一种抗PD-L1人源化单克隆抗体及其应用

摘要

本发明涉及免疫学和抗体工程技术领域，具体涉及一种抗PD‑L1人源化单克隆抗体及其应用。所述抗体的重链可变区的CDR‑H1为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，CDR‑H2为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和CDR‑H3为SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列；以及所述抗体的轻链可变区的CDR‑L1为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，CDR‑L2为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，和CDR‑L3为SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。本发明提供的抗PD‑L1单克隆抗体具有全新序列，能够特异性结合人PD‑L1蛋白，具有高亲和力，使免疫细胞特异性识别并杀死癌细胞，达到癌症治疗的目的，且该抗体分子细胞水平表现不低于目前在售产品。

权利要求

1.一种抗PD‑L1人源化单克隆抗体，其特征在于：所述抗体的重链可变区的CDR‑H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，CDR‑H2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，和CDR‑H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；以及所述抗体的轻链可变区的CDR‑L1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，CDR‑L2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，和CDR‑L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:

6所示。

2.根据权利要求1所述的一种抗PD‑L1人源化单克隆抗体，其特征在于：所述抗体的重链可变区的CDR‑H1的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，CDR‑H2的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，和CDR‑H3的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；以及所述抗体的轻链可变区的CDR‑L1的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，CDR‑L2的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，和CDR‑L3的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

3.根据权利要求1所述的一种抗PD‑L1人源化单克隆抗体，其特征在于：所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。

4.根据权利要求1所述的一种抗PD‑L1人源化单克隆抗体，其特征在于：所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。

5.根据权利要求2所述的一种抗PD‑L1人源化单克隆抗体，其特征在于：所述抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。

6.根据权利要求2所述的一种抗PD‑L1人源化单克隆抗体，其特征在于：所述抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。

7.一种药物组合物，其特征在于：该组合物含有权利要求1 6任一项所述的抗体和药物~

学上可接受的载体。

8.权利要求1 6任一项所述的抗体在制备治疗由PD‑L1介导的癌症药物中的应用。

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说明书

一种抗PD‑L1人源化单克隆抗体及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及免疫学和抗体工程技术领域，具体涉及一种抗PD‑L1人源化单克隆抗体及其应用。

背景技术

[0002] PD‑L1，英文全名programmed cell death‑Ligand 1，又称细胞程式死亡‑配体1。PD‑L1蛋白正是PD‑1的配体，与免疫系统的抑制有关，可以传导抑制性的信号。PD‑1和PD‑L1
一旦结合便会向T细胞传递一种负向调控信号，诱导T细胞进入静息状态，减低淋巴结CD8+T
细胞的增生，让其无法识别癌细胞，并且使T细胞自身增殖减少或凋亡，有效解除机体的免
疫反应，因此癌细胞可以肆无忌惮地生长了。本发明提供的抗PD‑L1抗体，可以与PD‑1蛋白
结合，激活T细胞识别并杀死癌细胞。

发明内容

[0003] 本发明提供一种抗PD‑L1单克隆抗体及其制备方法，该抗PD‑L1单克隆抗体具有全新序列，能够特异性结合PD‑1蛋白，使免疫细胞特异性识别并杀死癌细胞，达到癌症治疗的
目的。

[0004] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0005] 一种抗PD‑L1人源化单克隆抗体，所述抗体的重链可变区的CDR‑H1为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，CDR‑H2为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和CDR‑H3为SEQ ID NO:3所
示的氨基酸序列；以及所述抗体的轻链可变区的CDR‑L1为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，
CDR‑L2为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，和CDR‑L3为SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

[0006] 优选的，所述抗体的重链可变区的CDR‑H1为SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，CDR‑H2为SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，和CDR‑H3为SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；以及所
述抗体的轻链可变区的CDR‑L1为SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，CDR‑L2为SEQ ID NO:11
所示的核苷酸序列，和CDR‑L3为SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。

[0007] 优选的，所述抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。

[0008] 优选的，所述抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。

[0009] 优选的，所述抗体的重链核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。

[0010] 优选的，所述抗体的轻链核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。

[0011] 本发明还保护一种药物组合物，该组合物含有上述的抗体和药物学上可接受的载体。

[0012] 本发明还保护上述的抗体在制药中的应用。

[0013] 本发明还保护上述的抗体在制备治疗癌症药物中的应用。

[0014] 本发明的有益效果在于：

[0015] 本发明提供的抗PD‑L1单克隆抗体具有全新序列，能够特异性结合人PD‑L1蛋白，具有高亲和力，使免疫细胞特异性识别并杀死癌细胞，达到癌症治疗的目的，且该抗体分子
细胞水平表现不低于目前在售产品。

附图说明

[0016] 图1为人源化抗体SA126‑C9诱导T细胞分泌IL2结果；

[0017] 图2为人源化抗体SA126‑C9诱导T细胞分泌IFN‑γ结果；

[0018] 图3为SA126‑C9‑hIgG1、SA126‑G7‑hIgG1抗体与人PD‑L1抗原的结合活性图；

[0019] 图4为SA126‑C9‑hIgG1、SA126‑G7‑hIgG1抗体与猴PD‑L1抗原的结合活性图；

[0020] 图5为SA126‑C9‑hIgG1、SA126‑G7‑hIgG1抗体与鼠PD‑L1抗原的结合活性图。

具体实施方式

[0021] 为更好理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。

[0022] 以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。

[0023] 实施例1：PD‑L1抗原的制备

[0024] 市场购买人肿瘤PD‑L1的cDNA。在合成的胞外区PD‑L1基因后加上人源IgG1 Fc标签，并在两端引入Xba I，Bam H I两个限制性酶切位点连接到pTT5表达质粒，经测序验证正
确。测序完的质粒转染Trans10，挑取单克隆，接种到1升LB液体培养基，至OD600为1时，离心
收集菌体，用质粒大提试剂盒提取质粒。

[0025] 将测序鉴定正确的表达载体转染293F细胞，37℃，5％CO2，130rpm/min培养7天后，离心收集上清。将上清于4000rpm离心10min，再用0.45μm滤膜过滤；滤液加入400mM NaCl；
调整pH至8.0。样品经0.2μm滤膜再次过滤后，上样至已用PBS平衡好的5mL HiTrap Protein 
A柱；待样品上完后用PBS冲洗，流速5mL/min，紫外监测为水平。1M甘氨酸，pH 3.5洗脱，流速
1mL/min，收集流出峰用Tris中和至pH 7.5。用超滤浓缩管浓缩洗脱峰换液至PBS中，由此得
到PDL1‑Fc抗原融合蛋白。将PDL1‑Fc用肠激酶进行酶切，置于37℃12小时，酶切后产物过
HiTrap Protein A柱用于吸附切除的Fc标签，收集流出液，即为PD‑L1胞外区抗原。

[0026] 实施例2：抗原免疫小鼠和杂交瘤筛选

[0027] 本实验选用8周龄雌性BALB/c小鼠3只，采用腹腔注射法，用实施例1制备的PD‑L1胞外区抗原与弗氏完全佐剂混合免疫小鼠，每周1次，共3次。最后一次免疫后一周测量小鼠
血清效价，满足条件效价大于8K后加强免疫一次，结果显示3只小鼠全部满足效价(大于阴
性对照2倍且大于0.25的OD450值对应的稀释度值即为该抗体的效价，效价大于等于8K即满
足要求)，3天后处死小鼠，取小鼠脾脏，经碾磨后获得脾细胞群。利用流式细胞术(FACS)筛
选出抗人肿瘤PD‑L1抗体的B细胞，置于RPMI1640培养基中，加入骨髓瘤细胞(SP2/0)混匀，
采用50％PEG溶液进行细胞融合。融合后的细胞经过适当稀释，分置于多块96孔培养板中培
养，加入HAT选择性培养基，使未融合的B细胞和骨髓瘤细胞死亡，得到杂交瘤细胞。培养2周
后收集96孔板细胞培养上清，与铺有PD‑L1抗原的96孔酶标板结合1小时，加入抗鼠/HRP二
抗孵育1小时，最后加入TMB显色试剂反应10分钟，用酶标仪测定450nm处的光吸收值，选出
与PD‑L1具有结合活性的杂交瘤细胞。随后进行流式细胞术(FACS)筛选，选出具有PD‑1/PD‑
L1阻断活性的杂交瘤细胞，在进行有限稀释法亚克隆，最终得到一株抗PD‑L1鼠源单克隆抗
体。

[0028] 实施例3：抗PD‑L1鼠源抗体可变区基因调取

[0029] 选取实施例2制备的抗PD‑L1鼠源单克隆抗体，采用Trizol方法抽提总RNA，利用抗体亚型(Isotype)特异性引物或者通用引物进行反转录PCR，分别扩增抗体轻链可变区(VL)
和重链可变区(VH)基因，随后连接至克隆载体进行DNA测序分析。最终获得完整VL和VH的
DNA序列，并翻译成相应的氨基酸序列。

[0030] 实施例4：抗PD‑L1鼠源单抗基因人源化改造及亲和力成熟

[0031] 分析与小鼠PD‑L1抗体的VH基因同源性较高的人种系基因(germline gene)，并进行相关人源化改造。

[0032] 针对抗PD‑L1人源化抗体的6个CDR区分别设计了抗体突变体库，突变位点覆盖了所有CDR区的非保守位点。采用SOE‑PCR反应获得单链抗体(scFv)基因，经DNA凝胶回收和酶
切之后，与酶切后的pCANTAB‑5E噬菌体展示载体连接，电转化TG1感受态细菌，获得6个含有
CDR突变的单链抗体库。通过感染M13KO7辅助噬菌体，制作重组噬菌体，共进行了三轮淘洗，
保留并富集结合能力强的抗体突变体。每轮淘洗分别将重组噬菌体与生物素标记的重组人
PD‑L1抗原结合2小时，再加入链亲和素磁珠结合30分钟，先后用2％TPBS、1％TPBS和PBS清
洗5次，每次5分钟，淘洗之后立刻感染TG1细胞，用于下一轮重组噬菌体制备。挑选三轮淘洗
后富集的TG1单克隆，制备重组噬菌体上清，与铺有1ug/mL PD‑L1抗原的96孔酶标板结合1
小时，加入M13/HRP二抗孵育1小时，最后加入TMB进行显色反应10分钟，用酶标仪测定490nm
处的光吸收值。对数据进行分析后，计算含有抗体突变体的相对亲和力，亲和力测定结果如
表1，筛选得到1个(SA126‑C9)亲和力有明显提高的克隆开展下一步研究。该抗PD‑L1人源化
抗体亲和力成熟的重链氨基酸和核苷酸序列分别为SEQ ID NO:13和15；其中，重链可变区
的CDR‑H1、CDR‑H2和CDR‑H3氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1‑3，核苷酸序列分别为SEQ ID 
NO:7‑9。抗PD‑L1人源化抗体亲和力成熟的轻链氨基酸和核苷酸序列分别为SEQ ID NO:14
和16；其中，轻链可变区的CDR‑L1、CDR‑L2和CDR‑L3氨基酸序列分别为SEQ ID NO:4‑6，核苷
酸序列分别为SEQ ID NO:10‑12。

[0033] 表1亲和力测定结果

[0034]

[0035] 实施例5：抗PD‑L1人源化抗体的表达与纯化

[0036] 人工合成抗体的轻链的cDNA，人工合成抗体的重链的cDNA，将合成的cDNA分别克隆到pTT5质粒中，并通过测序确定质粒构建正确。将测序鉴定正确的重链表达载体和轻链
表达载体(1:1)共转染到293F细胞中，37℃，5％CO2，130rpm/min培养7天后，离心收集上清。
将上清4000rpm离心10min，并用0.45μm滤膜过滤，收集滤液；滤液加入400mM NaCl；调整pH
至8.0。样品经0.2μm滤膜再次过滤后，上样至已用PBS平衡好的5mL HiTrap Protein A柱；
待样品上完后用PBS冲洗，流速5mL/min，紫外监测为水平。1M甘氨酸，pH 3.5洗脱，流速1mL/
min，收集流出峰用Tris中和至pH 7.5。用超滤浓缩管浓缩洗脱峰，用脱盐柱换液至PBS中，
由此得到抗体蛋白。

[0037] 实施例6：人源化抗体体外诱导T细胞分泌IL2

[0038] 使用CD14+微球(Miltenyi)从PBMC中分离单核细胞，使用CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi)从PBMC中分离CD4+T细胞，在液氮中冷冻保存细胞。单核细胞解冻，在RPMI1640
培养基中培养6天，产生iDCs。每隔2或3天更换一半培养基，新鲜培养基中添加1000U/mL 
rhGM CSF和500U/mL rhIL‑4。将CD4+T细胞解冻，37℃孵育2‑3小时。将CD4+T细胞和iDCs分
别以50μL/孔的速度加入到96孔板中，以100μL/孔添加抗体稀释液(浓度分别为10μg/mL、2μ
g/mL、0.4μg/mL、0.08μg/mL、0.016μg/mL、0.003μg/mL、0μg/mL)，加入100μL/孔浓度为10μg/
mL的hIgG1作为阴性对照。37℃培养3天后收集上清液，用Luminex仪(购自LifeTechnology
公司)和细胞因子IL2检测试剂盒(购自BD Biosciences公司)检测上清IL2的分泌水平。如
图1显示抗体均可有效刺激T细胞的功能，分泌IL2，且与抗体浓度有关。在MLR试验中，
SA126‑C9诱导IL‑2分泌的能力略微优于Atezolizumab。

[0039] 实施例7：人源化抗体体外诱导T细胞分泌IFN‑γ

[0040] 使用CD14+微球(Miltenyi)从PBMC中分离单核细胞，使用CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi)从PBMC中分离CD4+T细胞，在液氮中冷冻保存细胞。单核细胞解冻，在RPMI1640
培养基中培养6天，产生iDCs。每隔2或3天更换一半培养基，新鲜培养基中添加1000U/mL 
rhGM CSF和500U/mL rhIL‑4。将CD4+T细胞解冻，37℃孵育2‑3小时。将CD4+T细胞和iDCs分
别以50μL/孔的速度加入到96孔板中，以100μL/孔添加抗体稀释液(浓度分别为10μg/mL、2μ
g/mL、0.4μg/mL、0.08μg/mL、0.016μg/mL、0.003μg/mL、0μg/mL)，加入100μL/孔浓度为10μg/
mL的hIgG1作为阴性对照。将细胞于37℃培养5天。5天后，从每份培养物中取出100μL培养基
用于细胞因子IFN‑γ测量。利用OptEIA ELISA试剂盒(购自BD Biosciences公司)来测定
IFN‑γ的水平。如图2显示抗体均可有效刺激T细胞的功能分泌细胞因子IFN‑γ，且与浓度
有关。在MLR试验中，高浓度条件下SA126‑C9诱导IFN‑γ分泌的能力优于Atezolizumab。

[0041] 实施例8：种属交叉反应

[0042] 将抗体SA126‑C9、SA126‑G7替换人源IgG1亚型，提高亲和力，检测种属交叉反应。Atezolizumab做对照抗体，cPD‑L1、mPD‑L1、hPD‑L2抗原可购买市售商品化蛋白。购买0.1mg 
cPD‑L1(食蟹猴抗原，R&D公司产)、0.1mg mPD‑L1(小鼠抗原，BioLegend公司产)、0.1mg 
hPD‑L2(人抗原，BioLegend公司产)待用。

[0043] 用ELISA方法鉴定SA126‑C9‑hIgG1、SA126‑G7‑hIgG1待测抗体与三种不同种属PD‑L1抗原的结合活性，分别计算IC50值并与对照抗体比较，判断其种属交叉反应特异性。结果
如图3‑5所示：

[0044] ①SA126‑C9‑hIgG1、SA126‑G7‑hIgG1抗体与人PD‑L1抗原的结合活性(图3)可看出：待测抗体SA126‑C9‑hIgG和Atezolizumab亲和力大致相同，且均比SA126‑G7‑hIgG1亲和
力更高。

[0045] ②SA126‑C9‑hIgG1、SA126‑G7‑hIgG1抗体与猴PD‑L1抗原的结合活性(图4)可看出：待测抗体SA126‑C9‑hIgG和SA126‑G7‑hIgG1亲和力相当，均比Atezolizumab亲和力弱。

[0046] ③SA126‑C9‑hIgG1、SA126‑G7‑hIgG1抗体与鼠PD‑L1抗原的结合活性(图5)可看出：Atezolizumab与鼠PD‑L1有较强的亲和力，而待测抗体SA126‑C9‑hIgG1和SA126‑G7‑
hIgG1均不与鼠PD‑L1抗原结合，无交叉反应。

[0047] 综合实验结果表明，SA126‑C9与人PD‑L1抗原具有较好的亲和力以及与鼠PD‑L1抗原无交叉反应，可作为候选抗体进行下一步实验。

[0048] 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保
护范围应该以权利要求书所界定的为准。