一株佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10及其应用转让专利
申请号 : CN202110278030.9
文献号 : CN113151053B
文献日 : 2022-11-04
发明人 : 李桂英 , 廖文 , 梁志梳 , 安太成
申请人 : 广东工业大学
摘要 :
本发明首次分离出一株佛里德兰德氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)GDUTAN10，于2021年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021094。本发明通过在含有苯系物的无机盐培养基中接种佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10研究其降解性能，结果表明该菌株在浓度为5mg/L的对二甲苯溶液中降解率高达100％，在浓度为8、10、15、20、25mg/L的对二甲苯溶液中降解率均可达到99.7％以上，说明佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10能够运用于苯系物污染环境治理方面，以达到环境修复的目的。
权利要求 :
1.一株佛里德兰德氏杆菌（Klebsiella pneumoniae）GDUTAN10，所述佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10于2021年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M
2021094。
2.权利要求1所述佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10在制备降解苯系物的微生物制剂中的应用，其特征在于，所述苯系物为对二甲苯。
3.一种微生物制剂，其特征在于，包含权利要求1所述佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10。
4.权利要求1所述佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10或权利要求3所述微生物制剂在降解大气、水体或土壤的苯系物中的应用，其特征在于，所述苯系物为对二甲苯。
5.一种降解苯系物的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10接种在含有苯系物的无机盐培养基中；包括以下步骤：将所述佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10种子液在肉汤培养基中培养12～15 h，离心收集菌体，洗涤，然后接种于苯系物无机盐培养基中培养，进行苯系物的降解；所述苯系物为对二甲苯。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10在含有苯系物的无机盐培养基中的接种量为9%～15%。
7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述苯系物在无机盐培养基中的浓度为1～
30 mg/L。
8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述降解的时间为45～50 h。
说明书 :
一株佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10 及其应用。
背景技术
[0002] 苯系物主要来源于石油、化工、农药、纺织、造纸、印染和油漆生产行业生产过程中，尤其是在石油化工领域发生的石油泄漏、废气排放以及燃烧过程中会释放大量的苯系物造成严重的环境污染。这些苯系物主要包括苯、甲苯、乙苯及二甲苯一类单环芳香烃，具有强挥发性，不仅能参与光化学反应，促进臭氧生成，从而进一步加剧光化学烟雾的形成；而且有强致癌、致畸和致突变性，会通过吸入和皮肤接触等多种途径进入人体，导致严重的神经损伤并造成严重的疾病，从而造成极大的健康危害，因此对苯系物的污染防控越来越受到关注。近年来，微生物降解苯系物逐渐成为研究热点，目前已有研究报道芽孢杆菌、绿蓝假单胞菌等微生物可以用于降解苯系物，例如：公布号为CN 103013877A的中国专利公开了一株具有降解苯甲硫醚能力的波茨坦短芽孢杆菌及其应用，具体公开了波茨坦短芽孢杆菌GIGAN1对环境中的苯甲硫醚的降解率为96.2％，可将其应用于降解环境中的苯甲硫醚；
公布号为CN 109401996A的中国专利公开了一株苯系物降解菌FB1及其筛选方法和在降解苯系物中的应用，具体公开了绿蓝假单胞菌 FB1能够高效降解苯、甲苯、乙苯。然而关于利用佛里德兰德氏杆菌降解苯系物的研究还未见报道，值得我们深入去探索。
公布号为CN 109401996A的中国专利公开了一株苯系物降解菌FB1及其筛选方法和在降解苯系物中的应用，具体公开了绿蓝假单胞菌 FB1能够高效降解苯、甲苯、乙苯。然而关于利用佛里德兰德氏杆菌降解苯系物的研究还未见报道，值得我们深入去探索。
发明内容
[0003] 本发明的第一目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一株佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10。
[0004] 本发明的第二个目的在于提供上述佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10在制备降解苯系物的微生物制剂中的应用。
[0005] 本发明的第三个目的在于提供一种包含上述佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10 的微生物制剂。
[0006] 本发明的第四个目的在于提供上述佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10或微生物制剂在降解大气、水体或土壤的苯系物中的应用。
[0007] 本发明的第五个目的在于提供一种利用佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10降解苯系物的方法。
[0008] 本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
[0009] 一株佛里德兰德氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)GDUTAN10，所述佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10于2021年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021094，保藏地址为中国武汉武汉大学。
[0010] 本发明提供的佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10的16S rDNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0011] 本发明还提供了佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10在制备降解苯系物的微生物制剂中的应用。
[0012] 本发明还提供了一种微生物制剂，包含上述佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10。
[0013] 本发明还提供了上述佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10或上述微生物制剂在降解大气、水体或土壤的苯系物中的应用。
[0014] 优选地，上述苯系物为对二甲苯。
[0015] 一种降解苯系物的方法，包括将上述佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10接种在含有苯系物的无机盐培养基中。
[0016] 优选地，所述方法包括以下步骤：将佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10种子液在肉汤培养基中培养12～15h，离心收集菌体，洗涤，然后接种于苯系物无机盐培养基中培养，进行苯系物的降解。
[0017] 更优选地，所述佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10在含有苯系物的无机盐培养基中的接种量为9％～15％。
[0018] 更优选地，所述苯系物在无机盐培养基中的浓度为1～30mg/L。
[0019] 更优选地，所述降解的时间为45～50h。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0021] 本发明首次分离出一株佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10，于2021年1月18 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021094，保藏地址为中国武汉武汉大学。佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10对苯系物的降解能力良好，该菌株在浓度为5mg/L的对二甲苯溶液中降解率高达100％，在浓度为8、10、15、20、25mg/L的对二甲苯溶液中降解率均可达到
99.7％以上。佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10能够运用于苯系物污染环境治理方面，以达到环境修复的目的。
99.7％以上。佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10能够运用于苯系物污染环境治理方面，以达到环境修复的目的。
附图说明
[0022] 图1为佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10的SEM形态图。
具体实施方式
[0023] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0024] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0025] 实施例1佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10的筛选与鉴定
[0026] 本发明所述具有苯系物降解能力的佛里德兰德氏杆菌Klebsiella pneumoniaeGDUTAN10是在以苯系物为碳源和能源物质时，从广东省广州市兴丰垃圾填埋场垃圾渗滤液中筛选分离、纯化而得。在无机盐培养基配方 (K2HPO4·3H2O 1.2g/L，KH2PO41.2g/L，NH4Cl 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L， FeSO4·7H2O 0.01g/L；微量元素：CaCl2·
2H2O 0.2g/L，MnSO4·4H2O 0.2g/L， CuSO4·2H2O 0.01g/L，ZnSO4·7H2O 0.2g/L，CoCl2·
6H2O 0.09g/L，Na2MoO4·2H2O 0.12g/L，H3BO3 0.006g/L)添加一定量的苯系物筛选，将对二甲苯作为驯化底物，驯化底物浓度依次为1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L。首先取
10mL 垃圾渗滤液加入含1mg/L对二甲苯的无机盐培养基，37℃驯化5天后，以10％接种量移入下一浓度中接着驯化，以此类推逐步提高浓度进行驯化。驯化结束后将终浓度的菌液稀‑1 ‑7
释10 ～10 倍，取0.2mL稀释后的菌液均匀涂布在以对二甲苯为碳源的固体培养基中，挑选生长状态良好的单菌落富集培养后进行的降解实验，将具有降解效果最好的菌落进行保存并做菌种鉴定。鉴定结果如下：
2H2O 0.2g/L，MnSO4·4H2O 0.2g/L， CuSO4·2H2O 0.01g/L，ZnSO4·7H2O 0.2g/L，CoCl2·
6H2O 0.09g/L，Na2MoO4·2H2O 0.12g/L，H3BO3 0.006g/L)添加一定量的苯系物筛选，将对二甲苯作为驯化底物，驯化底物浓度依次为1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L。首先取
10mL 垃圾渗滤液加入含1mg/L对二甲苯的无机盐培养基，37℃驯化5天后，以10％接种量移入下一浓度中接着驯化，以此类推逐步提高浓度进行驯化。驯化结束后将终浓度的菌液稀‑1 ‑7
释10 ～10 倍，取0.2mL稀释后的菌液均匀涂布在以对二甲苯为碳源的固体培养基中，挑选生长状态良好的单菌落富集培养后进行的降解实验，将具有降解效果最好的菌落进行保存并做菌种鉴定。鉴定结果如下：
[0027] (1)菌体的形态特性：
[0028] a.根据生理生化鉴定结果和电子显微镜观察，得出所筛选的佛里德兰德氏杆菌DUTAN10为革兰氏阳性菌；在电子显微镜下观察，其形态为杆状，菌体大小为(0.4～0.6)μm×(0.6～1)μm，周身鞭毛，其在SEM下的形态如图1所示；
[0029] b.在固体培养基(牛肉膏3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 5.0g/L)培养24h 后菌落的形态特性：菌落形态为圆形，乳白色，不透明，菌落直径为2～3mm；
[0030] c.主要的生理生化特征如表1：
[0031] 表1检测菌体的生理生化特征
[0032]
[0033] 注：反应状态分为阳性和阴性，阳性形状编码为“+”，阴性形状编码为“‑”。
[0034] (2)采用DNA提取试剂盒提取细菌总DNA。采用细菌的16S rDNA通用引物：
[0035] 上游引物:27F(5'‑AGTTTGATCMTGGCTCAG‑3')
[0036] 下游引物:1492R(5'‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3')
[0037] 扩增其16S rDNA基因，测序结果如下(SEQ ID:No.1)：
[0038] ctacctacttcttttgcacccactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgtagcattc tgatctacgattactagcgattccgacttcatggagtcgagttgcagactccaatccggactacgacatactttatgaggtccgct tgctctcgcgaggtcgcttctctttgtatatgccattgtagcacgtgtgtagccctggtcgtaagggccatgatgacttgacgtca tccccaccttcctccagtttatcactggcagtctcctttgagttcccggcctaaccgctggcaacaaaggataagggttgcgctc gttgcgggacttaacccaacatttcacaacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtctcacagttcccgaaggcacca atccatctctggaaagttctgtggatgtcaagaccaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaaaccacatgctccaccgcttg tgcgggcccccgtcaattcatttgagttttaaccttgcggccgtactccccaggcggtcgatttaacgcgttagctccggaagc cacgcctcaagggcacaacctccaaatcgacatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgct ttcgcacctgagcgtcagtctttgtccagggggccgccttcgccaccggtattcctccagatctctacgcatttcaccgctacac ctggaattctacccccctctacaagactctagcctgccagtttcgaatgcagttcccaggttgagcccggggatttcacatccga cttgacagaccgcctgcgtgcgctttacgcccagtaattccgattaacgcttgcaccctccgtattaccgcggctgctggcacg gagttagccggtgcttcttctgcgggtaacgtcaatcgccaaggttattaaccttatcgccttcctccccgctgaaagtgctttac aacccgaaggccttcttcacacacgcggcatggctgcatcaggcttgcgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgt aggagtctggaccgtgtctcagttccagtgtggctggtcatcctctcagaccagctagggatcgtcgcctaggtgagccgttac cccacctactagctaatcccatctgggcacatctgatggcatgaggcccgaaggtcccccactttggtcttgcgacgttatgcg gtattagctaccgtttccagtagttatccccctccatcaggcagtttcccagacattactcacccgtccgccgctcgtcacccga gagcaagctctctgtgctac
[0039] 将长为1371bp的16S rRNA基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行比对分析发现菌种与Klebsiella pneumoniae strain D3最相似，相似度为99％。
[0040] 综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列结果，本发明所筛选的细菌应归属克雷伯杆菌属，命名为Klebsiella pneumoniae GDUTAN10，于2021年1 月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2021094。
[0041] 实施例2佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10对苯系物的降解性能
[0042] a.配置无机盐培养基：在顶空瓶中配制100mL无机盐培养液(K2HPO4·3H2O 0.12g，KH2PO4 0.12g，NH4Cl 0.04g，MgSO4·7H2O 0.02g，FeSO4·7H2O 0.001g)， 100μl微量元素(CaCl2·2H2O 0.2g/L，MnSO4·4H2O 0.2g/L，CuSO4·2H2O 0.01g/L， ZnSO4·7H2O 0.2g/L，CoCl2·6H2O 0.09g/L，Na2MoO4·2H2O 0.12g/L，H3BO3 0.006 g/L)，在121℃下高压灭菌30min。
[0043] b.首先将实施例1筛选的佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10在营养肉汤培养基(牛肉膏3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 5.0g/L)中富集增菌培养12h，离心收集菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤三次，然后以10％接种量悬浮在上述装有100 mL无机盐培养基的血清瓶中，然后加入一定量对二甲苯溶液使得其浓度分别为 5mg/L、8mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L加盖密封，在温度37℃、振动频率200r/min摇床下培养进行降解试验，定期取样测定气相中对二甲苯的浓度，并利用亨利定律来检测其在液相中的降解率。检测条件为：含氢焰离子化检测器(FID)GC9800气相色谱仪(AT.SE‑54毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm)，检测器温度200℃，进样口气化室温度150℃，炉温度120℃。采用Agilent 500 μL气密针进样，进样量为500μL，不分流模式。结果如表2所示：
[0044] 表2佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10对不同浓度的对二甲苯的降解率
[0045]
[0046]
[0047] 从表2中可以看出，本发明得到佛里德兰德氏杆菌GDUTAN10在48h对不同浓度的对二甲苯的降解能力均可达到99.7％，其中，对浓度为5mg/L的对二甲苯的降解率高达100％，说明该菌株对苯系物具有良好的降解效果，可以应用于大气、水体以及土壤的苯系物污染修复及工业排放的VOC尾气末端治理中。
[0048] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。