光敏剂驱动的二聚体前药共组装纳米粒及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN202110267811.8
文献号 : CN113135875B
文献日 : 2022-10-18
发明人 : 罗聪 , 张申武 , 孙进 , 何仲贵
申请人 : 沈阳药科大学
摘要 :
本发明公开了一种光敏剂(PPa)驱动的氧化敏感的卡巴他赛二聚体前药(CTX‑S‑CTX)共组装纳米粒，属于药物制剂新辅料和新剂型领域。通过硫代羟基乙酸酐和卡巴他赛反应得到前药CTX‑S‑CTX，然后将合成的前药CTX‑S‑CTX、光敏剂和PEG修饰剂溶解到有机溶剂中，缓缓滴加到去离子水中，透析后即得。本发明的共组装纳米制剂实现了载药量高、稳定性好、毒副作用低和肿瘤部位定点解体等技术效果，为开发二聚体前药的递送、光动化疗的联合应用提供新的策略和更多的选择，满足临床中对高效化疗制剂的迫切需求。
权利要求 :
1.一种光敏剂驱动的二聚体前药共组装的纳米粒在制备抗肿瘤药物传递系统中的应用，其特征在于，所述的纳米粒的制备方法包括如下步骤：取前药CTX‑S‑CTX和光敏剂，溶解到乙醇与四氢呋喃的混合溶剂中，搅拌条件下，缓缓滴加到去离子水中，然后通过透析除去有机溶剂，即得；
或者，取前药CTX‑S‑CTX、光敏剂和PEG修饰剂，溶解到乙醇与四氢呋喃的混合溶剂中，搅拌条件下，缓缓滴加到去离子水中，然后通过透析除去有机溶剂，即得；
所述的前药CTX‑S‑CTX的合成方法包括如下步骤：将硫代羟基乙酸酐和卡巴他赛反应得到中间产物，然后将中间产物与卡巴他赛反应，得到前药CTX‑S‑CTX；
所述光敏剂为焦脱镁叶绿酸a；
所述PEG修饰剂为PCL‑PEG 、DSPE‑PEG 、PLGA‑PEG、PE‑PEG中的一种或二种以上，PEG的分子量为200‑20000；
所述CTX‑S‑CTX和光敏剂的摩尔比为10:1 1:10；
~
所述CTX‑S‑CTX和PEG修饰剂的摩尔比为20:1 10:3；
~
所述乙醇与四氢呋喃的混合溶剂中CTX‑S‑CTX的浓度为0.0001‑1mol/L。
说明书 :
光敏剂驱动的二聚体前药共组装纳米粒及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于药物制剂新辅料和新剂型技术领域，具体涉及一种光敏剂驱动的氧化敏感的卡巴他赛二聚体前药共组装纳米粒，具体涉及包括光敏剂(焦脱镁叶绿酸a，PPa)驱动的氧化敏感的卡巴他赛二聚体前药共组装纳米粒的构建以及其在药物传递中的应用。
背景技术
[0002] 目前，人类健康不断受到多种恶性肿瘤的威胁，尽管各种新兴的治疗方法已经被开发用于癌症治疗，化疗仍然是临床实践中最常用的治疗方法之一。由于大多数常规化疗药物的理化性质较差，肿瘤靶向能力较差，导致临床化疗结果往往不尽人意。此外，由于治疗窗口狭窄，一些化疗药物通常会导致严重的全身毒性。近年来，纳米技术已被广泛应用于解决化疗药物溶解性差和脱靶效应等问题。多种纳米药物已被开发并应用于癌症治疗，如紫杉醇白蛋白纳米粒(Abraxane)。值得注意的是，大多数的药物由于被非共价包裹在纳米载体中，从而导致了载药量低、药物易泄漏和载体相关毒性等缺陷。此外，复杂的制备技术已被广泛认为是阻碍大多数常规纳米药物临床成功转化的主要障碍之一。因此，科学家们致力于构建一种简单、高效的纳米粒给药系统(nano‑DDS)用于癌症的治疗。
[0003] 近十年来，人们努力开发无载体的前药自组装的纳米粒。前药自组装纳米粒具有制备简便、重现性好、载药能力高和可忽略载体材料诱导的毒性等显著优势，为抗癌药物传递提供了一个很有前途的平台。特别是同型二聚体前药的自组装纳米粒子作为一种独特而有前途的纳米制剂，已经引起了广泛关注。同型二聚体药物前体纳米组装不仅具有与前药纳米粒相同的优点，而且比单体药物的前药纳米粒具有更高的载药能力。然而，大多数同型二聚体前药由于具有对称的分子结构通常具有较差的自组装能力和组装稳定性。因此，迫切需要解决同型二聚体前药的组装能力问题。
[0004] 光动力治疗(PDT)是一种被临床认可的非侵入性的治疗方式，具有局部选择性和低的毒性。在激光照射下，光敏剂产生的活性氧(ROS)可杀死肿瘤细胞。值得注意的是，大多数具有高度共轭芳香结构的光敏剂通常表现出较强的分子间力。疏水的光敏剂赋予纳米体系更强的分子间疏水力、氢键力以及π‑π堆积作用。
[0005] 化疗与PDT联合是通过化疗药物与光敏剂的协同作用提高肿瘤治疗效率的有效策略。更重要的是，减少化疗药物的剂量可以显著减轻化疗相关的毒副作用，研究开发一种用于增强化学治疗和光动力的协同治疗效果的光敏剂驱动的同型二聚体前药纳米组装体是当前亟待研究的重要课题。
发明内容
[0006] 基于背景技术所述的技术问题，本发明进一步为了解决CTX疏水性差、难溶于水、包载于聚合物中导致载药量低、药物泄露和辅料相关毒性差等问题，设计一种光敏剂焦脱镁叶绿酸a(PPa)驱动的氧化敏感的二聚体前药纳米粒，从而实现载药量高、稳定性好、毒副作用低和肿瘤部位定点解体等技术效果，进而解决了二聚体前药的自组装问题和光敏剂的聚集诱导引起的淬灭(ACQ)效应，提高了化疗和光动力学的联合治疗效果。
[0007] 本发明的目的是合成氧化敏感的二聚体前药(CTX‑S‑CTX)以及PPa驱动的二聚体前药(CTX‑S‑CTX)共组装纳米粒(CTX‑S‑CTX/PPa纳米粒)，包括药物(PPa和CTX‑S‑CTX)单独组装而成，或药物PPa和CTX‑S‑CTX和PEG修饰剂(DSPE‑PEG2K)组装而成的纳米粒。
[0008] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：
[0009] 一种氧化敏感的卡巴他赛二聚体前药CTX‑S‑CTX的合成方法，包括如下步骤：将硫代羟基乙酸酐和卡巴他赛反应得到中间产物，然后将中间产物与卡巴他赛反应，得到前药CTX‑S‑CTX。
[0010] 进一步地，一种氧化敏感的卡巴他赛二聚体前药CTX‑S‑CTX的合成路线如下：
[0011]
[0012] 进一步地，一种氧化敏感的卡巴他赛二聚体前药CTX‑S‑CTX的合成方法，包括如下步骤：
[0013] (1)将硫代羟基乙酸酐和卡巴他赛加入到反应器中，加入二氯甲烷溶解，室温下搅拌1‑48h，分离纯化获得中间产物。
[0014] (2)将步骤(1)制备的中间产物、EDCI和DMAP加入到反应器中，加入二氯甲烷中，冰浴1‑10h，加入卡巴他赛，在室温下搅拌1‑24h，分离纯化获得前药CTX‑S‑CTX。
[0015] 进一步地，步骤(1)和步骤(2)的反应过程均在N2保护下进行。
[0016] 进一步地，步骤(1)和步骤(2)中所述的分离纯化通过薄层色谱监测反应过程，用制备液相法纯化。
[0017] 进一步地，步骤(1)中硫代羟基乙酸酐和卡巴他赛的摩尔比为1:(1‑10)，硫代羟基乙酸酐的浓度为0.001‑1mol/L。
[0018] 进一步地，步骤(2)中所述中间产物、EDCI、DMAP和卡巴他赛的摩尔比为1:(1‑2):(1‑2):(1‑2)，所述中间产物的浓度为0.001‑1mol/L。
[0019] 本发明提供了上述方法合成的CTX‑S‑CTX前药。
[0020] 本发明提供了一种光敏剂驱动的二聚体前药共组装的纳米粒的制备方法，包括如下步骤：称取上述方法合成的CTX‑S‑CTX和光敏剂，溶解到乙醇与四氢呋喃的混合溶剂中，搅拌条件下，缓缓滴加到去离子水中，然后通过透析除去有机溶剂，即得；
[0021] 或者，称取上述方法合成的CTX‑S‑CTX、光敏剂和PEG修饰剂，溶解到乙醇与四氢呋喃的混合溶剂中，搅拌条件下，缓缓滴加到去离子水中，然后通过透析除去有机溶剂，即得。
[0022] 进一步地，所述光敏剂为卟啉类光敏剂，优选为焦脱镁叶绿酸a、叶绿素a、脱镁叶绿酸a、焦脱镁叶绿酸a己醚、二氢卟吩e6中的一种或二种以上。
[0023] 进一步地，优选为焦脱镁叶绿酸a。
[0024] 进一步地，所述PEG修饰剂为PCL‑PEG、DSPE‑PEG、PLGA‑PEG、PE‑PEG中的一种或二种以上，PEG的分子量为200‑20000。
[0025] 进一步地，优选为DSPE‑PEG2K。
[0026] 进一步地，所述乙醇与四氢呋喃的混合溶剂中乙醇与四氢呋喃的体积比为1：1‑3：1。
[0027] 进一步地，CTX‑S‑CTX和光敏剂的摩尔比为10:1～1:10。
[0028] 进一步地，CTX‑S‑CTX和PEG修饰剂的摩尔比为20:1～10:3。
[0029] 进一步地，所述乙醇与四氢呋喃的混合溶剂中CTX‑S‑CTX的浓度为0.0001‑1mol/L。
[0030] 本发明提供了上述方法制备的光敏剂驱动的二聚体前药共组装的纳米粒。
[0031] 本发明提供了上述方法合成的CTX‑S‑CTX前药和光敏剂驱动的二聚体前药共组装的纳米粒在制备药物传递系统中的应用。
[0032] 本发明提供了上述方法合成的CTX‑S‑CTX前药和光敏剂驱动的二聚体前药共组装的纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0033] 本发明提供了上述方法合成的CTX‑S‑CTX前药和光敏剂驱动的二聚体前药共组装的纳米粒在制备注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。
[0034] 本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
[0035] 1.本发明合成了一种氧化敏感的卡巴他赛二聚体前药，并制备了一种光敏剂PPa驱动的二聚体前药纳米粒，可用于癌症治疗，在内源性ROS的刺激下，纳米粒发生解体，显著缓解了PPa的聚集引起的猝灭(ACQ)效应，并且光敏剂在激光照射下产生的ROS与内源性ROS协同促进前药的快速激活，和化疗药物卡巴他赛协同租用，提高了化疗和光动力学的联合治疗效果。
[0036] 2.本发明的光敏剂PPa驱动的二聚体前药纳米粒实现载药量高、稳定性好、毒副作用低和肿瘤部位定点解体等技术效果，满足临床中对高效低毒制剂的迫切需求，为同型二聚体前药的组装提供了一个新策略，为开发无载体的二聚体药物纳米递送系统以及化疗‑光动力治疗提供了一个有效的纳米平台。
附图说明
[0037] 为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
[0038] 图1为本发明实施例1的CTX‑S‑CTX的质谱图。
[0039] 图2为本发明实施例1的CTX‑S‑CTX的合成图。
[0040] 图3为本发明实施例2的CTX‑S‑CTX前药沉淀和CTX‑S‑CTX/PPa纳米粒图。
[0041] 图4为本发明实施例2的CTX‑S‑CTX/PPa纳米粒的透射电镜图。
[0042] 图5为本发明实施例3的CTX‑S‑CTX和PPa分子对接图。
[0043] 图6为本发明实施例4的CTX‑S‑CTX/PPa纳米粒的胎牛血清介质中稳定性图。
[0044] 图7为本发明实施例4的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒的在不同浓度双氧水介质中粒径变化图。
[0045] 图8为本发明实施例4的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒在10mM双氧水中不同孵育时间的荧光图。
[0046] 图9为本发明实施例5的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒在不同浓度双氧水的荧光图。
[0047] 图10为本发明实施例6的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒在不同浓度双氧水的PBS溶液中的体外单线态氧产生图。
[0048] 图11为本发明实施例6的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒在10mM双氧水的PBS溶液不同孵育时间的体外单线态氧产生图。
[0049] 图12为本发明实施例6的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒在不同浓度双氧水的溶液中释放图。
[0050] 图13为本发明实施例6的PCTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒在不同激光照射时间条件下的释放图。
[0051] 图14为本发明实施例7的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒的双氧水+激光条件下的释放图。
[0052] 图15为本发明实施例8的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒的细胞摄取图。
[0053] 图16为本发明实施例8的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒的41T细胞毒图。
[0054] 图17为本发明实施例8的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒的KB细胞毒图。
[0055] 图18为本发明实施例9的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒的LO2细胞毒图。
[0056] 图19为本发明实施例10的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒和PPa溶液剂的血药浓度‑时间曲线图。
[0057] 图20为本发明实施例11中PPa溶液剂的组织分布图。
[0058] 图21为本发明实施例11的PPa溶液剂的组织分布定量图。
[0059] 图22为本发明实施例11的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒的组织分布图。
[0060] 图23为本发明实施例11的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒的组织分布定量图。
[0061] 图24为本发明实施例12的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒的在体抗肿瘤实验的肿瘤生长曲线图。
[0062] 图25为本发明实施例12的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒的在体抗肿瘤实验的小鼠体重变化图。
[0063] 图26为本发明实施例12的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒的肝肾功能图。
[0064] 图27为本发明实施例12的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒的病理切片图。
具体实施方式
[0065] 下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
[0066] 实施例1：氧化敏感的卡巴他赛二聚体前药CTX‑S‑CTX的合成
[0067] 将0.01mol硫代羟基乙酸酐和0.01mol卡巴他赛加入到50mL圆底烧瓶中，并用20mL二氯甲烷溶解，室温下搅拌24个小时，通过薄层色谱监测反应过程，用制备液相法纯化得到中间产物。然后将中间产物0.005mol、0.006mol EDCI和0.006mol DMAP溶于20mL无水二氯甲烷中，冰浴1小时，然后加入0.005mol卡巴他赛，在室温下再搅拌24小时，通过薄层色谱监测反应过程，目标产物通过制备液相色谱分离纯化既得，上述反应全程都在N2保护下进行。
[0068] 采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例1中前药的结构，结果如图1和图2所示。核磁共振选用的溶剂为氘代DMSO，氢谱解析结果如下：
[0069] 1H NMR结果:1H NMR(400MHz,DMSO‑d6,ppm):δ7.97‑7.99(d,4H,Ar‑H),7.83‑7.85(d,2H,Ar‑H),7.740(t,2H,Ar‑H),7.661(t,4H,Ar‑H),7.39‑7.44(d,6H,Ar‑H),7.182(t,2H,–NH–),5.831(t,2H,13‑CH),5.379(d,2H,2‑CH),5.148(d,2H,3’‑H),5.095(t,2H,10‑CH),4.968(s,2H,2’‑H),4.692(d,2H,5‑CH),4.482(d,2H,7‑H),4.019(s,4H,20‑CH2),
3.757(m,2H,7‑CH),3,597(s,4H,CH2SCH2),3.282(s,6H,10‑OCH3),3.197(s,6H,7‑OCH3),
2.656(m,2H,3‑CH),2.259(s,6H,‑OAc),1.806(s,6H,18‑CH3),1.506(10H,14‑CH2,19‑CH3),
1.668(s,6H,19‑CH3),1.373(s,18H,C(CH3)3),0.985(s,6H,16‑CH3),0.966(s,6H,17‑CH3).[0070] 实施例2：CTX‑S‑CTX/PPa纳米粒的制备
3.757(m,2H,7‑CH),3,597(s,4H,CH2SCH2),3.282(s,6H,10‑OCH3),3.197(s,6H,7‑OCH3),
2.656(m,2H,3‑CH),2.259(s,6H,‑OAc),1.806(s,6H,18‑CH3),1.506(10H,14‑CH2,19‑CH3),
1.668(s,6H,19‑CH3),1.373(s,18H,C(CH3)3),0.985(s,6H,16‑CH3),0.966(s,6H,17‑CH3).[0070] 实施例2：CTX‑S‑CTX/PPa纳米粒的制备
[0071] 称取1mg CTX‑S‑CTX，用乙醇将其溶解，缓慢滴加到水里，结果如图3所示，析出白色沉淀，没有形成纳米粒，单独的CTX‑S‑CTX不能自组装形成纳米粒。
[0072] 将不同摩尔比的CTX‑S‑CTX和焦脱镁叶绿酸a(PPa)溶解到200μL的乙醇和四氢呋喃(体积比为1：1)中，搅拌下，将该溶液缓缓滴加到2mL去离子水中，PPa和CTX‑S‑CTX自发形成均匀的纳米粒，然后在25℃条件下于去离子水中透析除去纳米制剂中的有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。
[0073] 检测所制备的纳米制剂的粒径、粒径分布及CTX和PPa的协同指数，结果见表1。
[0074] 表1.CTX‑S‑CTX/PPa纳米粒的粒径、粒径分布以及CTX和PPa的协同指数[0075]
[0076] 如表1所示，纳米粒的粒径都在70‑90nm之间，协同指数0.45‑1.07。其中CTX‑S‑CTX：PPa＝1：4时，CTX‑S‑CTX/PPa纳米粒的粒径较小，CTX溶液剂和PPa溶液剂协同指数较高。初步优选CTX‑S‑CTX和PPa的比例为1：4。
[0077] (1)非PEG化的CTX‑S‑CTX/PPa纳米粒的制备方法：精密称取1mg CTX‑S‑CTX和四倍摩尔量的焦脱镁叶绿酸a(PPa)，用200μL乙醇和四氢呋喃的混合溶液(体积比为1：1)将其溶解，搅拌下，将该溶液缓缓滴加到2mL去离子水中，自发形成均匀的CTX‑S‑CTX/PPa纳米粒，然后在25℃条件下用去离子水透析除去纳米制剂中的有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液(图3)。
[0078] (2)PEG修饰的CTX‑S‑CTX/PPa纳米粒的制备方法：精密称取0.2mg PEG修饰剂(DSPE‑PEG2K)、1mg CTX‑S‑CTX和四倍摩尔量的PPa，用200μL乙醇和四氢呋喃的混合溶液(体积比为1：1)将其溶解，搅拌下，将该溶液缓缓滴加到2mL去离子水中，自发形成均匀的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒。然后在25℃条件下用去离子水透析除去纳米制剂中的有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液(图3)。
[0079] 通过动态光散射法检测所制备的CTX‑S‑CTX/PPa纳米粒和CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒的粒径、粒径分布、Zeta电位和载药量，结果见表2。
[0080] 表2.CTX‑S‑CTX/PPa纳米粒的粒径、粒径分布、Zeta电位和载药量
[0081]
[0082] 如表2所示，CTX‑S‑CTX/PPa纳米粒的粒径在80nm左右，Zeta电位在‑15mV左右，载药量97.1％；CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒粒径在90nm左右，Zeta电位在‑20mW左右,载药量80.9％。
[0083] 通过透射电子显微镜测定实施例2中制备的CTX‑S‑CTX/PPa纳米粒和PPEG修饰的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒的粒径和形态，结果如图4，透射电镜图表明纳米粒为均一的球形，粒径在80‑90nm左右。
[0084] 实施例3：CTX‑S‑CTX/PPa组装机理分析
[0085] 通过计算机模拟，探索CTX‑S‑CTX组装的机理，采用殷赋云计算平台的Vina方案完成分子对接计算。化合物CTX‑S‑CTX在MMFF94力场下进行能量最小化获得3D结构，形成稳定纳米组装体。采用AutoDock Vina程序进行半柔性对接，结果如图5所示，PPa和CTX‑S‑CTX，分子之间存在多种作用力，如π‑π堆积、疏水作用力、氢键作用和π‑阳离子作用，这些作用力对PPa和CTX‑S‑CTX的组装做出了巨大贡献。
[0086] 实施例4：纳米粒的胶体稳定性试验
[0087] 将实施例2中制备的CTX‑S‑CTX/PPa纳米粒和CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒取出1mL，加入到20mL含有10％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS，pH为7.4)中，在37℃的条件下孵育24小时，并且在预定的时间点(0,1，2,4,6,8和12小时)通过动态光散射法测定其粒径变化。结果如图6所示，与非PEG修饰的CTX‑S‑CTX/PPa纳米粒相比，CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒胶体稳定性较好，在12小时内粒径没有发生明显的变化。优选PEG修饰的CTX‑S‑CTX/PPa纳米粒。
[0088] 实施例5：缓解聚集诱导淬灭(ACQ)效应
[0089] 将实施例2中制备的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒取出1mL，加入到含有不同浓度双氧水的释放介质中(0、1mM、5mM和10mM)，释放介质为含有30％乙醇的磷酸盐缓冲液。孵育不同的时间(0、1h、2h、3h和4h)，观察纳米粒粒径的变化，结果如图7所示，可知，CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒的粒径在以时间和双氧水浓度依赖性方式显着增加。
[0090] 将实施例2中制备的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒取出1mL，加入到含有不同浓度双氧水的释放介质中，释放介质为含有30％乙醇的磷酸盐缓冲液，孵育不同的时间，检测孵育后溶液的PPa荧光变化，荧光信号强度通过varioskan lux多模式酶标仪(激发415nm，发射675nm)分析。结果如图8和图9所示,随着孵育时间的延长和双氧水浓度的提高，光敏剂PPa的荧光强度不断增强，有效的缓解了光敏剂PPa的ACQ效应。
[0091] 实施例6：纳米粒的体外单线态氧检测
[0092] 用单态氧荧光探针(SOSG)检测在激光照射下产生的单线态氧。将相同体积的与SOSG(1μM)混合的PPa溶液剂(1μM)、与SOSG(1μM)混合的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒(1μM，PPa当量)稀释在1mL含有不同浓度双氧水的PBS释放介质中，在激光照射(660nm，200mWcm‑2)不同时间或没有照射的情况下，检测各组制剂中产生的单线态氧，荧光信号强度通过varioskan lux多模式酶标仪(激发498nm，发射525nm)分析。
[0093] 结果如图10(附图中+表示激光照射，附图中‑表示无激光照射)和图11所示，在激光照射情况下，与PPa溶液剂相比，PPa自组装纳米粒的单线态氧产生量明显较少，随着孵育时间延长和双氧水浓度的提高，CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒的稳定性下降，明显缓解了ACQ效应，提高了单线态氧的产生量。
[0094] 实施例7：纳米粒的体外释放实验
[0095] 将实施例2中制备的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒取出1mL，加入到含有不同浓度双氧水的30mL释放介质中，释放介质为含有30％乙醇的磷酸盐缓冲液，在预定的时间点取出1mL释放介质，进行高效液相分析CTX释放情况，结果见图12。
[0096] 将实施例2中制备的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒取出1mL，加入到30mL释放介质中，释放介质为含有30％乙醇的磷酸盐缓冲液，给与不同的激光照射时间(660nm，200mWcm‑2)，在预定的时间点取出1mL释放介质，进行高效液相分析CTX释放情况，结果见图
13。
13。
[0097] 将实施例2中制备的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒取出1mL，加入到含有1mM双氧水的30mL释放介质中，给与2分钟的激光照射(660nm，200mWcm‑2)，释放介质为含有30％乙醇的磷酸盐缓冲液，在预定的时间点取出1mL释放介质，进行高效液相分析CTX释放情况，结果见图14。
[0098] 如图12‑14所示，CTX从CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒的释放呈现双氧水浓度和激光时间的依赖方式。同时，相比于只有双氧水孵育或者只有激光照射的情况下，当同时给与激光照射和双氧水孵育的情况下，CTX的释放明显的加快，进一步证明了，在激光照射下，CTX的释放呈现出一种自我增强的方式。
[0099] 实施例8：纳米粒的细胞摄取
[0100] 采用流式细胞仪测定实施例2中制备的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒在4T1细5
胞中的摄取情况。将4T1细胞以1×10 cells/mL的密度接种到12孔板上，置培养箱中孵育
24h使其贴壁，待细胞贴壁后加入PPa溶液和CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒，PPa的浓度均为50nM，在37℃孵化0.5小时、2小时和4小时后，清洗细胞，收集细胞并分散在PBS中，之后通过超声破碎、离心和沉淀蛋白法提取PPa,最后用varioskan lux多模式酶标仪(激发
415nm，发射675nm)分析细胞对各种制剂的摄取情况。
胞中的摄取情况。将4T1细胞以1×10 cells/mL的密度接种到12孔板上，置培养箱中孵育
24h使其贴壁，待细胞贴壁后加入PPa溶液和CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒，PPa的浓度均为50nM，在37℃孵化0.5小时、2小时和4小时后，清洗细胞，收集细胞并分散在PBS中，之后通过超声破碎、离心和沉淀蛋白法提取PPa,最后用varioskan lux多模式酶标仪(激发
415nm，发射675nm)分析细胞对各种制剂的摄取情况。
[0101] 实验结果如图15所示，摄取4小时实验组，纳米粒处理的细胞比游离PPa处理的细胞具有更高的细胞内荧光强度。因此，制备的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒具有比游离PPa更高的细胞摄取效率。
[0102] 实施例9：纳米粒的细胞毒性
[0103] 采用MTT法考察CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒对小鼠乳腺癌(4T1)细胞和人口腔表皮样癌(KB)细胞的细胞毒性。将状态良好的细胞消化，用培养液稀释至5000个细胞/毫升的细胞密度，吹匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液100μL，置培养箱中孵育24h使其贴壁。待细胞贴壁后加PPa溶液剂或CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒。本实验使用1640培养液来配制和稀释药物溶液与纳米粒制剂，并用0.22μm滤膜无菌过滤。受试溶液每孔加入100μL，每个浓度3个平行孔。对照组即不加待测药液，单一补加100μL培养液，置培养箱中和细胞共同孵育。涉及激光照射实验组，于加药后4小时后，激光照射(660nm，200mWcm‑2)，44小时，将
96孔板取出，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，置培养箱中孵育4小时后甩板，将96孔板倒扣于滤纸上充分吸干残留液体后，每孔加入200μL DMSO于振荡器上振荡10min以溶解蓝紫色结晶物。设定A1孔(只含有200μL DMSO)为调零孔。使用酶标仪在570nm处测定各孔调零后的吸光度值。
96孔板取出，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，置培养箱中孵育4小时后甩板，将96孔板倒扣于滤纸上充分吸干残留液体后，每孔加入200μL DMSO于振荡器上振荡10min以溶解蓝紫色结晶物。设定A1孔(只含有200μL DMSO)为调零孔。使用酶标仪在570nm处测定各孔调零后的吸光度值。
[0104] 细胞毒性结果如图16和图17所示，避光时，PPa溶液剂几乎无细胞毒性，CTX溶液剂以及PPa和CTX的混合溶液剂表现出一定的细胞毒性，CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒细胞毒性相对CTX溶液剂较弱些。然而，结合激光照射后，CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒细胞毒性明显增强，表现出几乎与PPa和CTX的溶液剂相近的细胞毒性，论证了纳米粒增强激活和光动协同的细胞毒性。
[0105] 采用人类正常肝(LO2)细胞用于考察CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒的安全性。将状态良好的LO2细胞消化，用培养液稀释至5000个细胞/毫升的细胞密度，吹匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液100μL，置培养箱中孵育24h使其贴壁。待细胞贴壁后加PPa溶液剂或实施例2中制备的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒，本实验中药物溶液与纳米粒制剂的配制和稀释均用1640培养液，并用0.22μm滤膜无菌过滤。受试溶液每孔加入100μL，每个浓度3个平行孔。对照组，即不加待测药液，单一补加100μL培养液，置培养箱中和细胞共同孵育48小时。将96孔板取出，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，置培养箱中孵育4小时后甩板，将96孔板倒扣于滤纸上充分吸干残留液体后，每孔加入200μL DMSO于振荡器上振荡10min以溶解蓝紫色结晶物。设定A1孔(只含有200μL DMSO)为调零孔。使用酶标仪在570nm处测定各孔调零后的吸光度值。
[0106] 结果如图18所示，CTX溶液剂表现出较强的毒性，而CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒表现出可忽略的细胞毒性，证明了CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒具有一定的选择性，对正常的细胞毒性小，在肿瘤细胞中具有高效的细胞毒性。
[0107] 实施例10：纳米粒的药代动力学研究
[0108] 取体重在200‑250g之间的SD大鼠，随机分组，给药前禁食12h，自由饮水。分别静脉注射PPa溶液剂以及实施例2制备的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒，二者PPa给药剂量均为2mg/kg，于规定的时间点眼眶取血，分离获得血浆。之后通过超声破碎、离心和沉淀蛋白法提取PPa,最后用varioskan lux多模式酶标仪(激发415nm，发射675nm)分析细胞对各种制剂的摄取情况。
[0109] 实验结果如图19所示，由于半衰期短，PPa溶液剂实验组的PPa从血液中清除速度较快。相比于PPa溶液剂，CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒的循环时间明显延长，明显提高了PPa的AUC，为药物在体内肿瘤的蓄积提高了很好基础。
[0110] 实施例11：纳米粒的组织分布实验
[0111] 将4T1细胞悬液接种于BALB/c小鼠，当肿瘤体积达到400mm3时，尾静脉注射给药：PPa溶液剂和CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒，二者PPa给药剂量均为2mg/kg，4小时、12小时和24小时后，将小鼠处死，分离出主要器官(心，肝，脾，肺，肾)和肿瘤，用活体成像仪进行分析。
[0112] 结果如图20‑23所示，与PPa溶液剂相比，CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒组在肿瘤组织的荧光强度显著增加。且在12小时达到最大蓄积。这一结果与其药代动力学行为完全一致，CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒稳定性最好，体内循环时间最长，因此表现出最好的肿瘤蓄积能力。
[0113] 实施例12：纳米粒的在体抗肿瘤实验
[0114] 将4T1细胞悬液(5x106 cells/100μL)接种于雌性小鼠腹侧皮下。待肿瘤体积生长3
至150mm时，将小鼠随机分组，每组五只,分别给与生理盐水、PPa溶液剂+激光、CTX溶液剂、CTX和PPa的混合溶液剂、CTX和PPa的混合溶液剂+激光、实施例2制备的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒和CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒+激光。每隔1天给药1次，连续给药5次，按PPa计算，给药剂量为3mg/kg(等量的CTX)。溶液剂光照组在给药4小时后给与激光光照，纳米粒组在给药后12小时给与激光光照，每天观察小鼠的存活状态，称体重，测量肿瘤体积。最后一次给药后，间隔3天后将小鼠处死，获取器官和肿瘤，进一步分析评价。收集主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺，肾脏)和肿瘤组织并用4％组织固定液固定用于H&E染色。
至150mm时，将小鼠随机分组，每组五只,分别给与生理盐水、PPa溶液剂+激光、CTX溶液剂、CTX和PPa的混合溶液剂、CTX和PPa的混合溶液剂+激光、实施例2制备的CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒和CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒+激光。每隔1天给药1次，连续给药5次，按PPa计算，给药剂量为3mg/kg(等量的CTX)。溶液剂光照组在给药4小时后给与激光光照，纳米粒组在给药后12小时给与激光光照，每天观察小鼠的存活状态，称体重，测量肿瘤体积。最后一次给药后，间隔3天后将小鼠处死，获取器官和肿瘤，进一步分析评价。收集主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺，肾脏)和肿瘤组织并用4％组织固定液固定用于H&E染色。
[0115] 实验结果如图24所示，与生理盐水组相比，PPa溶液剂表现出一定的肿瘤抑制活性。CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒表现出比CTX和PPa的混合溶液剂更强的抗肿瘤活性，肿瘤体积增长缓慢。正如预期，CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒并给与激光的治疗组抗肿瘤效果最为明显，有效的抑制了肿瘤增长，治疗后期，肿瘤体积甚至出现了下降的趋势。结果表明纳米粒的稳定性、细胞毒性、药动学、组织分布均会影响最终的抗肿瘤效果。
[0116] 如图25所示，各实验组小体重没有明显变化。从图26和27可知，各组小鼠的主要脏器功能无明显异常，这些结果说明CTX‑S‑CTX/PPa/DSPE‑PEG2K纳米粒在具有明显的抗肿瘤效果的同时，没有对机体造成显著的非特异性毒性，是安全有效的抗癌药物传递系统。
[0117] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。