用于预测老年人发生AD的风险的生物标志物和试剂盒及其应用

摘要

本发明涉及医药领域，具体涉及用于预测老年人发生AD的风险的生物标志物和试剂盒及其应用。所述生物标注为包括抗增殖蛋白、细胞色素b‑c1复合物亚基6、血小板糖蛋白Ib链和纤维连接蛋白。该生物标志物能够对老年人进行测评，准确率高、检测速度快、成本低、创伤小、易于被受试者接受，为AD提供了科学有效的诊断方案。该试剂盒可以在大范围老年人群中筛查AD，并且仅需要采集外周血即可完成检测，使得大范围的老年人口筛查成为可能。

权利要求

1.检测血小板中生物标志物的试剂在制备用于预测老年人发生AD的风险的试剂盒中的应用，其特征在于，所述生物标志物由抗增殖蛋白、细胞色素b‑c1复合物亚基6、血小板糖蛋白Ib链和纤维连接蛋白组成，抗增殖蛋白、细胞色素b‑c1复合物亚基6、血小板糖蛋白Ib链和纤维连接蛋白的水平与老年人群发生AD的风险呈负相关。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括说明书，所述说明书用于记载使用方法。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述说明书记载的使用方法包括以下步骤：

a：使用试剂盒测定来自受试者的生物样品中的抗增殖蛋白水平、细胞色素b‑c1复合物亚基6水平、血小板糖蛋白Ib链水平以及纤维连接蛋白水平；

b：基于所述抗增殖蛋白、细胞色素b‑c1复合物亚基6、血小板糖蛋白Ib链和纤维连接蛋白的水平预测该受试者发生AD的风险，其中，抗增殖蛋白、细胞色素b‑c1复合物亚基6、血小板糖蛋白Ib链和纤维连接蛋白的水平降低表明该受试者具有发生AD的风险。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤b的具体过程包括：将步骤a测得的抗增殖蛋白、细胞色素b‑c1复合物亚基6、血小板糖蛋白Ib链和纤维连接蛋白水平与参比水平进行比较，然后根据结果预测该受试者发生AD的风险，其中，当受试者的抗增殖蛋白、细胞色素b‑c1复合物亚基6、血小板糖蛋白Ib链和纤维连接蛋白水平相对于参比水平降低时，则该受试者具有发生AD的风险。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述参比水平为老年人没有检出AD的群体获得的平均水平。

说明书

用于预测老年人发生AD的风险的生物标志物和试剂盒及其

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医药领域，具体涉及用于预测老年人发生AD的风险的生物标志物和试剂盒及其应用。

背景技术

[0002] 阿尔茨海默症(Alzheimer's disease，AD)是一种原发性的中枢神经系统退行性疾病，是最常见的痴呆类型。AD的主要临床症状是缓慢的认知功能减退，包括记忆、逻辑推理能力和语言功能的进行性丟失，最后发展为重度痴呆。

[0003] 目前，对AD尚缺乏早期诊断措施，当患者就诊时常常已经出现不可逆性脑损伤，导致治疗效果不佳。因此，发现早期高危因素对早期诊断和干预有重要意义。

[0004] 血小板与神经元在生物学上有诸多相似之处，因此，血小板是寻找中枢神经系统疾病外周生物标志物的理想材料。鉴于此，本发明旨在外周血小板中发现潜在的生物标志物，用于AD的诊断。

发明内容

[0005] 本发明的目的是为了克服现有技术存在的AD诊断方法价格昂贵、耗时耗力等问题，提供一组用于预测老年人发生AD的风险的生物标志物和试剂盒及其应用。

[0006] 为了实现上述目的，本发明一方面提供一组用于预测老年人发生AD的风险的生物标志物，其特征在于，所述生物标注为包括抗增殖蛋白、细胞色素b‑c1复合物亚基6、血小板糖蛋白Ib链和纤维连接蛋白。

[0007] 优选地，抗增殖蛋白的水平、细胞色素b‑c1复合物亚基6的水平、血小板糖蛋白Ib链的水平和纤维连接蛋白的水平与老年人发生AD的风险呈负相关。

[0008] 本发明第二方面提供上述生物标志物在制备用于预测老年人发生AD的风险的试剂盒中的应用。

[0009] 本发明第三方面提供一种用于预测老年人发生AD的风险的试剂盒，所述试剂盒包括检测抗增殖蛋白水平的物质、检测细胞色素b‑c1复合物亚基6水平的物质、检测血小板糖蛋白Ib链水平的物质以及检测纤维连接蛋白水平的物质。

[0010] 优选地，所述试剂盒还包括说明书，所述说明书用于记载使用方法。

[0011] 优选地，所述说明书记载的使用方法包括以下步骤：

[0012] a：使用试剂盒测定来自受试者的生物样品中的抗增殖蛋白水平、细胞色素b‑c1复合物亚基6水平、血小板糖蛋白Ib链水平以及纤维连接蛋白水平；

[0013] b：基于所述抗增殖蛋白、细胞色素b‑c1复合物亚基6、血小板糖蛋白Ib链和纤维连接蛋白的水平预测该受试者发生AD的风险，其中，抗增殖蛋白、细胞色素b‑c1复合物亚基6、血小板糖蛋白Ib链和纤维连接蛋白的水平降低表明该受试者具有发生AD的风险。

[0014] 优选地，所述生物样品为血小板。

[0015] 优选地，所述步骤b的具体过程包括：将步骤a测得的抗增殖蛋白、细胞色素b‑c1复合物亚基6、血小板糖蛋白Ib链和纤维连接蛋白水平与参比水平进行比较，然后根据结果预测该受试者发生AD的风险，其中，当受试者的抗增殖蛋白、细胞色素b‑c1复合物亚基6、血小板糖蛋白Ib链和纤维连接蛋白水平相对于参比水平降低时，则该受试者具有发生AD的风险。

[0016] 优选地，所述参比水平为老年人没有检出AD的群体获得的平均水平。

[0017] 本发明第四方面提供上述试剂盒在预测老年人发生AD的风险中的应用。

[0018] 本发明有点在于：

[0019] 1、提供了能够预测老年人患AD的风险的存在于外周血血小板中的生物标志物，能够对老年人进行测评，准确率高、检测速度快、成本低、创伤小、易于被受试者接受，为AD提供了科学有效的诊断方案。

[0020] 2、提供预测老年人患AD的风险试剂盒，该试剂盒可以在大范围老年人群中筛查AD，并且仅需要采集外周血即可完成检测，使得大范围的老年人口筛查成为可能。

[0021] 3、可以在AD发病前对受试者的风险进行预测，有利于对AD的早期干预。

附图说明

[0022] 图1是实施例1中正常认知老年人群、MCI和AD病人血小板蛋白质组学分析结果；

[0023] 图2是实施例2中血小板候选生物标志物与MMSE评分的相关性结果；

[0024] 图3是实施例3中与正常认知对照组相比较的MCI和AD患者中的差异蛋白及相关生物信息学分析结果；

[0025] 图4是实施例4中候选生物标志物的偏最小二乘法判别分析结果；

[0026] 图5是实施例5中机器学习鉴定区分认知损伤人群的最佳组合标志物的结果。

具体实施方式

[0027] 以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

[0028] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

[0029] 由于血小板与神经元在生物学上有诸多相似之处，因此它可以作为神经系统疾病生物标志物的外周基质，本发明的发明人在研究过程中发现，与无痴呆的正常老年人群比，血小板中抗增殖蛋白(PHB)、细胞色素b‑c1复合物亚基6(UACRH)、血小板糖蛋白Ib链(GP1BA)和纤维连接蛋白(FINC)的水平在AD人群中显著降低。基于此，完成了本发明。

[0030] 本发明一方面提供一组用于预测老年人发生AD的风险的生物标志物，其特征在于，所述生物标注为包括抗增殖蛋白(PHB)、细胞色素b‑c1复合物亚基6(UQCRH)、血小板糖蛋白Ib链(GP1BA)和纤维连接蛋白(FINC)。

[0031] 在优选情况下，抗增殖蛋白的水平、细胞色素b‑c1复合物亚基6的水平、血小板糖蛋白Ib链的水平和纤维连接蛋白的水平与老年人发生AD的风险呈负相关。

[0032] 在本发明中，所述老年人的年龄≥66岁；优选地，所述老年人的年龄为66‑83岁，均值约72.8岁。

[0033] 本发明第二方面提供上述生物标志物在制备用于预测老年人发生AD的风险的试剂盒中的应用。

[0034] 本发明第三方面提供一种用于预测老年人发生AD的风险的试剂盒，所述试剂盒包括检测抗增殖蛋白水平的物质、检测细胞色素b‑c1复合物亚基6水平的物质、检测血小板糖蛋白Ib链水平的物质以及检测纤维连接蛋白水平的物质。

[0035] 在优选情况下，所述试剂盒还包括说明书，所述说明书用于记载使用方法。

[0036] 进一步优选地，所述说明书记载的使用方法包括以下步骤：

[0037] a：使用试剂盒测定来自受试者的生物样品中的抗增殖蛋白水平、细胞色素b‑c1复合物亚基6水平、血小板糖蛋白Ib链水平以及纤维连接蛋白水平；

[0038] b：基于所述抗增殖蛋白、细胞色素b‑c1复合物亚基6、血小板糖蛋白Ib链和纤维连接蛋白的水平预测该受试者发生AD的风险，其中，抗增殖蛋白、细胞色素b‑c1复合物亚基6、血小板糖蛋白Ib链和纤维连接蛋白的水平降低表明该受试者具有发生AD的风险。

[0039] 在优选情况下，所述生物样品为血小板。

[0040] 优选地，所述步骤b的具体过程包括：将步骤a测得的抗增殖蛋白、细胞色素b‑c1复合物亚基6、血小板糖蛋白Ib链和纤维连接蛋白水平与参比水平进行比较，然后根据结果预测该受试者发生AD的风险，其中，当受试者的抗增殖蛋白、细胞色素b‑c1复合物亚基6、血小板糖蛋白Ib链和纤维连接蛋白水平相对于参比水平降低时，则该受试者具有发生AD的风险。

[0041] 进一步优选地，所述步骤b的具体过程包括：将步骤a测得的抗增殖蛋白、细胞色素b‑c1复合物亚基6、血小板糖蛋白Ib链和纤维连接蛋白水平与参比水平进行比较，然后根据结果预测该受试者发生AD的风险，其中，当受试者的抗增殖蛋白水平与参比水平的比值(cutoff值)≤0.920时、细胞色素b‑c1复合物亚基6水平与参比水平的比值(cutoff值)≤0.997、血小板糖蛋白Ib链水平与参比水平的比值(cutoff值)≤1.01，纤维连接蛋白水平水平与参比水平的比值(cutoff值)≤0.907，则该受试者具有发生AD的风险。

[0042] 优选地，所述参比水平为老年人没有检出AD的群体获得的平均水平。

[0043] 本发明第四方面提供上述试剂盒在预测老年人发生AD的风险中的应用。

[0044] 为了更清楚的描述本发明的技术内容，下面结合具体实施例来进一步的描述。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过商购获得的常规产品。

[0045] 实施例1

[0046] 对患有轻度认知障碍(MCI，MMSE＝18‑23)，严重认知障碍(AD，MMSE＝2‑17)和年龄/性别匹配的正常认知(MMSE＝29‑30)的人群(Ctrl组)利用TMT‑LC‑MS/MS技术进行了全面而深入的血小板蛋白质组学分析。具体过程包括：首先，利用TMT标签标记每个蛋白样品，而后进行质谱鉴定，其次进行差异蛋白分析和皮尔逊相关性分析确定候选蛋白，最后基于候选蛋白利用机器学习方法确立最佳组合标志物。

[0047] 蛋白质组学分析的结果如图1A所示，蛋白质组学共捕获了2994个血小板蛋白，与正常认知人群相比，在MCI和AD患者中一共鉴定出360种差异蛋白(P<0.05)。其中，MCI患者与正常认知人群相比，207个差异表达蛋白被下调，其中9个被上调(如图1B所示)；AD患者与正常认知人群相比，121个差异蛋白被下调，其中44种被上调(如图1C所示)。进一步的，与Ctrl组相比，在MCI和AD患者的血小板中鉴定出相同的差异蛋白51个(如图1D所示)，且丰度在MCI和AD中都是减少的(图1E)。

[0048] 实施例2

[0049] 根据实施例1得到的结果，经过MMSE相关性和通路分析确定了26中核心血小板蛋白定义为候选蛋白，进一步对26种血小板候选蛋白与MMSE评分的相关系数进行排名，根据皮尔逊相关系数对候选生物标记(p<0.05)进行排序可以构建出复杂的关联矩阵(如图2A)，其中，阴影占圆圈的比率表示相关程度的大小，候选生物标志物的相对表达丰度如图2B所示。由图可知，候选蛋白的增加或减少都非常均匀，所有26种候选蛋白质均显示出中等程度的MMSE相关性(|r|＝0.371‑0.552)。其中，血小板CD63的减少与MMSE评分显示出最强的相关性(r＝0.552，P＝0.002)。而抗增殖蛋白、细胞色素b‑c1复合物亚基6、血小板糖蛋白Ib链和纤维连接蛋白与MMSE的相关性系数(r)分别为0.476,0.448,0.468,0.396。

[0050] 进一步的，我们还在数据集中发现了一些蛋白质之间的紧密相关性，例如线粒体功能障碍相关蛋白质PHB，SLC25A5，MPPB(|r|＝0.60‑0.69)(图2A)；补体激活途径蛋白C1S，SERPINA1，SERPINF2(|r|＝0.63‑0.75)(图2A)。此外，发现Aβ相关蛋白ADAM10与补体激活相关蛋白SERPINA1和血小板激活相关蛋白整联蛋白α‑IIb(ITA2B)密切相关(|r|＝0.70‑0.85)(图2A)，表明这三者可能在AD的发病机理中起协同作用或拮抗作用。这些数据表明，血小板失调蛋白参与认知损伤相关的复杂调控网络。

[0051] 实施例3

[0052] 为了探讨认知功能下降过程中血小板蛋白质组的动态变化，我们在MCI，AD和认知正常对照人群中进行了聚类和蛋白质‑蛋白质相互作用(PPI)网络分析。与正常认知对照组相比，MCI和AD患者中的差异蛋白及相关生物信息学分析结果如图3所示。图3A中，根据Ctrl，MCI到AD组差异蛋白变化趋势，将差异蛋白分为三个簇(每行代表一种蛋白质)；图3B中，通过Metascape在线分析对三个簇的差异蛋白进行信号通路富集分析(重叠蛋白≥3，P<0.01)；图3C表示三个簇中检测到的蛋白与蛋白相互作用模块；图3D表示差异蛋白质显著富集的生物学功能过程。其中，圆圈模块代表簇1，方块模块代表簇2和三角模块代表簇3。

[0053] 簇1(n＝160)中的蛋白质，包括CD63，PHB，UQCRH，ANXA5和EGF，显示从Ctrl到MCI到AD的下降趋势(图3A左)。这些蛋白质富含7种KEGG通路，包括脂肪酸代谢，cGMP‑PKG信号通路，AD，癌症通路，矿物质吸收，AMPK信号通路和血小板活化(图3B)。与正常对照组相比，簇2(n＝135)表现出MCI显着降低而在AD升高趋势的蛋白(图3A中部)，这些差异蛋白与爱泼斯坦‑巴尔病毒感染，加压素调节的水重吸收和抗叶酸抵抗有关(图3B)。簇3(n＝65)中的蛋白质显示了从Ctrl到MCI到AD的趋势(图3A右)，包括PPP3CB，STMN1，PTPN7，MAP4K2和STK3，它们都强烈指向MAPK信号通路(图3B)。通过对差异表达的蛋白质进行PPI网络分析，我们进一步定义了八个蛋白质相互作用模块，这些模块支持上述簇中的已鉴定途径(图3C)。通过对差异蛋白的生物学过程分析，显示了更全面，更详细的生物学机制，包括调节胰岛素分泌，血小板活化(簇1)。蛋白质转运，细胞间粘附，ER向高尔基小泡介导的转运(簇2)；和补体激活，蛋白质折叠(簇3)(图3D)。

[0054] 研究发现，后续由机器学习算法识别的四个分子代表两个重要的病理过程，即线粒体功能障碍(PHB，UQCRH)和血小板激活(GP1BA，FINC)。

[0055] 实施例4

[0056] 基于实例2和3的结果，展示了差异蛋白和MMSE相关蛋白复杂的生物调控网络，确定了19个发挥核心作用的蛋白定义为候选生物标志物。对候选生物标志物(19种候选蛋白)的偏最小二乘法判别分析(PLS‑DA)结果如图4所示。图4A表示通过PLS‑DA分析19种候选血小板蛋白的区分认知损伤人群的能力。对选定的19种候选蛋白进行偏最小二乘判别分析(PLS‑DA)可以很好地区分MCI和AD与Ctrl，尽管不能区分MCI和AD(图4A)。但是如图4B所示，通过预测变量区分认知损伤人群的重要性确认了9种候选蛋白(VIP>1)。其中包括PHB，RAP1A，ITPR1，UQCRH，CD63，ADAM10，GP1BA，ITPR2和FINC在内的9个蛋白，被认为是区分正常人去与认知障碍人群的核心分子，其预测重要性VIPpred>1，其中，PHB表现出最高的预测贡献度。

[0057] 实施例5

[0058] 因此，基于实施例4得到的结论，为了获得预测认知能力下降的最佳组合生物标志物，我们使用留一法(LOO)的方法进一步分析了9种核心候选蛋白。该方法一次只保留一个样本作为验证集，而将其余样本用作训练集，因此所有样本都进行了27次训练并进行了27次验证。机器学习鉴定出区分认知损伤人群的最佳组合标志物，结果如图5所示。其中，图5A中为基于留一法(LOO)算法确认的ROC曲线下方面积的最佳性能面板，Y轴左；ROC曲线下的面积，Y轴右：准确率，x轴；通过LOO算法选择的血小板蛋白，1‑9分别代表相应蛋白数所对应的最佳组合；图5B中的结果为在每种最佳组合下，相应的蛋白和生物标志物的诊断效率；图5C和5D表示基于LOO算法，每种最佳组合生物标志物的接收器工作特征曲线(AUCROC)和精确召回曲线(AUCPR)。AUCROC基于真阳性率和假阳性率：真阳性率＝[真阳性/(真阳性+假阴性)]；假阳性率＝[假阳性/(真阴性+假阴性)]。AUCPR是根据精度和召回率获得的：精度＝[真阳性/(真阳性+假阳性)]；召回率＝[真阳性/(真阳性+假阴性)]。此外，F1分数＝2*(精度*召回率)/(精度+召回率)。

[0059] 通过LOO分析，使用9种生物标记物的不同组合观察到各种特异性和准确性，PHB，UQCRH，GP1BA和FINC的组合显示出最高的特异性，具有最大的受体工作特性(ROC)(AUCROC＝0.965)，并且具有最高的准确度(89.3％)(图5A‑C)。使用该组合生物标志物，产生的召回率为0.895，精度为0.944，F1得分为0.919，最大的召回率曲线(AUCPR＝0.985)(图5B和D)。因此，将PHB，UQCRH，GP1BA和FINC可以作为用于预测老年人发生AD的风险的生物标志物。

[0060] 对比例1

[0061] 将PHB作为单个血小板生物标志物，根据检测结果，AUCROC为0.842，准确性为78.6％，召回率为0.895，准确性为0.810，F1得分为0.850，AUCPR为0.929(图5A‑D)。

[0062] 因此，由上述实施例1‑5和对比例1的结果可以得知，本发明的发明人通过对MCI患者、AD患者和正常认知人群进行血小板蛋白质组学分析，然后对MCI和AD患者中的差异蛋白及相关生物信息学分析，接着分析候选血小板蛋白的区分认知损伤人群的能力，进一步筛选出候选蛋白，然后使用机器学习鉴定出区分认知损伤人群的最佳组合标志物(PHB，UQCRH，GP1BA和FINC)，并对最佳标志物组合物的诊断效率进行验证，接着与单个生物标志物的诊断效能进行比较，结果表明最佳组合标志物(PHB，UQCRH，GP1BA和FINC)具有最高的准确率。

[0063] 由此可见，本发明所述的由PHB，UQCRH，GP1BA和FINC组成的生物标志物可以用于预测老年人发生AD的风险，具有准确率高、灵敏度高、特异性好的特点。

[0064] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。