一株奈替米星和西索米星单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

摘要

一株奈替米星和西索米星单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明公开了一株奈替米星和西索米星单克隆抗体杂交瘤细胞株HLQ 3C9，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCC No.20788。本发明将奈替米星的完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化，通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。将高效价，低IC50小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，筛选出融合后的杂交细胞；经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并三次亚克隆，最终得到一株单克隆抗体杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对奈替米星和西索米星均具有较好的特异性和检测灵敏度，为食品中奈替米星和西索米星残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

权利要求

1.一株奈替米星和西索米星单克隆抗体杂交瘤细胞株HLQ 3C9，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCC No.20788。

2.一种奈替米星和西索米星单克隆抗体，其特征在于：其由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.20788的杂交瘤细胞株HLQ 3C9分泌产生。

3.权利要求2所述奈替米星和西索米星单克隆抗体的应用，其特征在于：将其应用于食品安全免疫检测中奈替米星和西索米星残留量的检测。

4.根据权利要求3所述奈替米星和西索米星单克隆抗体的应用，其特征在于：具体应用于牛奶、肌肉组织和尿液中奈替米星和西索米星残留量的检测。

说明书

一株奈替米星和西索米星单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株奈替米星和西索米星单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术

[0002] 奈替米星(Netilmicin，NTM)是以西索米星(Sisomicin，SSM)为原料合成的一种氨基糖苷类广谱抗生素，具有与庆大霉素类似的抗菌谱和临床疗效。它具有对氨基糖苷乙酰转移酶AAC(3)稳定的特点，对大多数革兰氏阴性细菌和许多革兰氏阳性细菌包括金黄色葡萄球菌特别有效，对其他氨基糖苷类药物如庆大霉素、西索米星和妥布霉素耐药菌株均有活性，其耳毒性和肾毒性均低于其他氨基糖苷类药物。它是治疗严重细菌感染的一线抗菌药物之一，常用于呼吸系统感染、皮肤软组织感染、泌尿系统感染、创面感染、骨关节感染、产后感染、胃肠道及胆道感染、败血症等。然而，与其他氨基糖苷类一样，奈替米星的治疗指数相对较窄，并且很难被机体代谢掉，而西索米星有耳毒性和肾毒性，过量使用或长时间低剂量接触会危害人体健康。因此，有必要对该药物在血清和尿液中进行监测，以避免毒性，并优化抗生素剂量。

[0003] 此外，奈替米星和西索米星还被用作添加剂和兽药用于畜牧业中动物疾病的预防和治疗，而人类通过饮食长时间暴露这些药物，也会对身体健康造成伤害。我国农业部第560号公告规定废止兽药硫酸奈替米星，这对奈替米星和西索米星的检测提出了要求。由于奈替米星和西索米星的极性碱性和缺乏强烈的吸收紫外线的发色团，想直接分析并不简单。目前，除了美国药典和欧洲药典推荐的微生物法，近年来也开发了以液相色谱为主的仪器检测方法，但这些方法较为专业性高、耗时长和成本高。随着近年来免疫分析技术的快速发展，建立一种针对NTM和SSM的高效、快速的免疫检测方法成为可能，包括酶联免疫法(ELISA)、胶体金免疫层析试纸条技术和免疫磁珠技术等。而这些方法建立的一个重要前提即需筛选出针对奈替米星和西索米星的高特异性单克隆单体。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一株奈替米星和西索米星单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的抗体对奈替米星和西索米星具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立奈替米星和西索米星的免疫学检测方法。

[0005] 本发明的技术方案如下：一株奈替米星和西索米星单克隆抗体杂交瘤细胞株HLQ 3C9，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCC No.20788。

[0006] 一种奈替米星和西索米星单克隆抗体，其由所述保藏编号为CGMCC No.20788的杂交瘤细胞株HLQ 3C9分泌产生。

[0007] 奈替米星人工抗原﹙半抗原﹚，分子式如下：

[0008] 简称NTM‑1。

[0009] 奈替米星人工抗原的制备方法，将西索米星先乙酰化制得三乙酰西索米星，再进行三甲基硅烷化保护羟基，然后与4‑溴丁酸乙酯反应，最后碱水解、分离纯化制备得到奈替米星人工抗原。

[0010] 合成路线如下：

[0011]

[0012] 具体步骤为：

[0013] (1)将硫酸西索米星添加到含有醋酸铜的DMF水溶液中，用三乙胺调整溶液体系的pH；将溶液体系冷却后，在高速搅拌下将用DMF稀释的乙酸酐缓慢滴加到上述体系中，并维持温度和pH；反应后，通过减压蒸馏将溶剂尽量蒸出，浓缩后的溶液用水稀释，然后在低温下静置，过滤分离出固形物，液体用离子交换树脂进行再一次纯化，冷冻干燥得黄色粉末中间产物①；

[0014] (2)称取中间产物①溶于二甲醚中，再加入三甲基氯硅烷，保持磁力搅拌，恒温水浴反应；最后对溶液进行减压蒸馏，得黄色固体中间产物②；

[0015] (3)称取中间产物②溶于丙酮中，加入K2CO3和4‑溴丁酸乙酯，保持磁力搅拌，在冷凝回流装置中恒温水浴反应；最后对溶液进行减压蒸馏，得黄色固体中间产物③；

[0016] (4)将中间产物③加入到NaOH和Na2CO3溶液中，保持磁力搅拌，在冷凝回流装置中油浴恒温回流，然后降温，加H2SO4调节pH，抽滤收集澄清溶液，将溶液加入阳离子交换树脂，过滤后用氨水洗脱，洗脱液浓缩后用甲醇溶解，上硅胶柱，用氯仿‑甲醇‑氨水配置的洗脱液洗脱分离；收集的洗脱液减压蒸馏，留下的馏后物冷冻干燥后得到目标产物NTM‑1。

[0017] 进一步，具体步骤为：

[0018] (1)将1mM硫酸西索米星添加到40mL含有0.2Mm醋酸铜的DMF水溶液；其中，DMF：水体积比为6:2；用三乙胺维持溶液体系的pH在8.5‑10.5；将溶液体系冷却到5℃后，在高速搅拌下将0.33mL用DMF稀释的含有3.5mM乙酸酐的溶液缓慢滴加到上述体系中，并维持温度在0‑10℃，pH在8.5‑10.5，反应4h；随后通过减压蒸馏将溶剂蒸出，浓缩后的溶液用水稀释到
10mL，然后在0‑10℃环境下静置4h，过滤分离出固形物，液体用离子交换树脂进行再一次纯化，冷冻干燥得黄色粉末中间产物①；

[0019] (2)称取中间产物①0.8mM溶于20mL二甲醚DME中，再加入3.2mmol三甲基氯硅烷，保持磁力搅拌，在冷凝回流装置中50℃恒温水浴反应16h，最后对溶液进行减压蒸馏，得黄色固体中间产物②；

[0020] (3)称取0.6mM中间产物②溶于20mL丙酮中，加入600mg K2CO3和1.0mM 4‑溴丁酸乙酯，保持磁力搅拌，在冷凝回流装置中50℃恒温水浴反应24h；最后对溶液进行减压蒸馏，得黄色固体中间产物③；

[0021] (4)将中间产物③加入到10mL含有0.1M NaOH和0.05M Na2CO3的水溶液中，保持磁力搅拌，在冷凝回流装置中110℃油浴恒温回流24h，然后降温至10‑15℃,加1M H2SO4调至pH至6.5～7.0，抽滤收集澄清溶液，将溶液加入阳离子交换树脂；过滤后用体积浓度7％的氨水洗脱，洗脱液浓缩后用甲醇溶解，再上硅胶柱，用氯仿∶甲醇∶氨水按照体积比40∶20∶7配置洗脱液，洗脱分离；收集的洗脱液减压蒸馏，留下的馏后物冷冻干燥后得到目标产物奈替米星人工抗原NTM‑1。

[0022] 奈替米星完全抗原的制备方法，称取奈替米星人工抗原NTM‑1溶解于N,N‑二甲基甲酰胺DMF中，然后加入N‑羟基琥珀酰亚胺NHS，保持磁力搅拌反应，再加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，继续保持室温搅拌反应；上述反应完成后，将得到的活化液逐滴缓慢滴加到溶解于碳酸盐缓冲溶液的BSA溶液中，继续保持室温搅拌反应过夜；最后，用磷酸盐缓冲溶液溶液透析，除去未参与反应的小分子，得到完全抗原NTM‑1‑EDC‑BSA，并通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行鉴定。

[0023] 进一步地，称取7.1mg奈替米星人工抗原NTM‑1溶解于700μL的N,N‑二甲基甲酰胺DMF中，然后加入4.6mg的N‑羟基琥珀酰亚胺NHS，保持磁力搅拌反应15min，再加入7.6mg的1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，继续保持室温搅拌反应4h；上述反应完成后，将得到的活化液逐滴缓慢滴加到溶解有10mg BSA的2mL、pH＝9.0的碳酸盐缓冲溶液CB中；继续保持室温搅拌反应过夜；最后，用0.01M、pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液PBS溶液透析，除去未参与反应的小分子，得到奈替米星完全抗原NTM‑1‑EDC‑BSA。

[0024] 奈替米星和西索米星单克隆抗体的应用，将其应用于食品安全免疫检测中奈替米星和西索米星残留量的检测。

[0025] 进一步地，具体应用于牛奶、肌肉组织和尿液中奈替米星和西索米星残留量的检测。

[0026] 本发明提供的奈替米星和西索米星单克隆抗体杂交瘤细胞株HLQ 3C9的制备基本步骤为：

[0027] (1)小鼠的免疫：将奈替米星完全抗原NTM‑1‑EDC‑BSA(2mg/mL)与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)。首次免疫用弗氏完全佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用弗氏不完全佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18‑21天。通过尾部采血，用间接竞争酶联免疫法(ic‑ELISA)对小鼠免疫效果进行测试。通过评估其效价和抑制，选出效果最好的一只小鼠用于细胞融合；

[0028] (2)细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(PEG 4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择性培养基(HAT培养基)筛选出杂交瘤细胞，并用HT培养基进行细胞培养。融合一周后利用ic‑ELISA法检测阳性细胞孔，并进一步利用ic‑ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对抑制较好的阳性细胞孔进行亚克隆，一周后再次检测、挑孔、亚克隆。按上述方法进行三次亚克隆后获得NTM的高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株HLQ 3C9；

[0029] (3)杂交瘤细胞株HLQ 3C9性质的鉴定：通过ic‑ELISA测定灵敏度和特异性。

[0030] 本发明的有益效果：本发明提供的细胞株HLQ 3C9分泌的单克隆抗体，对NTM和SSM均具有较好的特异性和检测灵敏度(检测奈替米星的IC50值为0.18ng/mL，检测西索米星的IC50值为0.22ng/mL)，可实现对牛奶、肌肉组织和尿液中奈替米星和西索米星残留量的检测，为食品中NTM和SSM残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

[0031] 生物材料样品保藏：一株奈替米星和西索米星单克隆抗体杂交瘤细胞株HLQ 3C9，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCC No.20788。

附图说明

[0032] 图1HLQ 3C9单克隆抗体对奈替米星(NTM)的抑制标准曲线。

[0033] 图2HLQ 3C9单克隆抗体对西索米星(SSM)的抑制标准曲线。

具体实施方式

[0034] 本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

[0035] 本发明通过将奈替米星完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic‑ELISA筛选细胞上清，最终得到了针对奈替米星和西索米星具有高分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。

[0036] 实施例1奈替米星人工抗原的制备

[0037] 合成路线如说明书中所示；具体步骤如下：

[0038] (1)将1mM硫酸西索米星添加到40mL含有0.2Mm醋酸铜的DMF水溶液；其中，DMF：水体积比为6:2；用三乙胺维持溶液体系的pH在8.5‑10.5；将溶液体系冷却到5℃后，在高速搅拌下将0.33mL用DMF稀释的含有3.5mM乙酸酐的溶液缓慢滴加到上述体系中，并维持温度在0‑10℃，pH在8.5‑10.5，反应4h；随后通过减压蒸馏将溶剂蒸出，浓缩后的溶液用水稀释到
10mL，然后在0‑10℃环境下静置4h，过滤分离出固形物，液体用离子交换树脂进行再一次纯化，冷冻干燥得黄色粉末中间产物①；

[0039] (2)称取中间产物①0.8mM溶于20mL二甲醚DME中，再加入3.2mmol三甲基氯硅烷，保持磁力搅拌，在冷凝回流装置中50℃恒温水浴反应16h，最后对溶液进行减压蒸馏，得黄色固体中间产物②；

[0040] (3)称取0.6mM中间产物②溶于20mL丙酮中，加入600mg K2CO3和1.0mM 4‑溴丁酸乙酯，保持磁力搅拌，在冷凝回流装置中50℃恒温水浴反应24h；最后对溶液进行减压蒸馏，得黄色固体中间产物③；

[0041] (4)将中间产物③加入到10mL含有0.1M NaOH和0.05M Na2CO3的水溶液中，保持磁力搅拌，在冷凝回流装置中110℃油浴恒温回流24h，然后降温至10‑15℃,加1M H2SO4调至pH至6.5～7.0，抽滤收集澄清溶液，将溶液加入阳离子交换树脂；过滤后用体积浓度7％的氨水洗脱，洗脱液浓缩后用甲醇溶解，再上硅胶柱，用氯仿∶甲醇∶氨水按照体积比40∶20∶7配置洗脱液，洗脱分离；收集的洗脱液减压蒸馏，留下的馏后物冷冻干燥后得到目标产物奈替米星人工抗原NTM‑1。

[0042] 实施例2奈替米星完全抗原NTM‑1‑EDC‑BSA的制备

[0043] 称取7.1mg奈替米星人工抗原NTM‑1溶解于700μL的N,N‑二甲基甲酰胺DMF中，然后加入4.6mg的N‑羟基琥珀酰亚胺NHS，保持磁力搅拌反应15min，再加入7.6mg的1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，继续保持室温搅拌反应4h；上述反应完成后，将得到的活化液逐滴缓慢滴加到溶解有10mg BSA的2mL、pH＝9.0的碳酸盐缓冲溶液CB中；继续保持室温搅拌反应过夜；最后，用0.01M、pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液PBS溶液透析，除去未参与反应的小分子，得到奈替米星完全抗原NTM‑1‑EDC‑BSA。

[0044] 实施例3杂交瘤细胞株HLQ 3C9的制备

[0045] (1)小鼠免疫：将NTM‑1‑EDC‑BSA完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18‑21天。通过尾部采血，用间接竞争酶联免疫法(ic‑ELISA)对小鼠免疫效果进行测试。通过评估其效价和抑制，选出效果最好的一只小鼠用于细胞融合。

[0046] (2)细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：

[0047] a、小鼠摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中浸泡消毒5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心(800rpm，6min)，用RPMI‑1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

[0048] b、收集SP2/0细胞：融合前7‑10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)的7
RPMI‑1640培养基在5％CO2培养箱中培养。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到﹙1～4﹚×10 ，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI‑1640基础培养液中，进行细胞计数；

[0049] c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，分别在1min内滴加1mL RPMI‑1640培养基；第5min和第6min，分别在1min内滴加2mL RPMI‑1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI‑1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm，10min)，弃上清，细胞轻轻敲散，并向其内加入含20％胎牛血清、2％
50×HAT的RPMI‑1640选择性培养基(HAT培养基)，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。

[0050] (3)细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合后的第3天用HAT培养基对融合细胞进行半换液；第5天用含20％胎牛血清、1％的100×HT的RPMI‑1640过渡培养液(HT培养基)进行全换液；第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic‑ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用奈替米星和西索米星为标准品，用ic‑ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对奈替米星和西索米星标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。按上述方法进行三次亚克隆，最终获得奈替米星和西索米星单克隆抗体细胞株HLQ 3C9。

[0051] (4)单克隆抗体的制备与鉴定：取8‑10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石6
蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸‑饱和硫酸铵法进行抗体纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液(pH7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于‑20℃保存。

[0052] 4.1包被：将包被原NTM‑1‑EDC‑OVA用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液从1μg/mL开始3倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；

[0053] 4.2洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；

[0054] 4.3封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；

[0055] 4.4加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP‑羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min；

[0056] 4.5显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；

[0057] 4.6终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD 450值。

[0058] 用ic‑ELISA测定单克隆抗体对奈替米星的IC50为0.18ng/mL，该单抗对西索米星的IC50为0.22ng/mL，说明对奈替米星和西索米星有很好的灵敏度，可用于奈替米星和西索米星免疫分析检测。

[0059] 溶液的配置：

[0060] 碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

[0061] 磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

[0062] PBST：含0.05％吐温20的PBS；

[0063] TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比5：1混合即为TMB显色液，现用现混。