植物细胞；和(ii) 将突变蛋白或其编码核酸导入所述植物或植物细胞，从而改良植物的性状；所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14所示，所述改良植物性状为降低植物+ +体内Na/K比；

并且，所述植物为番茄。

5.一种检测植物耐盐性的方法，其特征在于，所述的方法包括检测HAK突变体的表达活性和/或表达量的步骤，所述HAK突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14所示；

并且，所述植物为番茄。

说明书

HAK基因在调控植物性状中的作用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物学领域，尤其植物生物学领域，具体涉及HAK基因在调控植物性状中的作用。

背景技术

[0002] 现有技术报道KUP/HAK/KT家族是生物界内最早发现、数目最多、功能最丰富的的钾转运家族，广泛存在于多个物种。它即介导植物在低钾胁迫中的钾吸收，又参与植物细胞增大、根部生长素的运输等生理过程该家族基因的表达受植物自身生长发育调节因子和环境刺激等因素的调控，参与植物的生长发育和逆境响应机制。KUP(K+uptake permease)首先在大肠杆菌中发现，负责编码大肠杆菌钾吸收透性酶；HAK(high‑affinity K+)是在许旺氏酵母中中鉴定得到的KUP同源基因。KT(K+transporter)是在拟南芥中发现的具有钾转运功能的转运体。

[0003] 盐胁迫是植物主要的非生物胁迫之一，它会引发植物多条代谢通路的改变，因而产生复杂的生理水平变化，主要表现为离子失衡、水分亏缺及氧化毒害，进而导致植物光合作用下降、能耗增加、衰老加速、生长受限、产量和品质下降。植物提高自身盐胁迫抗性的主要方式之一是通过木质部薄壁组织调节体内钾(K)和钠(Na)的转运。对盐胁迫的耐受性体现在对Na+毒害作用的适应以及自身K+营养的维持，拥有较高K+/Na+比值的植物对盐胁迫的耐受力更强。

[0004] 研究报道，KUP/HAK/KT家族基因也受高盐逆境胁迫的诱导，然而截止目前，HAK众多亚型中发挥抗盐性的基因及其机制并不是很清楚。

[0005] 因此，本领域迫切需要解析相关基因的作用机制并开发出一种能够增强植物对高盐逆境的耐受性的方法。

发明内容

[0006] 本发明的目的就是提供一种通过调控HAK基因，增强植物对高盐逆境的耐受性的方法。进一步的提供一种通过介导Na+的调控实现增强植物抗盐性的方法。

[0007] 本发明的另一目的是提供一种HAK基因及其突变体在增强植物耐盐性中的用途，通过过表达该基因或突变获得活性更优的突变蛋白可以显著增强植物的耐盐性。

[0008] 在本发明的第一方面，提供了一种物质的用途，用于改进植物的性状或制备调控植物形状的制剂或组合物，其中，所述植物的性状包括选自下组的一种或多种性状：(i)根长、根分枝和/或根重；(ii)株高；和(iii)耐盐性；

[0009] 其中，所述物质选自下组：(a)HAK蛋白；(b)编码HAK蛋白的核酸序列；(c)HAK蛋白及其编码核酸序列的促进剂；或其组合。

[0010] 在另一优选例中，所述HAK蛋白包括野生型HAK蛋白和HAK蛋白突变体。

[0011] 在另一优选例中，所述HAK蛋白具有介导植物中Na+转运的功能。

[0012] 在另一优选例中，所述野生型HAK蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

[0013] 在另一优选例中，所述的HAK蛋白突变体的序列与其所源自的序列相比具有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少
98％或至少99％序列同一性。

[0014] 在另一优选例中，所述其所源自的序列为野生型HAK蛋白的氨基酸序列。

[0015] 在另一优选例中，所述用途还包括调控植物体内Na+离子转运，体现在如下i‑iv中的一种或任意几种：

[0016] i、调节植物根部Na+离子的积累；ii、促进中Na+向木质部的转运及从木质部卸载；iii、降低根部和地上部位的Na+/K+比。

[0017] 在另一优选例中，所述植物包括被子植物和裸子植物。

[0018] 在另一优选例中，所述裸子植物选自下组：苏铁科(Cycadaceae)、罗汉松科(Podocarpaceae)、南洋杉科(Araucariaceae)、松科(Pinaceae)、杉科、柏科、三尖杉科、红豆杉科、麻黄科、买麻藤科、单型科、百岁兰科、或其组合。

[0019] 在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

[0020] 在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。

[0021] 在另一优选例中，所述草本植物选自下组：茄科、禾本科植物、豆科植物、或其组合。

[0022] 在另一优选例中，所述木本植物选自下组：猕猴桃科、蔷薇科、桑科、或其组合。

[0023] 在另一优选例中，所述植物选自下组：十字花科植物、禾本科植物、豆科植物、茄科、猕猴桃科、锦葵科、芍药科、蔷薇科、百合科、或其组合。

[0024] 在另一优选例中，所述的植物选自下组：拟南芥、水稻、大豆、番茄、玉米、高粱、藜麦、谷子、马铃薯、烟草、小麦、高粱、油菜、菠菜、生菜、白菜、黄瓜、茼蒿、空心菜、芹菜、油麦菜或其组合。

[0025] 在另一优选例中，所述HAK基因来源于：裸子植物或被子植物。

[0026] 在另一优选例中，所述HAK基因来源于单子叶植物或双子叶植物。

[0027] 在另一优选例中，所述HAK基因来源于草本植物和木本植物。

[0028] 在另一优选例中，所述HAK基因来源于茄科植物、禾本科植物、豆科植物、或其组合。

[0029] 在另一优选例中，所述HAK基因来源于猕猴桃科、蔷薇科、桑科、或其组合。

[0030] 在另一优选例中，所述HAK基因来源于十字花科植物、禾本科植物、豆科植物、茄科、猕猴桃科、锦葵科、芍药科、蔷薇科、百合科、或其组合。

[0031] 在另一优选例中，所述HAK基因来源于拟南芥、水稻、大豆、番茄、玉米、高粱、藜麦、谷子、马铃薯、烟草、小麦、高粱、油菜、菠菜、生菜、白菜、黄瓜、茼蒿、空心菜、芹菜、油麦菜或其组合。

[0032] 在另一优选例中，所述的编码HAK蛋白的核酸序列为选自下组的基因的核酸序列：SlHAK20、OsHAK4、OsHAK17、ZmHAK4、SbHAK9、SbHAK26、GrHAK8、GmHAK12、PtHAK21、MdHAK5，或其组合。

[0033] 在另一优选例中，所述的编码HAK蛋白的核酸序列选自下组：来源于番茄的SlHAK20基因、来源于水稻的OsHAK4或OsHAK17基因。

[0034] 在另一优选例中，所述HAK蛋白的氨基酸序列选自下组：

[0035] (i)具有SEQ ID NO:2、4或6所示氨基酸序列的多肽；

[0036] (ii)将如SEQ ID NO:2、4或6所示的氨基酸序列经过一个或多个(如1‑10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控植物性状功能的由(i)衍生的多肽；或[0037] (iii)氨基酸序列与SEQ ID NO:2、4或6所示的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的，并且具有介导植物中+
Na转运的功能的多肽。

[0038] 在另一优选例中，所述编码HAK蛋白的核苷酸序列选自下组任一种或其组合：

[0039] (a)编码如SEQ ID NO:2、4或6所示多肽的多核苷酸；

[0040] (b)如SEQ ID NO:1、3或5所示的核苷酸序列；或

[0041] (c)与SEQ ID NO:1、3或5所示的核苷酸序列相比具有一个或多个碱基的取代、缺失或添加(例如1‑10个)的序列；

[0042] (d)与SEQ ID NO:1、3或5所示的核苷酸序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％序列同一性的核苷酸序列；

[0043] (e)在SEQ ID NO:1、3或5所示的核苷酸序列的5’端和/或3’端截短或添加1‑60个(较佳地1‑30个，更佳地1‑10个)核苷酸的核苷酸序列；

[0044] (f)与(a)‑(e)中任一所述的核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

[0045] 在另一优选例中，所述HAK蛋白突变体是SlHAK20蛋白突变体。

[0046] 在另一优选例中，所述编码HAK蛋白突变体的核酸序列是SlHAK20核酸序列突变体。

[0047] 在另一优选例中，所述的蛋白突变形式包括一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加。

[0048] 在另一优选例中，所述HAK蛋白突变体的氨基酸序列包括：

[0049] (i)在SEQ ID NO:2、4或6所示的氨基酸序列的基础上，在C端缺失10‑600个(优选地100‑500个，更优选地400‑500个，更优选地450‑480个，更优选地460‑48个0，更优选地470‑480个)氨基酸残基，所形成的氨基酸序列；和

[0050] (ii)任选地，位于所述氨基酸所述序列的C端的通过细胞修复机制添加的数量不等、序列随机的氨基酸片段。

[0051] 在另一优选例中，所述的数量不等、序列随机的氨基酸片段包括1‑100个氨基酸、优选1‑50个氨基酸，优选1‑30个氨基酸，优选5‑25个氨基酸，优选10‑20个氨基酸。

[0052] 在另一优选例中，所述的缺失的方式优选为在C段氨基酸的连续缺失。

[0053] 在另一优选例中，所述的缺失的氨基酸数量超过SEQ ID NO:2、4或6所示的氨基酸序列中氨基酸数量的二分之一。

[0054] 在另一优选例中，所述的HAK蛋白突变体与SEQ ID NO:2、4或6所示的氨基酸序列相比具有至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％序列同一性。

[0055] 在另一优选例中，所述的突变蛋白至少基本保留其所源自的序列的生物学功能。

[0056] 在另一优选例中，所述HAK蛋白突变体序列选自下组：

[0057] (i)具有SEQ ID NO:12或14所示氨基酸序列的多肽；

[0058] (ii)将如SEQ ID NO:12或14所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1‑10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控植物性状功能的由(i)衍生的多肽；或[0059] (iii)氨基酸序列与SEQ ID NO:12或14所示的氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，具有调控植物中Na+转运的功能的多肽。

[0060] 在另一优选例中，所述编码HAK蛋白突变体的核苷酸序列选自下组：

[0061] (a)编码如SEQ ID NO:12或14所示多肽的多核苷酸；

[0062] (b)如SEQ ID NO:11或13所示的核苷酸序列；或

[0063] (c)与SEQ ID NO:11或13所示的核苷酸序列相比具有一个或多个碱基的取代、缺失或添加(例如1‑10个)的序列；

[0064] (d)与SEQ ID NO:11或13所示的核苷酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)的核苷酸序列；

[0065] (e)在SEQ ID NO:11或13所示的核苷酸序列的5’端和/或3’端截短或添加1‑60个(较佳地1‑30个，更佳地1‑10个)核苷酸的核苷酸序列；

[0066] (f)与(a)‑(e)中任一所述的核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

[0067] 在另一优选例中，所述的编码突变体的核酸序列是通过自然诱变或基因编辑技术获得。

[0068] 在另一优选例中，所述基因编辑技术包括TALEN、ZIN、CRISPR。

[0069] 在另一优选例中，所述组合物包括农用组合物。

[0070] 在另一优选例中，所述组合物进一步包括农学上可接受的载体。

[0071] 在另一优选例中，所述组合物中，所述物质的含量即(a)HAK蛋白；(b)编码HAK蛋白的核酸序列；(c)HAK蛋白及其编码核酸序列的促进剂；或其组合，为0.0001‑99wt％，较佳地0.1‑90wt％，更佳地1‑80wt％，以所述组合物的总重量计。

[0072] 在另一优选例中，所述组合物或制剂的剂型选自下组：溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、或其组合。

[0073] 在另一优选例中，所述促进剂包括促进HAK基因或其编码蛋白表达的小分子化合物。

[0074] 在另一优选例中，所述的促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子、或其组合。

[0075] 在本发明的第二方面，提供了一种改良植物性状的方法，包括步骤：调节所述植物中HAK蛋白或其编码核酸序列的表达量和/或活性，从而改良植物的形状。

[0076] 在另一优选例中，所述植物的性状改良选自下组一种或多种：

[0077] (i)增加根长和/或根分枝；

[0078] (ii)增加株高；和

[0079] (iii)增强耐盐性。

[0080] 在另一优选例中，所述的性状改良还包括：(iv)促进植物体内Na+离子转运。

[0081] 在另一优选例中，所述调节所述植物中HAK蛋白或其编码核酸的表达量和/或活性包括：

[0082] (a)增强所述植物中内源的HAK蛋白或其编码核酸序列的表达量和/或活性；

[0083] (b)导入外源的HAK蛋白或其编码核酸序列，或HAK蛋白突变体或其编码核酸序列，使所述植物具有外源的HAK蛋白或其编码核酸序列，或HAK蛋白突变体或其编码核酸序列的表达量和/或活性；或

[0084] (c)施用HAK蛋白及其编码核酸序列的促进剂。

[0085] 在另一优选例中，所述植物中HAK蛋白突变体或其编码核酸序列的活性E1与同种类型的植物中的相同野生型HAK蛋白或其编码核酸序列的本底活性E0之比(E1/E0)≥1.5倍，≥2倍，较佳地≥5倍，更佳地≥10倍。

[0086] 在另一优选例中，所述方法包括步骤：

[0087] (i)提供一植物或植物细胞；和

[0088] (ii)将HAK蛋白或其编码核酸、或其促进剂，或HAK蛋白突变体或其编码核酸导入所述植物或植物细胞，从而改良植物的性状。

[0089] 在另一优选例中，所述方法包括步骤：

[0090] (i)提供一植物或植物细胞；和

[0091] (ii)导入基因编辑的工具，使其与植物内核苷酸序列接触，突变获得HAK蛋白突变体的核苷酸序列,从而改良植物的性状。

[0092] 在另一优选例中，所述的导入的方法包括：农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、电击法、超声波法和聚乙二醇(PEG)介导法。

[0093] 在本发明的第三方面，提供了一种突变蛋白，所述突变蛋白的氨基酸序列选自下组：

[0094] (i)在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的基础上，在C端缺失10‑600个(优选地100‑500个，更优选地400‑500个，更优选地450‑480个)氨基酸残基，所形成的氨基酸序列；和[0095] (ii)任选的，位于所述氨基酸所述序列的C端的通过细胞修复机制添加的数量不等、序列随机的氨基酸片段。

[0096] 在另一优选例中，所述的缺失的方式优选为在C段氨基酸的连续缺失。

[0097] 在另一优选例中，所述的缺失的氨基酸数量超过SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中氨基酸数量的二分之一。

[0098] 在另一优选例中，所述的数量不等、序列随机的氨基酸片段包括1‑100个氨基酸、优选1‑50个氨基酸，优选1‑30个氨基酸，优选5‑25个氨基酸，优选10‑20个氨基酸。

[0099] 在另一优选例中，所述突变蛋白的氨基酸序列选自下组：

[0100] (i)具有SEQ ID NO:12或14所示氨基酸序列的多肽；

[0101] (ii)将如SEQ ID NO:12或14所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1‑10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控植物性状功能的由(i)衍生的多肽；或[0102] (iii)氨基酸序列与SEQ ID NO:12或14所示的氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，具有与(i)至少基本相同活性多肽。

[0103] 在本发明的第四方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码如本发明第三方面所述的突变蛋白。

[0104] 在另一优选例中，所述多核苷酸的核苷酸序列选自下组：

[0105] (a)编码如SEQ ID NO:12或14所示多肽的多核苷酸；

[0106] (b)如SEQ ID NO:11或13所示的核苷酸序列；或

[0107] (c)与SEQ ID NO:11或13所示的核苷酸序列相比具有一个或多个碱基的取代、缺失或添加(例如1‑10个)的序列；

[0108] (d)与SEQ ID NO:11或13所示的核苷酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)的核苷酸序列；

[0109] (e)在SEQ ID NO:11或13所示的核苷酸序列的5’端和/或3’端截短或添加1‑60个(较佳地1‑30个，更佳地1‑10个)核苷酸的核苷酸序列；

[0110] (f)与(a)‑(e)中任一所述的核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

[0111] 在本发明的第五方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第四方面所述的多核苷酸。

[0112] 在本发明的第六方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第五方面所述的载体或基因组中整合有如本发明第四方面所述的多核苷酸。

[0113] 在另一优选例中，所述的宿主细胞包括真核细胞、原核细胞。

[0114] 在本发明的第七方面，提供了一种基因工程化的植物细胞、组织或器官，含有本发明第三方面所述的HAK蛋白突变体或其编码核酸序列。

[0115] 在本发明的第八方面，提供了一种制备如本发明第七方面所述的基因工程化的植物细胞、植物组织或器官的方法，包括以下方法步骤：调节所述植物中HAK基因或其编码蛋白的表达量和/或活性，从而获得基因工程的植物组织或植物细胞。

[0116] 在另一优选例中，所述方法包括步骤：

[0117] (1)提供植物细胞、植物组织或器官；和

[0118] (2)导入基因编辑的工具，使其与植物内核苷酸序列接触，突变获得本发明第三方面所述的编码HAK蛋白突变体的核苷酸序列。

[0119] 在另一优选例中，所述方法包括步骤：

[0120] (1)提供植物细胞、植物组织或器官；和

[0121] (2)导入含有本发明第三方面所述的HAK蛋白突变体或其编码核酸序列的载体。

[0122] 在另一优选例中，所述的导入的方法包括：农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、电击法、超声波法和聚乙二醇(PEG)介导法。

[0123] 在本发明的第九方面，提供了一种制备转基因植物或基因编辑植物的方法，包括步骤：

[0124] 将如本发明第七方面所述的植物细胞、组织或器官再生为植物体，从而获得转基因或基因编辑植物。

[0125] 在本发明的第十方面，提供了一种制备本发明第三方面所述突变蛋白的方法，包括步骤：

[0126] 在适合表达的条件下，培养本发明第六方面所述的宿主细胞，从而表达融合蛋白；和/或，分离所述融合蛋白。

[0127] 在本发明的第十一方面，提供了一种检测植物耐盐性的方法，所述的方法包括检测HAK蛋白或其编码核酸或其突变体的表达活性和/或表达量。

[0128] 在另一优选例中，所述的HAK蛋白选自下组：SlHAK20、OsHAK4、OsHAK17、ZmHAK4、SbHAK9、SbHAK26、GrHAK8、GmHAK12、PtHAK21、MdHAK5或其任一组合。

[0129] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

[0130] 图1显示了SlHAK20在不同番茄植株中的转录水平。其中，以SlEF1a作为内参。

[0131] 图2显示了SlHAK20‑YFP在不同番茄植株中的蛋白表达水平。

[0132] 图3显示了转基因番茄植株的耐盐性检测结果。

[0133] 其中，a显示了175mM NaCl盐胁迫条件下植株生长状态；b显示了恢复两周后植株的生长状态。

[0134] 图4显示了转基因番茄植株的存活率分析结果。

[0135] 图5显示了盐胁迫条件下，随着时间延长突变体较野生型根部的Na+含量和K+含量。

[0136] 图6显示了盐胁迫条件下，随着时间延长突变体较野生型根部的Na+/K+。

[0137] 图7显示了盐胁迫条件下，随着时间延长突变体较野生型木质部的Na+含量和K+含量。

[0138] 图8显示了盐胁迫条件下，随着时间延长突变体较野生型地上部位的Na+含量和K+含量。

[0139] 图9显示了盐胁迫条件下，随着时间延长突变体较野生型地上部位的Na+/K+。

[0140] 图10显示了经盐处理后，突变体较野生型的根长和根分枝数量的变化情况。

[0141] 图11显示了经盐处理后，突变体较野生型的株高变化情况。

[0142] 图12显示了盐胁迫条件下，突变型较野生型的根部和地上部分的Na+/K+。

[0143] 其中，a显示了突变型较野生型的根部的Na+/K+；b显示了突变型较野生型的地上部分的Na+/K+。

具体实施方式

[0144] 本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次意外地发现了一种植物(如番茄)的HAK基因或其编码蛋白或其促进剂，可用于调控植物的性状，所述性状包括：根长、根重和根分枝、株高、耐盐性。研究表明，在番茄中过表达HAK蛋白(转运体)或其编码基因可增加植物的抗盐性。HAK蛋白及编码基因在调控植物Na+转运中的用途，盐胁迫条件下，HAK蛋白可通过调控植物内Na+的装载和卸载，以提高植物的耐盐性。具体地，HAK蛋白可增强植物中Na+向木质部的转运及从木质部卸载，同时促进Na+从根部向其他组织或外界转运。

[0145] 此外，本发明人还意外地发现，通过基因编辑技术使得HAK蛋白的氨基酸序列发生C端缺失时，在盐胁迫下，可以增加根长和根分枝，增加植物的株高，并且增强植物的耐盐性。根部的改善可以增强植物的抗倒伏性，促进营养物质的吸收，增强环境适应能力。而株高的增加，可以增加植物的生物量和/或产量。

[0146] 研究还发现，HAK基因启动子下游48bp处6个碱基的缺失及3093bp处碱基G到A的置换，会导致植物耐盐性的下降。

[0147] 在此基础上，完成了本发明。

[0148] HAK蛋白及编码核酸序列

[0149] 如本文所用，术语“HAK蛋白”、“HAK多肽”、“HAK转运体”可以互换使用，是指存在于不同细胞器膜上，如质膜、液泡膜和类囊体膜上的一类离子转运体。

[0150] 如本文所用，术语“HAK蛋白突变体”、“突变型HAK蛋白”可以互换使用，是指由野生型HAK蛋白氨基酸序列突变所获得的突变体。

[0151] 如本文所用，术语“本发明的HAK基因”、“HAK基因”、“编码HAK蛋白的核酸序列”在合适条件下可互换使用，均指DNA序列，均指来源于植物(如番茄、小麦等)的HAK基因或其变体。

[0152] 在一优选实施方式中，本发明的HAK基因为SlHAK20基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

[0153] 本发明还包括与本发明的优选基因序列(SEQ ID NO:1)具有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同源性的核酸，所述核酸也能有效地调控植物(如番茄)的农艺性状。

[0154] “同源性”或“同一性”是指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据，)那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目初一进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。通常，在将两个序列比对难以产生最大同一性时进行比较，这样的比对可以通过使用，例如计算机程序如Align程序(DNAstar,Inc.)(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.J.Mol.Biol.J.Mol.Biol.J.Mol.Biol.48：443‑453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11‑17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此的方法来实现。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoI Biol.48:444‑453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。在本文中，所述基因的变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。

[0155] 在本发明中，SEQ ID NO:1中的核苷酸序列可以经过取代、缺失或添加一个或多个，生成SEQ ID NO:1的衍生序列，由于密码子的简并性，即使与SEQID NO:1的同源性较低，也能基本编码出如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。另外，“在SEQ ID NO:1中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。这些变异形式包括(但并小限于)：若干个(通常为1‑90个，较佳地1‑60个，更佳地1‑20个，最佳地1‑10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

[0156] 应理解，尽管本发明的实例中提供的基因来源于番茄，但是来源于其它类似的植物(尤其是与番茄属于同一科或属的植物)的、与本发明的序列(优选地，序列如SEQ ID NO:1所示)具有一定同源性(保守性)的HAK的基因序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该序列。

[0157] 本发明所述的多核苷酸或核酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括：DNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

[0158] 编码成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

[0159] 术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多苷或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

[0160] 本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酞胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

[0161] 应理解，虽然本发明的HAK基因优选来自番茄，但是来自其它植物的与番茄HAK基因具有一定同源性且功能相近的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

[0162] 例如，在本发明的另一个优选的实施方式中，本发明的HAK基因还可以是来源于水稻的OsHAK4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。而在本发明的另一个优选的实施方式中，本发明的HAK基因还可以是来源于水稻的OsHAK17，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。进一步还包括来源于玉米的ZmHAK4；来源于高粱的SbHAK9、SbHAK26；来源于棉花的GrHAK8；来源于大豆的GmHAK12等。

[0163] 本发明的HAK核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的DNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

[0164] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

[0165] 如本文所用，术语“本发明突变蛋白”、“SlHAK20突变蛋白”、“SlHAK20基因突变体编码蛋白”、“本发明多肽”可互换使用，都是指本发明中SlHAK20基因编码蛋白的C端缺失后，所形成的突变蛋白。

[0166] 在另一优选的实施方式中，本发明SlHAK20突变蛋白的一种典型的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。

[0167] MDRQTGRPDLTAAAAAQSDAAVTVAVHDGETINNDQKDHSRWETLVLAYKTLGVVFGGLVTSPLYVYPSMPLKSPTEDDYLGIYSIMFWTLSLIGVVKYATIALQADDQGEGGTFALYSLLCRNINIGILSSKSASLNSSHSYVNQSKKPSRLGKFCERSLIARRVLLFIAMLGMCMLIGDGILTPAISVLSAMGGLRARFSSVSKSLVEGLSAIILIVLFLLQKFGTSRVSFLLSPIMGHGLLPLLSLGYTVS*(SEQ IDNO:12)

[0168] 在另一优选的实施方式中，本发明SlHAK20突变蛋白的一种典型的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。

[0169] MDRQTGRPDLTAAAAAQSDAAVTVAVHDGETINNDQKDHSRWETLVLAYKTLGVVFGGLVTSPLYVYPSMPLKSPTEDDYLGIYSIMFWTLSLIGVVKYATIALQADDQGEGGTFALYSLLCRNINIGILSSKSASLNSSHSYVNQSKKPSRLGKFCERSLIARRVLLFIAMLGMCMLIGDGILTPAISVLSAMGGLRARFSSVSKSLVEGLSAIILIVLFLLQKFGTSRVSFLLSPIMGCMDSYHSSHWDIQYHKALSEHI*(SEQ ID NO:14)

[0170] 研究表明，HAK蛋白在盐胁迫条件下，HAK蛋白可通过调控植物内Na+的装载和卸载，以提高植物的耐盐性。

[0171] 具体地，HAK蛋白可增强植物中Na+向木质部的转运及从木质部卸载，同时促进Na+从根部向其他组织或外界转运。

[0172] 本发明涉及一种改进植物性状的SlHAK20蛋白，以及其突变蛋白，在本发明的一个优选例中，所述SlHAK20蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述SlHAK20突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:12或14所示。本发明的多肽能够有效调控植物(如水稻)的性状。

[0173] 本发明还包括与本发明的SEQ ID NO:2、12或14所示序列具有至少50％或以上(至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。

[0174] 所述“相同或相似功能”主要是指：“改进植物的根长和根分枝、株高、耐盐性等性状”。

[0175] 本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

[0176] 本发明还包括具有SlHAK20突变蛋白活性的SlHAK20突变蛋白片段和类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然SlHAK20蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。

[0177] 本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

[0178] 本发明中，所述的多肽变体是如SEQ ID NO.:2、12或14所示的氨基酸序列，经过若干个(通常为1‑60个，较佳地1‑30个，更佳地1‑20个，最佳地1‑10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异最好根据表1进行替换而产生。

[0179] 表1

[0180] 最初的残基 代表性的取代 优选的取代Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu

[0181] 本发明还包括所要求保护的蛋白的类似物。这些类似物与本发明序列SEQID NO:2、12或14的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L‑氨基酸的残基(如D‑氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ‑氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。

[0182] 修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式，所述的修饰能够保持或增强或部分抑制蛋白的转运功能；所述的修饰包括氨基酸侧链的化学修饰、肽链末端基团化学修饰，如巯基的化学修饰、氨基的化学修饰、羧基的化学修饰、二硫键的化学修饰及其他修饰；所述的化学修饰包括，磷酸化修饰(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)、糖基化修饰(由糖基化酶介导，如N‑糖基化、O‑糖基化)、脂酰化修饰(如乙酰化、棕榈酰化)等。

[0183] 特别值得注意的是，在本发明中，还提供了一种功能缺失型转基因植物，所述功能缺失包括一种或多种以下特征：(i)根长和根分枝较野生型减少；(ii)株高较野生型减少；和(iii)耐盐性较野生型减弱。

[0184] 在一优选实施方式中，本发明的功能缺失型转基因植物中包括氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的HAK突变蛋白，其基因突变序列如SEQ ID NO:7所示。

[0185] MDRQTRA*(SEQ ID NO:8)

[0186] 在另一优选的实施方式中，本发明的功能缺失型转基因植物中包括氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的HAK突变蛋白，其基因突变序列如SEQ ID NO:9所示。

[0187] MDRQTGRPDLTAAAAAQSDAAVSGGA*(SEQ ID NO:10)

[0188] 表达载体

[0189] 本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及含有本发明的载体或本发明突变蛋白编码序列的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述SlHAK20突变蛋白的方法。

[0190] 通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的突变蛋白。一般来说有以下步骤：

[0191] (1).用本发明的编码本发明突变蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

[0192] (2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

[0193] (3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

[0194] 本发明还提供了一种包括本发明的基因的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达本发明目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子、目的基因和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

[0195] 在本发明中，编码突变蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

[0196] 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明突变蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

[0197] 包括本发明基因、表达盒或载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

[0198] 本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

[0199] 本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

[0200] 获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

[0201] 在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

[0202] 植物性状

[0203] 本发明中所涉及的植物性状包括根长、根重和根分枝、株高、耐盐性、植物体内Na+离子转运、产量或生物量。施用本发明可显著改善植物中上述一种或多种性状。进一步的，施用本发明还可能改善与上述性状相关的其他性状，比如根长或根分枝的增加，可提高植物的抗倒伏性、抗旱性等生物性状，与实施本发明关联的其他性状均包含在本发明的保护范围内。

[0204] 本发明所述的“地上部分”、“地上部位”可互换使用，是指裸露于地表以上植物体部分，比如包括植物的茎、叶、花、果实。

[0205] 通过施用本发明所获得的植株相比野生型植株，在盐性条件下，存活率提高至少1倍，较佳的至少2倍，较佳的至少3倍，较佳的至少4倍。

[0206] 通过施用本发明所获得的植株相比野生型植株，在盐性条件下，株高或生物量增加约至少0.1倍，较佳至少0.2倍，较佳的至少0.5倍，较佳的至少1倍。

[0207] 本发明的主要优点包括：

[0208] 1)本发明首次揭示了HAK基因，尤其是SlHAK20及其同源基因，对Na+离子转运的调控机制。过表达HAK基因可增强植物的抗盐性，该研究成果为培育新型抗盐作物品种，扩大作物种植面积、提高作物产量、改善农民收入具有重要的科学价值和社会意义。

[0209] 2)本发明还获得了有益于表型改善的hak突变体，通过调控植物内源性基因，可实现对抗倒伏、生物量、抗盐等性状的调控，对于培育优质、高产、耐逆的植物新品种具有重要的科学价值。

[0210] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring  Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

[0211] 实施例1：番茄中HAK20过表达对植物抗盐性的影响

[0212] 本实验里中采用转基因方法，构建HAK20的过表达载体转染番茄愈伤组织，获得三组转基因阳性植株Hap1OE‑1、Hap1OE‑2、Hap1OE‑3。

[0213] 1、载体构建

[0214] SlHAK20 CDS(coding sequence,CDS)去掉终止密码子的克隆引物上游和下游引物分别与5’端的CAAGAGACAGGATCCGAATTC和ACCTCCGACCGGTGCACTAGT的接头序列(来源于目的载体)一起合成扩增引物。利用PCR扩增，从野生品种TS‑21总RNA反转获得的总cDNA产物中，克隆出对应的包含接头CDS片段。进一步，通过特异性位点重组，在重组酶的催化下与目的载体pCAMBIA1300‑YFP的同源序列重组而使得SlHAK20 CDS穿梭进目的载体。

[0215] 2、遗传转化

[0216] 利用农杆菌介导的愈伤组织侵染来实现。将携带目的载体的农杆菌与脱毒的番茄子叶孵育20min进行侵染，弃掉农杆菌后，番茄子叶置于共培养培养基(成分4.3g/L MS salt(519),0.2mg/L IAA,2mg/L ZT,30g/L sucrose,7.4g/L agar,pH 5.5‑5.6)暗培养2‑3天。共培养的番茄子叶转移到含有6mg/L Hygromycin和300mg/L Timentin抗生素的筛选培养基上(成分与共培养培养基相同)进行7‑10天每代的筛选继代，直到分化出组培苗。将组培苗剪下插入生根培养基(成分4.3g/L MS salt(524),20g/L sucrose,300mg/L Timentin,7.4g/L Agar,pH 5.7‑5.8)进行生根，待根系发育强壮后即可炼苗、移栽。

[0217] 3、转化植株鉴定及培养

[0218] 取生根后的组培苗叶片，提取总DNA后，通过PCR扩增YFP基因，并进行琼脂糖凝胶电泳，若有目的条带即为阳性苗，若无目的条带作为阴性对照，同阳性苗一起移栽至泥炭土中培养、扩繁种子用于后续试验。

[0219] 4、分子检测

[0220] 实时定量PCR(qRT‑PCR)检测过表达株系Hap1OE‑1，Hap1OE‑2和Hap1OE‑3中SlHAK20的转录本水平。通过RNA提取试剂盒提取过表达株系Hap1OE‑1，Hap1OE‑2和Hap1OE‑3的总RNA后，用反转录试剂盒(iScriptTM cDNA Synthesis Kit,BIO‑RAD)反转录获得cDNA，上游引物5’‑TGCATTACAGGTTCTGAAGC‑3’和下游引物5’‑TGACTTGCTACTATAGCAGCT‑3’作为扩增引物，用qPCR荧光染料试剂盒(AceQ qPCR SYBR Green Master Mix,Vazyme)对SlHAK20的扩增水平进行检测。最后，利用管家基因SlEF1a的转录本(上、下游引物分别是：
5’‑GACAGGCGTTCAGGTAAGGA‑3’和5’‑GGGTATTCAGCAAAGGTCTC‑3’)作为内参计算SlHAK20转录本的相对水平。

[0221] 蛋白水平的检测是通过Western Blot实现的。用1％SDS蛋白提取液提取过表达株系Hap1OE‑1，Hap1OE‑2和Hap1OE‑3中总蛋白，各取20μg总蛋白跑SDS‑PAGE胶，后将蛋白转膜至硝酸纤维素膜(0.45μm HATF,Nitrocellulosemembrane,Merck Millipore)，5％的脱脂奶粉封闭1h，加1:2500稀释的抗体anti‑GFP(Thermo Fisher)或1:3000稀释的抗体anti‑ACTIN(Thermo Fisher)于5％脱脂奶粉于4℃孵育过夜，后将膜转移到1:5000稀释的二抗抗体IgG(Abmart)中孵育1h，用1×TBST(Tris pH8.0,NaCl,0.05％Tween 20)漂洗3次每次15min，将膜正面加显色液(Thermo Fisher)，孵育5min后，将膜置于洁净的保鲜膜中用成像系统ChemiDocTM XRS+with Image LabTM Software(BIO‑RAD)显影。

[0222] 5、抗盐性检测

[0223] 将阳性苗和阴性苗种子用10％次氯酸钠消毒20min后，点终于1/4MS培养基，水平放置萌发后转移至1/4MS培养基竖直培养约10天。将幼苗移栽到土块或液体培养盒(1/4MS液体培养基)中，继续培养18天后在培养液中加入175mM NaCl或用其浇灌土块中培养的番茄。盐处理2‑3周后，进行复水，即用不含NaCl的培养液或水培养、浇灌番茄，2周后统计不同转基因材料的存活率。

[0224] 6、实验结果及分析

[0225] (1)过表达水平

[0226] 如图1和图2所示，Hap1OE‑1、Hap1OE‑2、Hap1OE‑3植株的转录水平和蛋白表达水平均高于野生型(TS‑670)，Hap1OE‑1植株略高于Hap1OE‑2，两者均优于Hap1OE‑3。

[0227] (2)转基因番茄植株抗盐性检测

[0228] 如图3所示，转基因和野生型番茄植株经过175mM NaCl处理后均出现萎蔫，野生型植株萎蔫状态明显重于野生型植株，其中Hap1OE‑1转基因植株状态略优于其他两组，。经复水后，转基因植株可逐渐恢复正常生长状态，野生型植株无复转迹象。

[0229] (3)存活率分析

[0230] 经盐处理后，转基因番茄植株的存活率明显优于野生型。转基因植株的存活率与SlHAK20基因的转录水平和蛋白表达水平呈正相关性。

[0231] 7、实验结论

[0232] 过表达SlHAK20可以显著增强植物的抗盐性，提高植物对逆境的适应性。

[0233] 该研究成果有助于培育出更多抗盐的植物新品种，对于扩大植物种植面积、增加盐碱土地的利用率、提高农产品产量、改善农民收入具有重要的科学价值和社会意义。

[0234] 实施例2：番茄中HAK20对Na+调控作用

[0235] 本实验例中采用基因编辑方法敲除野生型番茄TS‑21品种中slhak20基因，并产生两个突变体slhak20‑1和slhak20‑2。

[0236] 1、CRISPR编辑工具的构建

[0237] 于SlHAK20基因组ATG附近设计Single  guide  RNA1(sgRNA1)5’CATGGATCGACAAACCGGA 3’和sgRNA2(5’TCAGATGCAGCTGTTACAG 3’)的上、下游引物分别加GATTG和AAAC...C接头并合成(Thermo Fisher Scientific)后，稀释为终浓度10μM，各取10μL混匀。在PCR仪(BioRAD)中退火形成双链后直接与目的载体pCAMBIA1300‑Cas9的BsaⅠ‑HF(New England BioLabs)酶切片段，进行T4链接2h，反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态后，卡那霉素筛选获得正确的重组双元载体，并用M13F和sgRNA下游引物进行菌落PCR鉴定，PCR产物进行Sanger测序进一步确定后，通过农杆菌介导的愈伤组织浸花转化法转化番茄，用于后续实验。

[0238] 2、遗传转化

[0239] 利用农杆菌介导的愈伤组织侵染来实现。将携带目的载体的农杆菌与脱毒的番茄子叶孵育20min进行侵染，弃掉农杆菌后，番茄子叶置于共培养培养基(成分4.3g/L MS salt(519),1mg/L IAA,0.3mg/L ZT,30g/L sucrose,7.4g/L agar,pH 5.5‑5.6)暗培养2‑3天。共培养的番茄子叶转移到含有6mg/L Hygromycin和300mg/L Timentin抗生素的筛选培养基上(成分与共培养培养基相同)进行7‑10天每代的筛选继代，直到分化出组培苗。将组培苗剪下插入生根培养基(成分4.3g/L MS salt(524),20g/L sucrose,300mg/L Timentin,7.4g/L Agar,pH 5.7‑5.8)进行生根，待根系发育强壮后即可炼苗、移栽。

[0240] 3、植株培养及突变体筛选

[0241] 取生根后的组培苗叶片，提取总DNA后，通过sgRNA上游约300bp处的上游引物和其下游300bp处的下游引物进行PCR扩增获得目的条带后，对目的片段进行Sanger测序，测序结果与SlHAK20的参照基因组序列比对获得基因编辑结果，纯合阳性苗移栽至泥炭土中培养、扩繁种子用于后续试验。

[0242] 4、钠、钾离子含量测定

[0243] 根和地上部分钠、钾离子含量测定：在1/4MS液体培养基中，培养19天大的番茄幼苗，用含50mM NaCl的1/4MS处理0、1、2、7、14天或指定的时间后，分别取地上部分和根(根需要用去离子水洗3次，用吸水纸吸干)。75℃烘箱烘干24h以上，取1mg左右(精确称重并记录重量)干样品加入1mL含有内标铟(In)的浓硝酸于洁净玻璃管中，115℃消解4h后，加入9.2mL去离子水稀释混匀。稀释后的样品用ICP‑MS(NexION 350D；PerkinElmer)检测并计算钠、钾离子含量。

[0244] 木质部流中钠、钾离子含量测定：在1/4MS液体培养基中，培养19天大的番茄幼苗，用含50mM NaCl的1/4MS处理0、1、2或指定的时间后，用锋利的刀片去掉子叶及其以上部分，收集剩余部分的木质部流。取20μL木质部流加5％1.78mL含In浓硝酸稀释后用ICP‑MS(NexION 350D,PerkinElmer)检测并计算钠、钾离子含量。

[0245] 5、实验结果

[0246] 如图5所示，盐胁迫条件下，随着时间延长，突变体slhak20‑1、slhak20‑2较野生型根部的Na+含量显著升高，K+含量相当。

[0247] 如图6所示，盐胁迫条件下，随着时间延长，突变体slhak20‑1、slhak20‑2较野生型根部的Na+/K+逐渐升高。

[0248] 如图7所示，盐胁迫条件下，突变体slhak20‑1、slhak20‑2较野生型木质部Na+含量显著降低，K+含量相当。

[0249] 如图8所示，盐胁迫条件下，随着时间延长，突变体slhak20‑1、slhak20‑2较野生型地上部位的Na+含量显著升高，K+含量相当。

[0250] 如图9所示，盐胁迫条件下，随着时间延长，突变体较野生型地上部分的Na+/K+逐渐升高。

[0251] 6、实验结论

[0252] SlHAK20基因功能与植物体内Na+离子的转运密切相关，其可调节植株根部Na+离子的积累，促进Na+从根部向木质部的转运，及Na+从木质部向根系部位的卸载，以此降低根部和地上部位的Na+/K+比，增强植株抗盐性。

[0253] 实施例3：HAK20突变改善对植物根部发育、株高、抗盐性的影响

[0254] 本实验例中采用基因编辑方法产生番茄TS‑21品种中slhak20基因的突变体slhak20‑3、slhak20‑4。两突变体相对于野生型HAK20分别截短472、473个氨基酸。

[0255] 1、CRISPR编辑工具的构建

[0256] 于SlHAK20基因组ATG下游3093bp前设计Single  guide  RNA  5’GGTCTCCTATCATGGGTGCATGG 3’的上、下游引物分别加GATTG和AAAC...C接头并合成(Thermo Fisher Scientific)后，稀释为终浓度10μM，各取10μL混匀。在PCR仪(BioRAD)中退火形成双链后直接与目的载体pCAMBIA1300‑Cas9的BsaⅠ‑HF(New England BioLabs)酶切片段，进行T4链接2h，反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态后，卡那霉素筛选获得正确的重组双元载体，并用M13F和sgRNA下游引物进行菌落PCR鉴定，PCR产物进行Sanger测序进一步确定后，通过农杆菌介导的愈伤组织浸花转化法转化番茄，用于后续实验。

[0257] 2、遗传转化

[0258] 利用农杆菌介导的愈伤组织侵染来实现。将携带目的载体的农杆菌与脱毒的番茄子叶孵育20min进行侵染，弃掉农杆菌后，番茄子叶置于共培养培养基(成分4.3g/L MS salt(519),1mg/L IAA,0.3mg/L ZT,30g/L sucrose,7.4g/L agar,pH 5.5‑5.6)暗培养2‑3天。共培养的番茄子叶转移到含有6mg/L Hygromycin和300mg/L Timentin抗生素的筛选培养基上(成分与共培养培养基相同)进行7‑10天每代的筛选继代，直到分化出组培苗。将组培苗剪下插入生根培养基(成分4.3g/L MS salt(524),20g/L sucrose,300mg/L Timentin,7.4g/L Agar,pH 5.7‑5.8)进行生根，待根系发育强壮后即可炼苗、移栽。

[0259] 3、植株培养及突变体筛选

[0260] 取生根后的组培苗叶片，提取总DNA后，通过sgRNA上游约300bp处的上游引物和其下游300bp处的下游引物进行PCR扩增获得目的条带后，对目的片段进行Sanger测序，测序结果与SlHAK20的参照基因组序列比对获得基因编辑结果，纯合阳性苗移栽至泥炭土中培养、扩繁种子用于后续试验。

[0261] 4、表型的鉴定(根发育、株高、钠钾离子的含量)

[0262] 将基因编辑纯合体和对应野生型的种子用10％次氯酸钠消毒20min后，点终于1/4MS培养基，水平放置萌发后转移至含200mM NaCl的1/4MS培养基竖直放置培养1周或1月后统计其鲜重等性状。对照组在不含NaCl的1/4MS培养基竖直放置培养10天。

[0263] 或将萌发的幼苗转移到1/4MS培养基竖直培养约10天。将幼苗移栽到土块或液体培养盒(1/4MS液体培养基)中，继续培养18天后在培养液中加入200mM NaCl或用含200mM NaCl的水浇灌土块中培养的番茄。盐处理2‑3周后，进行复水，即用不含NaCl的培养液或水培养、浇灌番茄共2周后统计株高等性状。对照组一直用不含NaCl的1/4MS培养基或水浇灌土块培养30天后统计株高。

[0264] 5、钠、钾含量的测定

[0265] 根和地上部分钠、钾离子含量测定：在1/4MS液体培养基中，培养19天大的番茄幼苗，用含50mM NaCl的1/4MS处理0、1、2、7、14天或指定的时间后，分别取地上部分和根(根需要用去离子水洗3次，用吸水纸吸干)。75℃烘箱烘干24h以上，取1mg左右(精确称重并记录重量)干样品加入1mL含有内标铟(In)的浓硝酸于洁净玻璃管中，115℃消解4h后，加入9.2mL去离子水稀释混匀。稀释后的样品用ICP‑MS(NexION 350D；PerkinElmer)检测并计算钠、钾离子含量。

[0266] 6、实验结果及分析

[0267] (1)SlHAK20突变可以影响植物根部的发育

[0268] 如图10所示，经盐处理后，突变体slhak20‑3、slhak20‑4较野生型根长增加、根分枝数量增加。

[0269] (2)SlHAK20突变对植物株高、生物量的影响

[0270] 如图11所示，经盐处理后，突变体slhak20‑3、slhak20‑4较野生型的株高增加。

[0271] (3)SlHAK20突变对植物钠离子和钾离子含量的影响

[0272] 如图12a所示，盐胁迫条件下，突变型slhak20‑3、slhak20‑4较野生型根部，Na+/K+显著降低。

[0273] 如图12b所示，盐胁迫条件下，突变型slhak20‑3、slhak20‑4较野生型地上部分，Na+/K+显著降低。

[0274] 6、实验结论

[0275] 实验结果表明，SlHAK20大片段缺失突变体，在盐胁迫下，植物的根长和株高明显优于野生型，能够提高植物的生物量，甚至产量等表型；还可以降低植物组织的Na+/K+比，而增强植物的抗盐性。

[0276] 该研究成果对性状的改良具有应用价值，通过改善植物自身的HAK基因，可实现抗盐等性状的调控，对于培育耐逆的植物新品种具有重要的科学价值。

[0277] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。