金硫化银蛋白复合水凝胶及其制备方法与应用转让专利
申请号 : CN202110255075.4
文献号 : CN113144191B
文献日 : 2022-04-08
发明人 : 刘凯 , 张洪杰
申请人 : 清华大学
摘要 :
权利要求 :
1.金硫化银蛋白复合水凝胶,其原料包括:类弹性蛋白‑绿色荧光蛋白复合蛋白、Ag3AuS2 NPs和壳聚糖;其中,所述类弹性蛋白‑绿色荧光蛋白复合蛋白、Ag3AuS2 NPs与壳聚糖的质量比为20:1:10;
所述类弹性蛋白‑绿色荧光蛋白复合蛋白的质量分数为0.1% 10%;
~
所述Ag3AuS2 NPs的质量分数为0.1%~10%;
所述壳聚糖的质量分数为0.1% 10%;
~
所述类弹性蛋白的氨基酸序列为(VPGEG)n、(VPGDG)n、(VPGKG)n或(VPGRG)n,n=50~100。
2.根据权利要求1所述的金硫化银蛋白复合水凝胶,其特征在于,其中,壳聚糖带正电荷,Ag3AuS2 NPs带正电荷,类弹性蛋白‑绿色荧光蛋白复合蛋白带负电荷。
3.根据权利要求1或2所述的金硫化银蛋白复合水凝胶,其特征在于,类弹性蛋白‑绿色荧光蛋白复合蛋白为(VPGEG)72‑GFP。
4.根据权利要求3所述的金硫化银蛋白复合水凝胶,其特征在于,其中, (VPGEG)72‑GFP的质量分数为4 %,Ag3AuS2 NPs的质量分数为0.2 %,壳聚糖的质量分数为2%。
5.权利要求1 4任一项所述金硫化银蛋白复合水凝胶的制备方法,其特征在于,包括:~
将壳聚糖溶于乙酸水溶液中,得到壳聚糖溶液;
将类弹性蛋白‑绿色荧光蛋白复合蛋白溶于去离子水中,然后以EDC、NHS活化复合蛋白的羧基,获得活化蛋白溶液;
将Ag3AuS2 NPs与壳聚糖溶液混合后与活化蛋白溶液混合,55~65℃搅拌反应10~20min,获得金硫化银蛋白复合水凝胶。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述Ag3AuS2 NPs的制备方法包括:将HAuCl4•4H2O 与AgNO3 分散在油酸与油胺混合液中,55℃ 搅拌反应20h,加入含硫的油胺溶液,再经55℃ 搅拌反应2h,制备得到表面修饰油酸油胺配体的Ag3AuS2纳米颗粒;
用氯仿重悬表面修饰油酸油胺配体的Ag3AuS2 纳米颗粒,然后与CTAB水溶液混合,50℃ 搅拌反应3h,而后洗涤得到带正电荷的Ag3AuS2 NPs。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述壳聚糖溶液中乙酸的体积分数为1%,壳聚糖的质量分数为3%;
所述类弹性蛋白‑绿色荧光蛋白复合蛋白溶于去离子水至质量分数为13%;
所述Ag3AuS2 NPs与壳聚糖的质量比为1:10;
所述壳聚糖溶液与活化蛋白溶液的体积比为2:1。
8.权利要求1 4任一项所述的金硫化银蛋白复合水凝胶或权利要求5 7任一项所述制~ ~
备方法制得的金硫化银蛋白复合水凝胶在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
9.一种治疗肿瘤的光敏剂,其特征在于,包含权利要求1 4任一项所述的金硫化银蛋白~
复合水凝胶,或权利要求5 7任一项所述制备方法制得的金硫化银蛋白复合水凝胶。
~
说明书 :
金硫化银蛋白复合水凝胶及其制备方法与应用
技术领域
背景技术
的恶性肿瘤,恶性程度高,转移率高。目前舌癌的治疗是以手术为基础的综合治疗,包括放
疗和化疗。然而,当肿瘤侵犯较深时,常需要进行半舌或全舌切除术,严重破坏运动、感觉和
语言功能。化疗对全身治疗有效,但对局部治疗效果有限。局部放疗还会引起炎症以及对口
腔周围神经的损伤等副作用。虽然手术技术和辅助治疗不断提高,但由于手术难度和治疗
不敏感,目前舌癌患者的5年生存率仍为6.6%‑11.7%。因此,建立一种既能抑制肿瘤增殖,
又能减少对头颈部瘤旁重要的神经、血管等造成副损伤的有效、精确的非手术治疗策略尤
其具有临床应用意义。
晚期肿瘤生存质量和延长生存期的目的,同时对早期肿瘤实现根治。PTT本身几乎无毒,其
主要缺点是生物相容性差,光热转化率低,以及光热剂(PTAs)带来的长期毒性问题。其中,
有机光热材料具有良好的生物降解性,但光漂白性能不利于其光热转换。传统的静脉给药
治疗减少了PTAs的积累,减弱了肿瘤部位的光热效应。特别是由于体液循环引起的多次给
药常引起耐药性。因此,开发具有原位植入和充分治疗效果的新型PTAs具有重要意义。
发明内容
(200‑400mPa·s)。
荷的金硫化银异质纳米颗粒;所述带正电荷的金硫化银异质纳米颗粒为Ag3AuS2NPs。
性、高效光热治疗效果及生物相容性的水凝胶材料,光热效率可达到39.0%。通过瘤旁注射
的方式将其均匀分散在肿瘤的周围,然后经照射产生光热转换,实现肿瘤的有效杀灭,减少
肿瘤复发。此外,凝胶具有高生物相容性,且能够减缓纳米颗粒在体内的代谢。本研究放眼
于舌相关肿瘤的光热治疗,与其他同类型光热材料相比,不但拥有较高的光热转换效率,还
具有较高的生物相容性、缓慢代谢作用从而稳定发挥其治疗功效。这种一举两得的治疗策
略将为临床舌相关恶性肿瘤非手术治疗提供新的思路。
附图说明
具体实施方式
领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经
通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文
的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
硫化银异质纳米颗粒(Ag3AuS2NPs)。具体的本发明中,该水凝胶由带负电荷的类弹性蛋白‑
绿色荧光蛋白复合蛋白——(VPGEG)72‑GFP和带正电荷的金硫化银异质纳米颗粒
(Ag3AuS2NPs),以及带正电荷的壳聚糖(CS)。
PGA起到了同样的作用,即都作为负电荷的提供者。但由于分子量和电荷密度的不同,导致
水凝胶具有不同的性质。所产生的PAA‑壳聚糖水凝胶是呈泡沫塑料状的;而γ‑PGA‑壳聚糖
水凝胶是果冻状的,且容易破碎。更重要的是,这两种凝胶都不适于注射。而用类弹性蛋白
合成的水凝胶则具有剪切减薄的特性,更均匀、粘度低、可注射。
Gly‑Xaa‑Gly,VPGXG)构成,将第四位氨基酸X选取为谷氨酸E或天冬氨酸D,使其带有高电荷
密度的负电荷,从而便于与带有大量氨基的壳聚糖进行化学交联形成凝胶。另外,也可以将
四号氨基酸X选取为赖氨酸K或精氨酸R,使其带有高电荷密度的正电荷,从而便于与带有大
量羧基等负电的聚糖进行化学交联形成凝胶。研究表明,虽然形成的凝胶的理化形式相似,
但相对于其他复合蛋白(Xaa被替换为其他氨基酸,或者是不同的重复序列单元数量),
(VPGEG)72‑GFP的抗肿瘤效果更具优势。
著提高产物蛋白的产率与纯化效率。此外,其他荧光蛋白也具有相似功能。本发明通过实验
表明,符合蛋白中GFP的添加并不会影响效果抗肿瘤效果。并且GFP作为一种分子伴侣,有助
于提高工程蛋白的表达量。通过对GFP和阴离子多肽进行融合重组,提高了蛋白质实体的产
量。同时,(VPGEG)72蛋白的低免疫原性、电负性和生物相容性均不受影响。
EDC/NHS反应是最常用的生物偶联反应之一,用于偶联羧基与氨基形成酰胺键。
液而无法形成凝胶;用量过大,则溶解不完全,产物凝胶不均匀。光热材料的用量也会影响
光热治疗的效果,光热材料用量不足则无法产生足够的光热能量转换,因而无法实现肿瘤
细胞的有效杀伤。光热材料和基元间的比例也需要控制在一定范围内,以保证光热材料通
过静电作用被有效结合在凝胶内,且不发生聚集或泄露。此外,反应温度、反应时间对凝胶
产物的生成也有一定影响,优选条件为反应温度控制在60℃左右,反应时间15min。反应温
度低(如室温),则反应难以进行,无法形成凝胶。反应温度过高,则凝胶生成过快,难以控制
光热材料在其中均匀分散。相对来说,试剂用量对光热凝胶制备的影响更明显也更重要。
Ag3AuS2NPs静电作用实现NPs的负载,形成具金硫化银蛋白复合光热水凝胶((VPGEG)72‑
GFP‑Chitosan‑Ag3AuS2)。
正电荷的Ag3AuS2NPs。
肠杆菌作为宿主菌。其表达载体的骨架载体为pET25b。经该体系表达获得的(VPGEG)72‑GFP
蛋白的末端还连接有6×His标签。具体的,(VPGEG)72‑GFP的氨基酸序列为MVSKGEELFTGVVP
ILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMP
EGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNF
KIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKELG
VVGLVPRGSHMGAGPGVGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGVGVPGEGVPG
EGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGVGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGE
GVPGEGVPGEGVPGVGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGVGVPGEGVPGEG
VPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGVGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGV
PGEGVPGEGVPGVGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGVGVPGEGVPGEGVP
GEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGEGVPGWPHHHHHH。
治性治疗。可注射高生物相容性的金硫化银蛋白复合光热水凝胶经局部注射到肿瘤附近
后,结合近红外光照可以精准且可控的完全杀灭癌细胞,且无复发。且由于凝胶对热量散射
的阻隔,不但在肿瘤部位快速积聚了足以杀灭肿瘤的热量,同时对临近的正常组织起到了
保护作用。光热治疗的同时,并未对瘤旁重要的神经、血管等造成副损伤。
效率(在低功率激光照射下三分钟内温度达到55℃),从而有效溶解细胞膜并使蛋白变性,
致使肿瘤细胞直接死亡或凋亡。
组织的毒副作用。
光热治疗效果及生物相容性的水凝胶材料,具有39%的光热转换效果。经局部注射至瘤旁
后,结合高组织穿透能力的近红外光,实现舌癌的精准、可控治疗。采用凝胶作为负载基体,
可以提高光热纳米材料的生物相容性,还可以减缓纳米粒子在体内的降解,从而有效地杀
灭肿瘤,减少肿瘤复发。从实验结果上看,不但对舌癌起到了近乎根治的效果,同时并未对
舌体周围脉管及神经造成副损伤,这为临床舌癌光疗提供了新的思路及可借鉴办法。
菌株。
白。
20mL油胺,升温至55℃,搅拌20h。取25mg升华硫加入10mL油胺中,超声混匀后,加入到上述
溶液中,55℃搅拌2h。乙醇洗3次,最后获得的异质结构的金硫化银纳米材料(Ag3AuS2NPs)分
散在5mL氯仿中。
拌至CTAB溶解。将5mLAg3AuS2NPs氯仿溶液加入CTAB溶液中,敞口50℃搅拌3h。经水洗涤3次
后,分散在1mL去离子水中。
由于带有高密度的氨基,所以保证了纳米材料在水溶液中带有正电荷。经透射电镜显示
Ag3AuS2NPs的尺寸约12nm。经电感耦合等离子体发射光谱仪测定每1mg异质结构Ag3AuS2NPs
中,含有Au 201.4μg。
于下一步与壳聚糖的氨基基团进行化学交联。
确保其稳定发挥治疗功效。
的温度。此外,由于水分子在凝胶骨架中被限定,因此发热非常局限,从而避免了体内应用
时对临近非照射部位的损伤。
果。
‑2
受单次激光照射(808nm激光,1.0W·cm ,持续3分钟)后所采集的图片。,相比对照组,凝胶
组对舌根部舌癌起到了良好的杀伤效果,未造成局部的异常肿胀。肿瘤在治疗后瘤体逐渐
萎缩,最终完全消失。
本发明的保护范围。