弗氏柠檬酸杆菌AS11及其在污水处理中的应用

摘要

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及微生物废水处理技术领域。本发明公开了一株弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11，其保藏编号为CGMCC No.21283。该菌株已于2020年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称为CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号是CGMCC No.21283。该菌株能够在好氧条件下，实现氨氮、总氮和COD的同步去除。

权利要求

1.弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11，其保藏编号为CGMCC No.21283；其特征在于，所述弗氏柠檬酸杆菌AS11能去除污水中COD、氨氮或/和总氮，其中，所述污水的盐度范围为5‑20g/L。

2.一种微生物制剂，其活性成分为权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11。

3.依据权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌AS11，其特征在于，所述污水为生活污水或养猪废水。

4.依据权利要求3所述的杆菌，其特征在于，所述污水的pH值范围为5‑10.5。

说明书

弗氏柠檬酸杆菌AS11及其在污水处理中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物技术领域，尤其涉及微生物废水处理技术领域。

背景技术

[0002] 我国淡水资源(包括河流、湖泊、各大型水利工程等地表水以及地下水等)中经检测超标的主要污染指标物质包括化学需氧量(COD)、氨氮(NH4‑N)、总氮(TN)和总磷(TP)等。其中氮元素具有多种污染物存在形式且去除难度较高，并且当较高浓度的氨和亚硝酸盐等含氮污染物排放到环境中时，一方面会造成水体的富营养化，另一方面也会对多种生物产生生物毒性，因此脱氮理论与技术一直以来都是污水处理领域的研究热点。

[0003] 生物脱氮是目前污水氮素去除最为经济有效的方式。传统生物脱氮工艺包括好氧自养硝化和厌氧异养反硝化两个过程，但存在以下缺点：(1)自养硝化细菌生长缓慢、环境适应性差、抗冲击负荷弱，并且容易被高浓度氨氮和亚硝态氮抑制。(2)硝化和反硝化两个反应在时间和空间上无法统一，增加了投资运行成本。

[0004] 异养硝化好氧反硝化是一种新型脱氮工艺。它能够实现在一个反应器内同时实现硝化和反硝化作用，完成碳氮污染物的同步去除，缩短了反应周期，节省了空间并降低运行成本。目前，许多异养硝化好氧反硝化菌株被分离筛选，比如Bacillus subtilis、Pseudomonas stutzeri、Klebsiella pneumoniae、Alcaligenes faecalis等。但目前所分离的大多数菌株的适宜生长条件较为苛刻，对于一些特殊类型的废水(如酸碱废水、高盐废水、高氨氮废水)脱氮应用有限，而对于具有耐盐、耐酸碱、高浓度氨氮去除和同时对养猪废水COD和氨氮具有高去除率的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)未见报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一株弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11，其保藏编号为CGMCC No.21283。该菌株已于2020年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株保藏编号为CGMCC No.21283。

[0006] 本发明的有益效果在于：

[0007] 1.本发明提供的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11在生活污水、畜禽养殖污水等类型的污水微生物处理方面具有良好效果，其不仅对氨氮、总氮有很好的去除效果，同时也能去除水体中大部分的COD，从而实现污水同步脱氮除碳，极大地简化了脱氮工艺流程，节约了处理空间与成本。

[0008] 2.本发明的菌株AS11具有广泛的pH适应性，在5‑10.5的pH范围内都能进行高效的氨氮去除。

[0009] 3.本发明的菌株AS11具有耐盐特性，在20g/L的盐浓度下其氨氮去除率仍能达到90％以上。

[0010] 4.本发明所提供的菌株AS11能够在初始氨氮浓度为465mg/L养猪废水的脱氮过程中，好氧处理72h后氨氮去除率达95.7％，TN去除率达76.3％，COD去除率为64.4％，实现了高浓度氨氮污水的快速脱氮处理。

附图说明

[0011] 图1为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11的生长和异养硝化特性图。

[0012] 图2为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11在不同pH下的生长和脱氮特性图。

[0013] 图3为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11在不同盐度下的生长和脱氮特性图。

[0014] 图4为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11在未灭菌合成废水中的脱氮性能图。

[0015] 图5为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11在灭菌生活污水中的脱氮性能图。

[0016] 图6为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11在灭菌养猪废水中的脱氮性能图。

具体实施方式

[0017] 实施例中所用培养基如下：

[0018] LB培养基：酵母浸出物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1L。

[0019] 异养硝化培养基：氯化钠4g，磷酸氢二钠2.66g，磷酸二氢钾1g，柠檬酸钾4.41g，氯化铵0.38g，微量元素溶液3mL，蒸馏水1L，自然pH。

[0020] 合成废水：磷酸氢二钠4.78g，磷酸二氢钠1.24g，氯化钠4g，七水硫酸镁0.08g，柠檬酸三钠4.08g，氯化铵0.305g，微量元素溶液3mL，蒸馏水1L，自然pH。

[0021] 微量元素溶液：七水硫酸镁3g，一水硫酸锰3g，七水硫酸锌3g，硼酸1.12g，七水硫酸亚铁0.3g，二水氯化钙0.6g，蒸馏水1L。

[0022] 实施例1

[0023] 菌株的分离与鉴定：

[0024] 富集培养：样品为2020年4月由曹先贺采集自北京某污水处理厂的好氧段活性污泥，取充分混合的活性污泥20mL置于180mL0.2％氯化钠溶液中悬浮，取5mL悬浮液置于装有100mL异养硝化培养基的250mL锥形瓶中，在30℃、180rpm条件下进行驯化富集培养。驯化以
48h为一周期。每周期结束后取10mL富集液加入新的100mL异养硝化培养基中继续进行富集培养，如此连续富集培养5个周期。期间检测培养液中氨氮的去除情况。

[0025] 取富集5代后的培养液，用无菌水按照10‑3‑10‑7的不同比例梯度稀释，每个梯度取100μL稀释液涂布到异养硝化固体培养基上，置于生化培养箱中30℃培养48h，观察菌落生长状况，从中挑选形态各异的单菌落，用平板划线法分别在异养硝化固体培养基上划线，并在同一条件下培养48h。然后再挑选单菌落进行多次分区划线纯化，直到获得纯菌株，将纯化后的菌株置于20％甘油中在‑80℃冰箱冷冻保藏备用。

[0026] 菌株筛选：用接种环分别挑取纯化后的菌株接种至灭菌后的LB液体培养基中，在30℃、180rpm条件下培养24h后，按照5％(v/v)的接种量吸取一定量的菌液在4000rpm条件下离心5min后收集菌体，用无菌水洗涤后接种于装有50mL异养硝化培养基的150mL锥形瓶中，在30℃、180rpm摇床中培养72h，并分别于12h、24h、36h、48h、60h和72h取样检测培养液中的NH4‑N、TN和COD含量。从中筛选出具有异养硝化功能的菌株。

[0027] 经上述分离纯化过程得到一株异养硝化‑好氧反硝化细菌AS11，该菌形态特征为短杆状，菌体大小为(0.3‑0.5)μm×(0.8‑1.3)μm，不产芽孢，菌落为圆形，边缘整齐光滑，在LB培养基上呈乳白色微微发黄，为革兰氏阴性好氧菌。

[0028] 对所得菌株进行分子生物学鉴定，通过细菌16S rDNA序列(SEQ ID NO.1)PCR扩增后进行测序比对。

[0029] 扩增引物为27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT；

[0030] 反应体系为：10×Buffer 2μL，2.5mM dNTP 1.5μL，Primer1 1μL，Primer2 1μL，模板1μL，酶0.3μL，水13.2μL，总体积20μL；

[0031] 反应条件为：95℃预变性5min，30cycle的95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min，72℃延伸10min，4℃forever保温。

[0032] PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，测序。

[0033] 正反向测序并拼接后获得该菌的16S rDNA序列，将该序列于NCBI数据库进行Blast比对，比对结果显示，与弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)ATCC 8090同源性最高，达99.86％，菌株命名为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11，在本申请中以下简称菌株AS11。

[0034] 弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11已于2020年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.21283。

[0035] 实施例2

[0036] 菌株AS11的生长和异养硝化特性：

[0037] 将菌株AS11在LB液体试管中活化培养24h后，按照2％的接种量(v/v)吸取一定量的菌液在4000rpm条件下离心5min后收集菌体，用无菌水洗涤后接种于装有50mL灭菌后的异养硝化培养基(初始氨氮浓度100mg/L，C/N＝20)的150mL锥形瓶中，在30℃、180rpm摇床中培养72h，期间每隔4h取样测量OD600值，并将样品在10000rpm离心10min去除菌体后取上清检测水样中COD、NH4‑N、NO2‑N、NO3‑N、TN的含量。

[0038] 结果如下表和图1所示。在接种后的第8h菌株即开始生长，第12h后菌株快速生长，此时NH4‑N、TN和COD含量迅速下降。至20h时菌株生长基本结束，此时达到最大去除率，NH4‑N、COD和TN去除率分别为98.7％、94.2％、90.1％，并且处理全程没有亚硝态氮和硝态氮的产生。

[0039]

[0040] 氮平衡检测如下表所示，24h后总氮损失为40％，表明这部分氮通过反硝化作用生成气态氮化合物溢出水体。

[0041]

[0042] 实施例3

[0043] pH对菌株AS11生长和脱氮的影响：

[0044] 调节异养硝化培养基的pH分别为3、4、5、7、8.5、9.5、10.5、11.5，将菌株AS11按照常规方法活化后，按照2％的接种量(v/v)吸取一定量的菌液在4000rpm条件下离心5min后收集菌体，用无菌水洗涤后接种于调节pH之后的异养硝化培养基中，在30℃、180rpm摇床中培养72h，检测最终各pH条件下的OD600值，并将样品在10000rpm离心10min去除菌体后取上清检测水样中COD、NH4‑N的含量。

[0045] 结果如下表和图2所示。菌株AS11在5‑10.5的pH范围内都能进行很好的生长及异养硝化作用，其氨氮去除率均在90％‑93％之间，COD去除率在90％‑100％之间。表明菌株AS11在较低或较高pH的污水处理中有广阔的应用前景。

[0046]

[0047] 实施例4

[0048] 盐度对菌株AS11生长和脱氮的影响：

[0049] 利用NaCl调节异养硝化培养基的盐度分别为5、20、40、60g/L，将菌株AS11按照常规方法活化后，按照2％的接种量(v/v)吸取一定量的菌液在4000rpm条件下离心5min后收集菌体，用无菌水洗涤后接种于调节盐度之后的异养硝化培养基中，在30℃、180rpm摇床中培养72h，检测最终各pH条件下的OD600值，并将样品在10000rpm离心10min去除菌体后取上清检测水样中NH4‑N含量。

[0050] 结果如下表和图3所示。菌株AS11在5‑20g/L的盐度范围内都能进行较好的生长及异养硝化作用，其氨氮去除率均在90％以上。当盐度为达到40g/L及以上时，菌株的生长及氨氮去除率均被严重抑制，因此菌株AS11在20g/L及以下盐度的污水处理中有较好的应用前景。

[0051]

[0052] 实施例5

[0053] 菌株AS11在合成废水中的脱氮性能：

[0054] 将菌株AS11进行常规活化后按照2％(v/v)的比例接种到未灭菌的合成废水中，该合成废水的初始COD为1600mg/L，初始氨氮为80mg/L。在30℃、180rpm摇床中进行好氧处理，同时设置不接菌的合成废水作为对照组，每隔12h检测污水中的氨氮、TN和COD含量，结果如下表和图4所示。

[0055]

[0056]

[0057] 结果显示，在处理48h后，AS11处理组的氨氮、TN和COD的去除率分别为92.4％、66.4％、77.8％，而对照组氨氮、TN和COD含量并没有明显降低。表明菌株AS11在中低氨氮浓度的污水脱氮处理中具有良好的应用前景。

[0058] 实施例6

[0059] 菌株AS11在灭菌生活污水中的脱氮性能：

[0060] 通过添加柠檬酸盐将实际生活污水(初始氨氮含量约100mg/L)的C/N比调整在20左右(初始COD含量约1980mg/L)后进行灭菌处理，将菌株AS11进行常规活化后按照2％(v/v)的比例接种到灭菌后的生活污水中，在30℃、180rpm摇床中进行好氧处理，每隔24h检测污水中的氨氮、TN和COD含量，结果如下表和图5所示。

[0061]

[0062] 结果显示，在接种后的24h内菌株AS11即能够去除生活污水中绝大部分的氨氮及COD，24h COD和氨氮去除率达到86.8％、88.1％，同时总氮去除率达75％以上，48h后氨氮去除率达90％，总氮去除率达82.5％，COD去除率达100％，说明菌株AS11在中低氨氮浓度的生活污水脱氮处理中具有良好的应用前景。

[0063] 实施例7

[0064] 菌株AS11在灭菌养猪废水中的脱氮性能：

[0065] 实验室用养猪废水的预处理方法为，将采集自北京大兴某养猪场的新鲜猪尿与自来水按照1:4的比例混匀，再添加质量分数为5％的新鲜猪粪搅拌均匀，静置24h后取上层液体作为实验室养猪废水备用。

[0066] 通过添加柠檬酸盐将实际养猪废水(初始氨氮含量约465mg/L)的C/N比调整在20左右(初始COD含量约11700mg/L)后进行灭菌处理，将菌株AS11进行常规活化后按照5％(v/v)的比例接种到灭菌后的养猪废水中，在30℃、180rpm摇床中进行好氧处理，每隔36h检测污水中的氨氮、TN和COD含量，结果如下表和图6所示。

[0067]

[0068] 结果显示，在菌株AS11接种后的36h，氨氮含量下降较缓慢，即从465mg/L下降至417mg/L，COD从11700mg/L下降至11400mg/L，说明该时间段菌株处在一个适应期；到第72h氨氮迅速降至19.8mg/L，COD降至4170mg/L，72h氨氮去除率达95.7％，COD去除率为64.4％，TN去除率达81.3％，其中出水氨氮浓度已达到我国《畜禽养殖业污染物排放标准(GB18596‑
2001)》的要求。说明菌株AS11在中高氨氮浓度的畜禽养殖污水脱氮处理中具有良好的应用前景。

[0069] 以上所述仅为本发明示意性的具体实施方式，并非用以限定本发明的范围。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所做出的等同变化与修改，均应属于本发明的保护范畴。