一种基于分子动力学模拟的核酸适配体优化设计方法

摘要

本发明属于核酸适配体设计技术领域，具体为一种基于分子动力学模拟的核酸适配体优化设计方法。本发明从SELEX技术筛选所得核酸适配体的3D结构出发，通过自发结合模拟获得小分子结合核酸适配体所形成复合物的3D结构；并分析复合物的结构和关键结合位点，利用所得信息指导核酸适配体序列的截短优化。本发明已用于特异结合毒素TTX的核酸适配体TTX‑27的优化设计中；该核酸适配体通过SELEX技术筛选所得，亲和力为90.73nM。通过优化得到TTX‑27的一个截短型核酸适配体(TTX‑D2)，适配体序列截去13个碱基，采用MST实验验证该核酸适配体的亲和力提高了2倍；说明本优化方法是合理且有效的。

权利要求

1.一种基于分子动力学模拟的核酸适配体优化设计方法，其特征在于，具体步骤为：第一步：进行分子对接，预测靶标分子与核酸适配体结合时的解离平衡常数；

其中，分子对接所用软件为AutoDock分子对接软件包，配体分子为靶标小分子，受体分子为靶标小分子核酸适配体；分子对接采用的算法为拉马克遗传算法LGA，该算法将遗传算法和局部搜索结合在一起，遗传算法用于全局搜索，局部搜索用于能量优化；对接方法采用半柔性对接，即在对接过程中，核酸适配体的构象不发生变化，而靶标小分子的构象在一定的范围内变化；为了确保靶标小分子能够充分搜索构象，将对接格子的长宽高均设置为150 Å；格点之间的间隔为0.375 Å，对接格子的中心为核酸适配体的几何中心；

第二步：进行配体自发结合分子动力学模拟，以获得稳定的靶标小分子结合核酸适配体所形成复合物的3D结构；

其中，靶标小分子的AMBER力场参数采用AmberTools自带的Antechamber软件包生成；

同时采用GROMACS‑5.1.4分子动力学软件，AMBER99bsc1力场及SPC水模型对模拟体系进行建模；在模拟体系中，核酸适配体置于水盒子的中心，且距水盒子表面的最小距离为15 Å；

为了与溶液环境保持一致，将插入金属阳离子和相应的阴离子使溶液环境保持中性；模拟过程采用周期性边界条件，静电和范德华相互作用分别采用PME和Cut‑off方法计算，截断距离均为14 Å；所有化学键均受LINCS算法约束；其中，积分时间步长为1 3 fs；具体过程~

为：首先利用最陡下降算法对模拟系统进行能量最小化；然后采用v‑rescale恒温器控制系统平衡温度，berendsen压力耦合平衡压强；最后，在md集成器中对体系进行时间长度不少于150 ns分子动力学模拟；

第三步：分析复合物的结构并截短核酸适配体；

在第二步中获得了靶标小分子与核酸适配体的分子动力学模拟轨迹，根据轨迹中稳定结合状态下的复合物结构，分析结合模式，将远离结合部位的茎环序列截去，并利用mini‑hairpin序列替代，获得截短优化适配体；Mini‑hairpin的茎状结构含有3 4对互补的碱基~

对，环状结构含有3 4个孤立的碱基；Mini‑hairpin的3D结构通过Rosetta程序中的RNA 3D ~

structure modeling模块获得；

第四步：利用分子对接评估优化方案；

通过分子对接，预测靶标小分子与截短型核酸适配体结合时的解离平衡常数，并与第一步中预测的靶标小分子与原核酸适配体结合时的解离平衡常数作比较，如果截短型核酸适配体解离平衡常数小于原核酸适配体解离平衡常数，表明优化设计初步成功；

其中，分子对接所用软件为AutoDock分子对接软件包，配体分子为靶标小分子，受体分子为截短型核酸适配体；分子对接采用的算法为拉马克遗传算法LGA；对接方法采用半柔性对接；将对接格子的长宽高均设置为150 Å；格点之间的间隔为0.375 Å，对接格子的中心为截短型核酸适配体的几何中心；

第五步：采用微量热泳动实验检测核酸适配体与靶标小分子的结合强度；

微量热泳动利用分子的热泳动现象，通过测量温度梯度下，分子耦合时水化层、分子大小和电荷等微小变化引发的热泳动变化，进而分析分子之间的相互作用；对于每一组MST实验，设计16个靶标小分子的浓度用于16根毛细管，利用梯度稀释法1:1稀释靶标小分子，其中每根毛细管中核酸适配体的浓度固定；荧光标记于核酸适配体3’端；核酸适配体与靶标小分子的偶联会影响热泳动的过程，由此导致热泳动之后荧光信号值的变化；通过测量在不同结合程度下，样品溶液MST过程荧光变化信号，拟合得到关于该结合反应解离平衡常数Kd值。

2.根据权利要求1所述的基于分子动力学模拟的核酸适配体优化设计方法，其特征在于，其中，所述核酸适配体为TTX‑27，所述靶标小分子为靶向河豚毒素TTX；优化得到核酸适配体，记为TTX‑D2。

3.一种由权利要求1所述优化设计方法得到的核酸适配体。

4.一种由权利要求2所述优化设计方法得到的核酸适配体。

说明书

一种基于分子动力学模拟的核酸适配体优化设计方法

技术领域

[0001] 本发明属于核酸适配体设计技术领域，具体涉及核酸适配体设计方法。

背景技术

[0002] 核酸适配体是一段单链脱氧核糖核酸(ssDNA)，核糖核酸(RNA)，可通过折叠形成不同且复杂的二级或三级结构以较高亲和力与特异靶标结合(1,2)。由于核酸适配体对靶
标具有高特异性和高亲和性，因此其也被称为化学抗体，解离平衡常数(Kd)通常在皮摩尔
至纳摩尔范围内。与抗体相比，得益于体外筛选的核酸适配体，合成简单，运输简便，易于化
学修饰，拥有更为广阔的靶标分子，包括金属离子、小分子、蛋白质、细胞和病毒等，故在医
学诊断和治疗、生物传感及检测、药物递送等领域有重大潜力(3)。

[0003] 核酸适配体主要由SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment, 指数富集配基进化)技术筛选得到，其基本原理(4)：在筛选之前，要合成一个
15
包含多达10 个不同序列的单链寡核苷酸文库，每一轮筛选分离出未结合序列，富集有亲和
力的核酸序列，通过多轮筛选后，得到具有高亲和性和高特异性的寡核苷酸链即为该靶标
分子的适配体。然而，传统的SELEX技术需要经过数周乃至数月的时间才能获得特定的候选
适配体，命中率很低；除此之外，很多情况下，筛选得到的核酸适配体长度通常太长，导致合
成成本较高，也存在冗余碱基序列，在检测过程中易出现副反应，不利于工程化使用。

[0004] 因此，急需提出一种post‑SELEX (后SELEX)优化设计方法，以在保证结合活性的前提下，截短核酸适配体序列。但是目前多数结构剪裁方法大多采用试错法随机尝试，尚无
基于结构指导的理性设计方法。理论上，小分子结合核酸适配体所形成复合物的3D结构能
够通过X射线结晶衍射(X‑ray Crystallography)(5)和核磁共振(NMR, Nuclear Magnetic 
Resonance)(6)实验方法获得。但是，核酸适配体具有较强的灵活性，这些方法难以大量应
用，故采用计算方法建立结构模型以优化核酸适配体。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的是提供一种采用分子动力学模拟，并基于复合物的结构进行截短设计的核酸适配体优化方法，记为post‑SELEX优化方法。

[0006] 本发明的另一目的是提供靶向TTX的核酸适配体TTX‑27的截短型高亲和力变异体(TTX‑D2)。

[0007] 本发明提出的基于分子动力学模拟的核酸适配体优化设计方法，采用自发结合模拟获得靶标小分子结合核酸适配体所形成复合物的稳定结构，规避了核酸适配体因灵活性
较强而难以通过实验方法获得其3D结构这一问题。随后通过分析复合物的结构，理性地设
计亲和力不弱于原适配体并且序列更短的变体适配体，并采用分子对接的方法评估优化方
案。为SELEX筛选所得的核酸适配体提供一种合理且有效的post‑SELEX优化方法。本发明提
供的基于单核苷酸分子对接的核酸适配体设计方法，具体步骤为：

[0008] 第一步：进行分子对接，预测靶标分子与核酸适配体结合时的解离平衡常数。

[0009] 其中，分子对接所用软件为AutoDock分子对接软件包(7)，配体分子为靶标小分子，受体分子为靶标分子核酸适配体；分子对接采用的算法为拉马克遗传算法(LGA)，该算
法将遗传算法和局部搜索结合在一起，遗传算法用于全局搜索，局部搜索用于能量优化；对
接方法采用的是半柔性对接，即在对接过程中，核酸适配体的构象不发生变化，而靶标分子
的构象在一定的范围内变化；为了确保靶标分子能够充分搜索构象，将对接格子的长宽高
均设置为150 Å；格点之间的间隔为0.375 Å，对接格子的中心为核酸适配体的几何中心；

[0010] 第二步：进行配体自发结合分子动力学模拟，以获得稳定的靶标小分子结合核酸适配体所形成复合物的3D结构；

[0011] 其中，靶标小分子的通用AMBER力场参数采用AmberTools自带的Antechamber软件包生成；同时采用GROMACS‑5.1.4分子动力学软件包(8)，AMBER99bsc1力场及SPC水模型(9,
10)对模拟体系进行建模；在模拟系统中，核酸适配体置于水盒子的中心，且距水盒子表面
的最小距离为15 Å；为了与溶液环境保持一致，将插入金属阳离子和相应的阴离子使溶液
环境保持中性；模拟过程采用周期性边界条件，静电和范德华相互作用分别采用PME(9)和
Cut‑off方法计算，截断距离均为14 Å；所有化学键均受LINCS算法(11)约束；其中，积分时
间步长为1 3 fs；具体过程为：首先利用最陡下降算法对模拟系统进行能量最小化；然后采
~
用v‑rescale恒温器控制系统平衡温度，berendsen压力耦合平衡压强(12)；最后，在md集成
器(13)中对体系进行时间长度不少于150 ns分子动力学模拟；

[0012] 第三步：分析复合物的结构并截短核酸适配体；

[0013] 在第二步中获得了靶标分子与核酸适配体的分子动力学模拟轨迹，根据轨迹中稳定结合状态下的复合物结构，分析结合模式，将远离结合部位的茎环序列截去并利用Mini‑
hairpin序列(14)替代，获得截短优化适配体；Mini‑hairpin的茎状结构含有3 4对互补的
~
碱基对，环状结构含有3 4个孤立的碱基；Mini‑hairpin的3D结构通过Rosetta程序中的RNA 
~
3D structure modeling模块(15)获得；

[0014] 第四步：利用分子对接评估优化方案；

[0015] 通过分子对接，预测靶标小分子与截短型核酸适配体结合时的解离平衡常数，并与第一步中预测的靶标分子与原核酸适配体结合时的解离平衡常数作比较，如果截短型核
酸适配体解离平衡常数小于原核酸适配体解离平衡常数，则表明优化设计初步成功。

[0016] 其中，分子对接所用软件为AutoDock分子对接软件包，配体分子为靶标小分子，受体分子为截短型核酸适配体；分子对接采用的算法为拉马克遗传算法(LGA)，；对接方法采
用的是半柔性对接；将对接格子的长宽高均设置为150 Å；格点之间的间隔为0.375 Å，对接
格子的中心为截短型核酸适配体的几何中心；

[0017] 第五步：采用微量热泳动（MST）实验检测核酸适配体与靶标小分子的结合强度；

[0018] 微量热泳动(MST, microscale thermophoresis)(16)利用分子的热泳动现象，通过测量温度梯度下，分子耦合时水化层、分子大小和电荷等微小变化引发的热泳动变化，进
而分析分子之间的相互作用；对于每一组MST实验，设计16个靶标小分子的浓度用于16根毛
细管，利用梯度稀释法1:1稀释靶标小分子，其中每根毛细管中核酸适配体的浓度固定；荧
光标记于核酸适配体3’端；核酸适配体与靶标小分子的偶联会影响热泳动的过程，由此导
致热泳动之后荧光信号值的变化；通过测量在不同结合程度下，样品溶液MST过程荧光变化
信号，可以拟合得到关于该结合反应解离平衡常数Kd值。

[0019] 本发明的一个实施例中，所述核酸适配体为TTX‑27(17)，所述靶标小分子为靶向TTX(17)；优化得到核酸适配体，记为TTX‑D2。

[0020] 本发明提供的post‑SELEX优化方法，是通过自发结合模拟获得复合物的稳定结构，并采用分子对接评估核酸适配体与小分子的结合能力。由于SELEX技术筛选得到的核酸
适配体序列通常较长，含有冗余碱基序列，在检测过程中会产生副反应，并且不利于大规模
合成生产。而理性的优化设计需要复合物的3D原子结构信息，由于核酸适配体具有很强的
灵活性，采用常规的实验方法很难获得其3D构型，自发结合分子动力学模拟则可以很好的
替代这一过程。分子对接可以预测靶标分子与核酸适配体的结合亲和力，作为评估指标。因
此采用这一优化方法，可以理性地优化核酸适配体，在维持核酸适配体亲和力不变的前提
下截短核酸适配体序列。

附图说明

[0021] 图1为post‑SELEX优化方法的流程图。

[0022] 图2为TTX‑27序列和TTX结构式。

[0023] 图3为随时间变化TTX‑27:TTX‑27体系的结合能。

[0024] 图4为TTX‑27:TTX复合物的结构变化图。

[0025] 图5为TTX‑27中每个核苷酸最接近TTX的概率。

[0026] 图6为核酸适配体的MST实验。

具体实施方式

[0027] 下面以靶向TTX (Tetrodotoxin)的核酸适配体TTX‑27的计算设计方法为例，进一步说明本发明方法具体过程。

[0028] 第一步：进行分子对接，预测靶标分子与核酸适配体结合时的解离平衡常数；

[0029] 第一步旨在利用分子对接预测TTX与TTX‑27结合时的解离平衡常数，作为后续步骤的评估标准。分子对接方法能快速寻找TTX与TTX‑27的结合位点并预测结合时的解离平
衡常数。TTX结构来自于PDB数据库(ID:6A95)，TTX‑27的结构采用RNAStructure和Rosetta
中RNA 3D structuremodeling模块生成。分子对接所用软件为AutoDock分子对接软件包，
配体分子为TTX，受体分子为TTX‑27；分子对接采用的算法为拉马克遗传算法(LGA)，该算法
将遗传算法和局部搜索结合在一起，遗传算法用于全局搜索，局部搜索用于能量优化；对接
方法采用的是半柔性对接，即在对接过程中，TTX‑27的构象不发生变化，而TTX的构象在一
定的范围内变化；为了确保靶标分子能够充分搜索构象，将对接格子的长宽高均设置为150 
Å；格点之间的间隔为0.375 Å，对接格子的中心为核酸适配体的几何中心；

[0030] 第二步：进行配体自发结合分子动力学模拟，以获得稳定的靶标小分子结合核酸适配体所形成复合物的3D结构；

[0031] 第二步是无偏好的自发结合模拟，目的是获得稳定且合理的TTX‑27:TTX复合物3D结构。配体自发结合的无偏性分子动力学(MD, molecular dynamics)模拟不仅能够可靠地
确定配体的结合路径和结合位点，还可以获得复合物的稳定构象。核酸适配体TTX‑27的序
列和毒素小分子TTX的结构如图2所示。毒素分子TTX的GAFF参数采用AmberTools自带的
Antechamber软件包生成。获得小分子的力场参数后，为了避免相互作用的影响，小分子TTX
与TTX‑27表面的距离在15Å以上。同时采用Gromacs‑5.1.4分子动力学软件包、AMBER99bsc1
力场以及SPC水模型对核酸适配体模拟系统进行建模。在模拟系统中，核酸适配体置于水立
方体的中心，水立方的表面与核酸适配体的最小距离为15Å。为了保证实验与模拟的一致
2+ ‑
性，加入溶液中的金属阳离子和阴离子分别为Mg 和Cl ，目的是模拟实验溶液条件，溶液中
离子浓度为0.15nmol/L。模拟过程采用周期性边界条件，静电和范德华相互作用分别采用
PME和Cut‑off方法计算，截断距离均为14 Å。所有化学键均受LINCS算法约束，积分时间步
长为2fs。具体过程为：首先利用最陡下降算法对模拟系统进行5000步的能量最小化。然后
采用v‑rescale恒温器控制系统在300K的温度下平衡50ps，berendsen压力耦合将系统压力
耦合到1atm下平衡50 ps。最后，在md集成器中对体系进行长达150 ns的分子动力学模拟。

[0032] 第三步：分析复合物的结构并截短核酸适配体；

[0033] 通过自发结合模拟，能够得到TTX‑27与TTX的分子动力学模拟轨迹，这些轨迹显示了TTX‑27结合TTX的整个过程，如图3、图4所示。TTX在10.0ns以前游离在TTX‑27的不同部
位。然后在25.5ns左右进入结合区域，与TTX‑27进入结合状态。但是在这个过程中，TTX‑27
的构象一直在变化，不断的向两个方向延展，逐渐将结合区域暴露出来，最终形成稳定的结
‑1
合状态。图3中可以看到结合自由能一直维持在‑7.0kcal·mol 左右，证明复合物的结构稳
定，有较强的相互作用。而图5中可以看出第3、4、38、39、40、71、72位的碱基与TTX接触概率
很高，因此在修饰核酸适配体时应当避开这些关键的结合碱基。

[0034] 为了能让结合部位提早暴露出来，我们将靠近TTX‑27的3’端的大茎环，利用mini‑hairpin结构替代。Mini‑hairpin结构具有良好的热稳定性，且其核酸序列较短，因此能够
起到一个稳定的连接作用。最终获得的变体适配体序列为5’‑ATAGGAGTCACGACGACCAGCTCC
ATTTATTCTAAATTTCATAGACCGAAAGCGGTCTACCTCTTGA‑3’（SEQ.ID.NO 1）。随后利用
RNAStructure和Rosetta中RNA 3D structuremodeling模块生成优化适配体TTX‑D2的3D模
型。相较于TTX‑27，TTX‑D2的碱基数目减少了13个。

[0035] 第四步：利用分子对接评估优化方案；

[0036] 第四步的分子对接，旨在预测TTX‑D2与TTX结合时的解离平衡常数，并与第一步中预测的TTX与TTX‑27结合时的解离平衡常数作比较，如果TTX‑D2的解离平衡常数小于TTX‑
27的解离平衡常数，则表明优化设计初步成功。

[0037] 分子对接方法能快速寻找TTX与TTX‑27的结合位点并预测结合时的解离平衡常数。TTX结构来自于PDB数据库(ID:6A95)，TTX‑27的结构采用RNAStructure和Rosetta中RNA 
3D structuremodeling模块生成。分子对接所用软件为AutoDock分子对接软件包，配体分
子为TTX，受体分子为TTX‑27；分子对接采用的算法为拉马克遗传算法(LGA)，该算法将遗传
算法和局部搜索结合在一起，遗传算法用于全局搜索，局部搜索用于能量优化；对接方法采
用的是半柔性对接，即在对接过程中，TTX‑27的构象不发生变化，而TTX的构象在一定的范
围内变化；为了确保靶标分子能够充分搜索构象，将对接格子的长宽高均设置为150 Å；格
点之间的间隔为0.375 Å，对接格子的中心为核酸适配体的几何中心；

[0038] 其中，分子对接所用软件为AutoDock分子对接软件包，配体分子为TTX，受体分子为TTX‑D2；分子对接采用的算法为拉马克遗传算法(LGA)，；对接方法采用的是半柔性对接，
即在对接过程中，TTX‑D2的构象不发生变化，而TTX的构象在一定的范围内变化；将对接格
子的长宽高均设置为150 Å；格点之间的间隔为0.375 Å，对接格子的中心为截短型核酸适
配体的几何中心；

[0039] 第五步：采用MST实验测量适配体与靶标小分子的结合亲和力。

[0040] 本实验采用微量热泳动(MST, microscale thermophoresis)实验确定核酸适配体TTX‑D2与TTX的结合能力。MST实验是利用分子的热泳动现象，通过测量温度梯度下，分子
耦合时水化层、分子大小和表面电荷等微小变化引发的热泳动变化，进而分析分子之间的
相互作用。目前该方法已广泛用于分析蛋白质与蛋白质、蛋白质和核酸、蛋白质与小分子、
核酸与核酸、核酸与小分子之间的相互作用。实验中所用的靶标小分子TTX购于北京普华仕
科技发展有限公司，所用核酸适配体以及其余化学试剂均购自上海生工生物工程有限公
司。实验所用的设备为德国Nano Temper Technologies的Monolith NT.115分子间相互作
用仪。

[0041] 1、样品准备：本发明用于MST实验的缓冲液为50 mmol/L Tris、150 mmol/LNaCl、2mmol/L MgCl2，维持体系的pH为7.4。缓冲液制备完后用0.2 μm的水相过滤膜过滤以除去
溶液中的颗粒物。本实验所用的核酸适配体用缓冲液稀释到200 nmol/L，取200μL核酸样品
置于加热器中95℃加热10分钟，然后冰浴5分钟，最后在室温下静置5分钟。

[0042] 2、MST实验检测：MST实验用于测量Kd值时，采用梯度稀释的方法，将TTX溶液依次稀释成16组。具体操作为：①准备16个PCR管，编号为1到16。向第一个管中加入20 μL的5μ
mol/L TTX溶液。②第2个到第16个管中分别加入10 μL的缓冲液。③将前一管中的10 μL依
次转移到下一管中，并充分混匀，最后从第16管20 μL溶液中吸走10 μL。最终得到16管10 μ
L且浓度依次减半的TTX溶液。④每管中依次加入10 μL的0.2 μmol/L荧光标记的核酸适配
体溶液。TTX荧光标记(6‑FAM)连接在核酸适配体的5’端。此时体系中TTX的初始稀释浓度为
2.5 μmol/L，核酸适配体的浓度为0.1μmol/L。避光室温孵育2 h后用于MST实验。

[0043] 确定了核酸适配体TTX‑D2 和TTX的浓度之后，将样品置于毛细管中，并依此放入毛细管架的凹槽中，毛细管架装入MST仪器后，关闭仪器舱门。在操作界面上依次填写16个
毛细管中TTX的终浓度，然后将MST Power设定为40%，再点击操作界面的Start Cap Scan，
查看扫描出来的16个毛细管的初始荧光值是否一致(保证荧光标记分子浓度一致)。如果不
一致将会影响数据的收集和拟合，一般荧光值的偏差控制在10%之内。通过扫描毛细管中的
样品还可以判断分子是否聚集于毛细管表面，当扫描结果为一个光滑的峰形图时，则说明
管壁未聚集样品分子。当结果显示正常时，可以点击Start MST Measurement按钮进行MST
实验。待实验结束后，将数据导入MO.Affinity Analysis软件进行分析。测量结果如图6所
示，TTX‑D2的Kd值为38.14nM，说明此核酸适配体与TTX具有高亲和性。证明基于毒素小分子
TTX进行的核酸适配体设计方法是合理且有效的。

[0044] 参考文献

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