牙膏类产品的微生物计数方法转让专利
申请号 : CN202110527305.8
文献号 : CN113151394B
文献日 : 2022-05-13
发明人 : 井良义 , 牛振东 , 王珏 , 陈卓 , 刘文杰 , 郝运伟 , 王君
申请人 : 北京市药品检验所
摘要 :
权利要求 :
1.牙膏微生物检验方法,其包括如下步骤:(1)提供待检测的牙膏,该牙膏中包含6% 15%的丙三醇;
~
(2)提供pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液、卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基、孟加拉红培养基;
(3)将步骤(2)所述一种缓冲液和两种培养基分别以每100ml添加β‑环糊精3g和酒石酸
0.2g的比例,配制成均包含0.2%酒石酸的一种缓冲液和两种培养基:3%β‑环糊精pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液、3%β‑环糊精卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基、3%β‑环糊精孟加拉红培养基;
(4)提供检测菌种,该菌种选自:金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌;
(5)制备检液:
称取样品10g,加到装有玻璃珠及90ml灭菌生理盐水的三角瓶中,充分振荡混匀,使其分散混悬,得到1/10检液,称为检液a;
称取样品10g,加到装有玻璃珠及90ml的包含0.2%酒石酸的3%β‑环糊精pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液的三角瓶中,充分振荡混匀,使其分散混悬,得到1/10检液,称为检液b;
(6)制备菌液:将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌三代菌培养物,分别制成每1ml含菌数为5000cfu 10000cfu的菌悬液,将黑曲霉菌制成为含3000cfu~ ~
6000cfu的孢子悬液,对检测菌种进行微生物计数方法适用性试验,当方法适用性试验符合要求时进行步骤(7)的培养和微生物计数;所述对检测菌种进行微生物计数方法适用性试验,是参照中国药典2020年版四部通则之“1105非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法”中的规范要求,照如下方式进行的:(61)实验组:
(i)取上述检液a共10份,每份9.9mL,置灭菌试管中,分别加入步骤(6)制备好的五种菌液0.1mL,每种菌液设置2份,混匀后,取1mL置无菌平皿中,向每种菌液的2份中分别注入15~20ml的卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基和包含0.2%酒石酸的含3% β‑环糊精卵磷脂吐温‑
80营养琼脂培养基,36℃培养5天,测定需氧菌总数;同法处理检液b测定需氧菌总数;
(ii)取上述检液a共4份,每份9.9mL,置灭菌试管中,分别加入步骤(6)制备好的白色念珠菌和黑曲霉菌的菌液0.1mL,每种菌液设置2份,混匀后,取1mL置无菌平皿中,向每种菌液的2份中分别注入15~20ml的孟加拉红培养基和包含0.2%酒石酸的含3% β‑环糊精孟加拉红培养基,28℃培养7天,测定霉菌和酵母菌总数;同法处理检液b测定霉菌和酵母菌总数;
(62)菌液对照组:参照上述实验组之(i)和(ii),以等量的无菌生理盐水替代检液,加入0.1mL菌液,按该实验组同法操作;
(63)供试品对照组:参照上述实验组之(i)和(ii),除不加入菌液外,按该实验组同法操作;
(64)按下式计算试验的回收比值:回收比值=(实验组平均菌落数‑供试品对照组平均菌落数)/菌液对照组平均菌落数;
(65)方法适用性实验结果的认定:若回收比值为0.5 2.0,认定该方法消除了样品的抑菌活性,方法适用性符合要求,能~
用于该样品的菌落计数;
若回收比值<0.5,认定该方法适用性不符合要求,不能用于该样品的菌落计数;
(7)培养和微生物计数:
(i)取上述检液b共5份,每份9.9mL,置灭菌试管中,分别加入步骤(6)制备好的五种菌液0.1mL,混匀后,取1mL置无菌平皿中,向每种菌液中注入15~20ml的包含0.2%酒石酸的含
3% β‑环糊精卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基,36℃培养5天,测定需氧菌总数;
(ii)取上述检液b共2份,每份9.9mL,置灭菌试管中,分别加入步骤(6)制备好的白色念珠菌和黑曲霉菌的菌液0.1mL,混匀后,取1mL置无菌平皿中,向每种菌液中分别注入15~
20ml的包含0.2%酒石酸的含3% β‑环糊精孟加拉红培养基,28℃培养7天,测定霉菌和酵母菌总数。
2.根据权利要求1的方法,其中所述卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基是由如下组分配制成pH值7.2的培养基:蛋白胨20 g/L、氯化钠5 g/L、牛肉粉3 g/L、卵磷脂1 g/L、7 g/L吐温
80、琼脂15 g/L、水。
3.根据权利要求1的方法,其中所述孟加拉红培养基是由如下组分配制成pH值7.2的培养基:蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂15g/L、孟加拉红
0.03g/L、氯霉素0.1g/L、水。
4.根据权利要求1的方法,其中均包含0.2%酒石酸的所述含3%β‑环糊精pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液、3%β‑环糊精卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基、3%β‑环糊精孟加拉红培养基三者是照如下方式配制的:分别使用pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液、卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基、孟加拉红培养基三者配制,每100ml缓冲液或培养基中加入β‑环糊精3g和酒石酸0.2g使溶解,分装,121℃,灭菌15min,即得包含0.2%酒石酸和3%β‑环糊精的一种缓冲液和两种培养基。
5.在牙膏微生物检验中考察微生物计数方法适用性试验的方法,该方法包括如下步骤:
(1)提供待检测的牙膏,该牙膏中包含6% 15%的丙三醇;
~
(2)提供pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液、卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基、孟加拉红培养基;
(3)将步骤(2)所述一种缓冲液和两种培养基分别以每100ml添加β‑环糊精3g和酒石酸
0.2g的比例,配制成均包含0.2%酒石酸的一种缓冲液和两种培养基:3%β‑环糊精pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液、3%β‑环糊精卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基、3%β‑环糊精孟加拉红培养基;
(4)提供检测菌种,该菌种选自:金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌;
(5)制备检液:
称取样品10g,加到装有玻璃珠及90ml灭菌生理盐水的三角瓶中,充分振荡混匀,使其分散混悬,得到1/10检液,称为检液a;
称取样品10g,加到装有玻璃珠及90ml的包含0.2%酒石酸的3%β‑环糊精pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液的三角瓶中,充分振荡混匀,使其分散混悬,得到1/10检液,称为检液b;
(6)制备菌液和方法适用性试验:将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌三代菌培养物,分别制成每1ml含菌数为5000cfu 10000cfu的菌悬液,将黑曲霉菌~
制成为含3000cfu 6000cfu的孢子悬液,接着参照中国药典2020年版四部通则之“1105非无~
菌产品微生物限度检查:微生物计数法”中的规范要求,照如下方式对检测菌种进行微生物计数方法适用性试验:
(61)实验组:
(i)取上述检液a共10份,每份9.9mL,置灭菌试管中,分别加入步骤(6)制备好的五种菌液0.1mL,每种菌液设置2份,混匀后,取1mL置无菌平皿中,向每种菌液的2份中分别注入15~20ml的卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基和包含0.2%酒石酸的含3% β‑环糊精卵磷脂吐温‑
80营养琼脂培养基,36℃培养5天,测定需氧菌总数;同法处理检液b测定需氧菌总数;
(ii)取上述检液a共4份,每份9.9mL,置灭菌试管中,分别加入步骤(6)制备好的白色念珠菌和黑曲霉菌的菌液0.1mL,每种菌液设置2份,混匀后,取1mL置无菌平皿中,向每种菌液的2份中分别注入15~20ml的孟加拉红培养基和包含0.2%酒石酸的含3% β‑环糊精孟加拉红培养基,28℃培养7天,测定霉菌和酵母菌总数;同法处理检液b测定霉菌和酵母菌总数;
(62)菌液对照组:参照上述实验组之(i)和(ii),以等量的无菌生理盐水替代检液,加入0.1mL菌液,按该实验组同法操作;
(63)供试品对照组:参照上述实验组之(i)和(ii),除不加入菌液外,按该实验组同法操作;
(64)按下式计算试验的回收比值:回收比值=(实验组平均菌落数‑供试品对照组平均菌落数)/菌液对照组平均菌落数;
(65)方法适用性实验结果的认定:若回收比值为0.5 2.0,认定该方法消除了样品的抑菌活性,方法适用性符合要求,能~
用于该样品的菌落计数;
若回收比值<0.5,认定该方法适用性不符合要求,不能用于该样品的菌落计数。
6.根据权利要求5的方法,其中当该方法适用性符合要求,能用于该样品的菌落计数时,照如下步骤(7)进行培养和微生物计数:(7)培养和微生物计数:
(i)取上述检液b共5份,每份9.9mL,置灭菌试管中,分别加入步骤(6)制备好的五种菌液0.1mL,混匀后,取1mL置无菌平皿中,向每种菌液中注入15~20ml的包含0.2%酒石酸的含
3% β‑环糊精卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基,36℃培养5天,测定需氧菌总数;
(ii)取上述检液b共2份,每份9.9mL,置灭菌试管中,分别加入步骤(6)制备好的白色念珠菌和黑曲霉菌的菌液0.1mL,混匀后,取1mL置无菌平皿中,向每种菌液中分别注入15~
20ml的包含0.2%酒石酸的含3% β‑环糊精孟加拉红培养基,28℃培养7天,测定霉菌和酵母菌总数。
7.根据权利要求5的方法,所述卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基是由如下组分配制成pH值7.2的培养基:蛋白胨20 g/L、氯化钠5 g/L、牛肉粉3 g/L、卵磷脂1 g/L、7 g/L吐温80、琼脂15 g/L、水。
8.根据权利要求5的方法,其中所述孟加拉红培养基是由如下组分配制成pH值7.2的培养基:蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂15g/L、孟加拉红
0.03g/L、氯霉素0.1g/L、水。
9.根据权利要求5的方法,其中所述均包含0.2%酒石酸的含3%β‑环糊精pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液、3%β‑环糊精卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基、3%β‑环糊精孟加拉红培养基三者是照如下方式配制的:分别使用pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液、卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基、孟加拉红培养基三者配制,每100ml缓冲液或培养基中加入β‑环糊精3g和酒石酸0.2g使溶解,分装,121℃,灭菌15min,即得包含0.2%酒石酸和3%β‑环糊精的一种缓冲液和两种培养基。
说明书 :
牙膏类产品的微生物计数方法
技术领域
牙膏类产品菌落(微生物)计数方法的适用性。
背景技术
全,对人们的健康造成危害,因此,为保证牙膏的产品质量,生产过程中需在牙膏配方中加
入有效的防腐抑菌剂[刘广源,孙晨亮.牙膏新型防腐剂的防腐研究[J].口腔护理用品工
业,2019,29(2):27‑29;徐晓明,田应菊.市售牙膏组成成分调查研究[J].中国美容医学,
2016;25(6):85‑89]。
“按《化妆品安全技术规范》第五章微生物检验方法的规定进行”[中华人民共和国国家质量
监督检疫总局,中国国家标准化管理委员会.GB/T 8372‑2017牙膏[S].北京,2017;国家食
品药品监督管理总局.化妆品安全技术规范[S]北京:中国医药科技出版社,2015:469],所
有牙膏与化妆品采用同一种检验方法,没能充分考虑到牙膏较强的抑菌性能。
检验结果的可靠性和正确性。
妆品微生物检验方法适用性的研究[J].环境与健康杂志,2014;31(12):1096‑1099],更不
能满足牙膏的检验要求。
性。
发明内容
(即微生物)计数方法的适用性。本发明人出人意料地发现,使用本发明微生物计数方法的
技术方案,完全能够满足牙膏类产品菌落(即微生物)计数方法的适用性。本发明基于此类
发现而得以完成。
培养基、3%β‑环糊精虎红培养基;
3000cfu~6000cfu的孢子悬液,对检测菌种进行菌落即微生物计数方法适用性试验,当方
法适用性试验符合要求时进行步骤(7)的培养和微生物计数;
卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基,36℃培养5天,测定需氧菌总数;
~20ml的含3%β‑环糊精孟加拉红培养基,28℃培养7天,测定霉菌和酵母菌总数。
807g/L、琼脂15g/L、水。
红0.03g/L、氯霉素0.1g/L、水。
下方式配制的:分别使用pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液、卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养
基、虎红培养基三者配制,每100ml缓冲液或培养基中加入3g的β‑环糊精使溶解,分装,121
℃,灭菌15min,即得三种包含3%β‑环糊精的缓冲液和培养基。(包含或不包含3%β‑环糊精
的)pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液在本发明中亦可称为稀释液。
计数法”中的规范要求,照如下方式进行的:
入15~20ml的卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基和含3%β‑环糊精卵磷脂吐温‑80营养琼脂培
养基,36℃培养5天,测定需氧菌总数;同法处理检液b测定需氧菌总数;
菌液的2份中分别注入15~20ml的孟加拉红培养基和含3%β‑环糊精孟加拉红培养基,28℃
培养7天,测定霉菌和酵母菌总数;同法处理检液b测定霉菌和酵母菌总数。
时,与β‑环糊精添加的同时还添加酒石酸,β‑环糊精与酒石酸的重量比为3:0.2。
养琼脂培养基、3%β‑环糊精虎红培养基三者在配制时,与β‑环糊精添加的同时还添加酒石
酸,β‑环糊精与酒石酸的重量比为3:0.2。
培养基、3%β‑环糊精虎红培养基;
曲霉菌制成为含3000cfu~6000cfu的孢子悬液,接着参照中国药典2020年版四部通则之
“1105非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法”中的规范要求,照如下方式对检测菌种
进行菌落即微生物计数方法适用性试验:
入15~20ml的卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基和含3%β‑环糊精卵磷脂吐温‑80营养琼脂培
养基,36℃培养5天,测定需氧菌总数;同法处理检液b测定需氧菌总数;
菌液的2份中分别注入15~20ml的孟加拉红培养基和含3%β‑环糊精孟加拉红培养基,28℃
培养7天,测定霉菌和酵母菌总数;同法处理检液b测定霉菌和酵母菌总数。
卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基,36℃培养5天,测定需氧菌总数;
~20ml的含3%β‑环糊精孟加拉红培养基,28℃培养7天,测定霉菌和酵母菌总数。
807g/L、琼脂15g/L、水。
红0.03g/L、氯霉素0.1g/L、水。
下方式配制的:分别使用pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液、卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养
基、虎红培养基三者配制,每100ml缓冲液或培养基中加入3g的β‑环糊精使溶解,分装,121
℃,灭菌15min,即得三种包含3%β‑环糊精的缓冲液和培养基。(包含或不包含3%β‑环糊精
的)pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液在本发明中亦可称为稀释液。
时,与β‑环糊精添加的同时还添加酒石酸,β‑环糊精与酒石酸的重量比为3:0.2。
养琼脂培养基、3%β‑环糊精虎红培养基三者在配制时,与β‑环糊精添加的同时还添加酒石
酸,β‑环糊精与酒石酸的重量比为3:0.2。
据本申请全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
施方案中的该技术特征,只要它们不会出现矛盾。
此外,本申请使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义,即便如此,本申
请仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释,提及的术语和短语如有与公知
含义不一致的,以本申请所表述的含义为准。
分的抑菌作用,关系到微生物检验方法的正确与否,以及能否真实反映被检牙膏污染的真
实状况。所以,在进行牙膏的微生物检测时,需要在检测时能有效消除牙膏样品本身的抑菌
作用,以保证检验结果的准确性和有效性。微生物检验方法适用性考察可以避免抑菌作用
对结果的影响,提高检验结果的准确性。
进行方法适用性实验。按《化妆品安全技术规范》(2015年版)第五章的方法,仅在菌落计数
(需氧菌总数)的培养基营养琼脂中加入吐温80和卵磷脂,不能很好的中和牙膏成分中的抑
菌剂的抑菌作用。从表1的结果可以看出,实验菌株金黄色葡萄球菌几乎全部被抑制,所试
样品的回收比值全部为0。枯草杆菌的回收比值在0.17~0.48之间,全部没有达到0.5的比
值要求。铜绿假单胞菌的回收比值最低的也达到0.63,全部符合实验要求,这是由于铜绿假
单胞菌能形成生物膜[Ciofu O,Tolker‑Nielsen T.Tolerance and resistance of
Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents‑how P.aeruginosa can
escape antibiotics[J].Frontiers in Microbiology,2019,10:913],对环境中消毒剂、
干燥、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力。白色念珠菌、黑曲霉菌作为需氧菌总数指标回
收时,使用的是卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基,营养条件较好,同时加入了吐温80和卵磷
脂,黑曲霉菌和白色念珠菌能达到回收要求。而作为霉菌和酵母总数回收时用的虎红培养
基,没有添加任何中和剂。黑曲霉菌的回收比值均为0,白色念珠菌的回收比值为0~0.37,2
株菌的回收比值不能达标。因此,完全按照《化妆品安全技术规范》(2015年版)第五章中方
法不能真实反映出牙膏的微生物学污染状况。
能通过0.45μm的滤膜;而牙膏的微生物限量标准较低(菌落总数≤500,霉菌和酵母≤100)
[中华人民共和国国家质量监督检疫总局,中国国家标准化管理委员会.GB/T 8372‑2017牙
膏[S].北京,2017],样品稀释法也不适用于牙膏的检验。本研究成功地改进了牙膏的微生
物检验方法,将稀释液由无菌生理盐水改成3%β‑环糊精pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液。
β‑环糊精(β‑cyclodextrin)外部为亲水环境,内部为疏水环境,它即能很好地溶于水,又能
从溶液中吸入疏水分子或分子的疏水部分到分子的空隙中,形成水溶性的包结物。它的空
腔直径为0.60~0.65nm,适合包埋多种无机、有机分子,但不能包埋细菌、霉菌和酵母(直径
>0.45μm)[孙伟,刘文杰,崔颖,等.β‑环糊精在喹诺酮类抗生素药品微生物限度检查方法
建立中的应用〔J〕.药物分析杂志,2013,33(1):18‑21]。本研究利用β‑环糊精对多种无机、
有机分子物质的包埋特性,加入稀释液作为中和剂,将牙膏中的抑菌剂包埋进β‑环糊精的
疏水腔中。需氧菌总数回收实验时,同时在培养基中液添加3%β‑环糊精协同加强吐温80和
卵磷脂的中和作用。结果显示,6种牙膏样品所有5株实验菌株的回收比值都在0.5~2.0之
间,结果满意。对于霉菌和酵母菌总数的回收实验,无论在稀释液或培养基中加入3%β‑环
糊精,均能有效中和牙膏样品中抑菌剂对黑曲霉菌和白色念珠菌的抑制作用,回收比值均
在0.5~2.0之间。仅在稀释液中加入β‑环糊精,曲霉菌和白色念珠菌即可获得0.68‑1.24的
回收结果,证明该方法适用于牙膏样品的微生物计数检测。
中抑菌剂的抑菌性,随着β‑环糊精浓度的升高,其中和牙膏样品中抑菌剂抑菌效力的能力
也在增强,但大于5%β‑环糊精溶液,在室温条件下长期放置会有少量结晶析出,3%为不饱
和溶液,室温下可长期放置,且3%基本可以消除牙膏样品中的抑菌剂的抑菌效力,完全满
足实验要求。
较大,低的1%,高的可达10%甚至可达15%;依据参照陈侣平文献(陈侣平,等,气相色谱法
测定涂料中三种醇类抗冻剂含量,广州化学,2016(04):56‑59)的方法,测定实施例1中所涉
及6种牙膏中的丙三醇含量,结果丙三醇含量均低于3%,均在1.4~2.2%范围内,这表明,
实施例1方法尤其是其中使用含3%β‑环糊精的稀释液和培养基的微生物检验方法是适用
于该类丙三醇含量比较低的牙膏的;已经发现,对于某些丙三醇含量比较高的牙膏,实施例
1的方法不能适用;为此,本发明在此进行了一个补充的实施例(在本文中可称为实施例2)
的试验,方法是,向实施例1的6种牙膏分别增补添加丙三醇适量并混匀,使它们中的丙三醇
含量分别达到6%和10%,接着照实施例1的方法进行菌落计数方法适用性实验,结果如下:
在参照实施例1之“5.1、以无菌生理盐水作为稀释液制备检液的菌落计数方法适用性实验
结果”所涉方法进行时,6种补加丙三醇至6%的品牌牙膏的结果,无论在培养基中是否添加
环糊精,对于金黄色葡萄球菌的回收比值均全为0,需氧菌试验中对枯草芽孢杆菌、铜绿假
单胞菌、黑曲霉菌、白色念珠菌四者的回收比值均在0.13~0.38范围内(例如表1之#处的数
据为0.24),孟加拉红培养基培养试验中对黑曲霉菌、白色念珠菌二者的回收比值均在0.16
~0.33范围内(例如表1之##处的数据为0.21);在参照实施例1之“5.1、以无菌生理盐水作
为稀释液制备检液的菌落计数方法适用性实验结果”所涉方法进行时,6种补加丙三醇至
10%的品牌牙膏的结果,无论在培养基中是否添加环糊精,对于金黄色葡萄球菌的回收比
值均全为0,需氧菌试验中对枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌、白色念珠菌四者的回
收比值均在0.08~0.31范围内(例如表1之#处的数据为0.18),孟加拉红培养基培养试验中
对黑曲霉菌、白色念珠菌二者的回收比值均在0.11~0.28范围内(例如表1之##处的数据为
0.23);在参照实施例1之“5.2、以3%β‑环糊精pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液作为稀释液
制备检液的菌落计数方法适用性实验结果”所涉方法进行时,6种补加丙三醇至6%的品牌
牙膏的结果,无论在培养基中是否添加环糊精,需氧菌试验中对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢
杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌、白色念珠菌五者的回收比值均在0.12~0.41范围内(例如
表2之△处的数据为0.33),孟加拉红培养基培养试验中对黑曲霉菌、白色念珠菌二者的回
收比值均在0.16~0.34范围内(例如表2之△△处的数据为0.27);在参照实施例1之“5.2、
以3%β‑环糊精pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液作为稀释液制备检液的菌落计数方法适用
性实验结果”所涉方法进行时,6种补加丙三醇至10%的品牌牙膏的结果,无论在培养基中
是否添加环糊精,需氧菌试验中对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉
菌、白色念珠菌五者的回收比值均在0.14~0.39范围内(例如表2之△处的数据为0.28),孟
加拉红培养基培养试验中对黑曲霉菌、白色念珠菌二者的回收比值均在0.12~0.35范围内
(例如表2之△△处的数据为0.23);由本实施例的结果可见,当牙膏中的丙三醇量达到6%
或以上时,实施例1的方法并不适用,因此提供一种检测丙三醇含量大于等于6%的牙膏中
的微生物的方法是又一个技术问题。进一步的,本发明在此再进行一个补充的实施例(在本
文中可称为实施例3),其参考实施列1的方法对实施例2所述增补添加丙三醇至6%和10%
的6个品牌的牙膏进行微生物检验,不同仅是在配制包含3%β‑环糊精的pH7.0无菌氯化钠‑
蛋白胨缓冲液、卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基、虎红培养基时,与β‑环糊精一起还添加
0.2%酒石酸得到含环糊精+酒石酸的缓冲液和培养基(可简称环/酒缓冲液和环/酒培养
基,本实施例各种物料中环糊精和酒石酸均添加或均不添加);使用此类增补环/酒的缓冲
液和培养基对含丙三醇6%和10%的牙膏照实施例1的方法进行菌落计数方法适用性实验,
结果如下:在参照实施例1之“5.2、以3%β‑环糊精pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液作为稀
释液制备检液的菌落计数方法适用性实验结果”所涉方法进行时,6种补加丙三醇至6%的
品牌牙膏的结果,无论在培养基中是否添加环糊精,需氧菌试验中对金黄色葡萄球菌、枯草
芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌、白色念珠菌五者的回收比值均在0.88~1.47范围内
(例如表2之△处的数据为1.06),孟加拉红培养基培养试验中对黑曲霉菌、白色念珠菌二者
的回收比值均在0.82~1.32范围内(例如表2之△△处的数据为0.94);在参照实施例1之
“5.2、以3%β‑环糊精pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液作为稀释液制备检液的菌落计数方
法适用性实验结果”所涉方法进行时,6种补加丙三醇至10%的品牌牙膏的结果,无论在培
养基中是否添加环糊精,需氧菌试验中对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、
黑曲霉菌、白色念珠菌五者的回收比值均在0.84~1.35范围内(例如表2之△处的数据为
1.22),孟加拉红培养基培养试验中对黑曲霉菌、白色念珠菌二者的回收比值均在0.86~
1.21范围内(例如表2之△△处的数据为1.02);由本实施例的结果可见,参照实施例1的方
法并在添加环糊精的稀释液和培养基中还添加少许酒石酸后,即使牙膏中的丙三醇量达到
6%或以上,牙膏微生物检验的方法适用性实验仍然是能够满足要求的,可用于该类牙膏样
品的菌落计数。进一步的,本发明在此再进行一个补充的实施例(在本文中可称为实施例
4),在本实施例中,提供三种市售牙膏(经测定,牙膏X含8.4%丙三醇、牙膏Y含11.2%丙三
醇、牙膏Z含6.7%丙三醇);对上述三种牙膏照接着照实施例1的方法进行菌落计数方法适
用性实验,结果如下:在参照实施例1之“5.1、以无菌生理盐水作为稀释液制备检液的菌落
计数方法适用性实验结果”所涉方法进行时,无论在培养基中是否添加环糊精,对于金黄色
葡萄球菌的回收比值均全为0,需氧菌试验中对枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌、白
色念珠菌四者的回收比值均在0.17~0.35范围内,孟加拉红培养基培养试验中对黑曲霉
菌、白色念珠菌二者的回收比值均在0.14~0.31范围内;在参照实施例1之“5.2、以3%β‑环
糊精pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液作为稀释液制备检液的菌落计数方法适用性实验结
果”所涉方法进行时,无论在培养基中是否添加环糊精,需氧菌试验中对金黄色葡萄球菌、
枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌、白色念珠菌五者的回收比值均在0.08~0.34范围
内,孟加拉红培养基培养试验中对黑曲霉菌、白色念珠菌二者的回收比值均在0.11~0.30
范围内;对上述三种牙膏照接着照实施例3的方法进行菌落计数方法适用性实验,结果如
下:在参照实施例1之“5.2、以3%β‑环糊精pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液作为稀释液制
备检液的菌落计数方法适用性实验结果”所涉方法进行时,无论在培养基中是否添加环糊
精,需氧菌试验中对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌、白色念珠菌
五者的回收比值均在0.76~1.35范围内,孟加拉红培养基培养试验中对黑曲霉菌、白色念
珠菌二者的回收比值均在0.84~1.42范围内;在参照实施例1之“5.2、以3%β‑环糊精pH7.0
无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液作为稀释液制备检液的菌落计数方法适用性实验结果”所涉方
法进行时,6种补加丙三醇至10%的品牌牙膏的结果,无论在培养基中是否添加环糊精,需
氧菌试验中对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌、白色念珠菌五者
的回收比值均在0.87~1.32范围内,孟加拉红培养基培养试验中对黑曲霉菌、白色念珠菌
二者的回收比值均在0.81~1.28范围内。本发明人出人意料地发现,根据上述几个实施例
可知,对于含有较高丙三醇含量的牙膏,在稀释液和/或培养基中添加3%的β‑环糊精的同
时,还添加少量酒石酸是必要的,而后者在克服本发明方法之丙三醇对方法学不良影响方
面的技术效果,是现有技术根本无法预见的。
具体实施方式
对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性
和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的,
但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明,而不是限制本发
明。
产。以上培养基按标签说明配制。培养基适用性和灵敏度实验符合中国药典2020年版规定,
灭菌生理盐水1910233204。
制成pH值7.2的培养基:蛋白胨20g/L、氯化钠5g/L、牛肉粉3g/L、卵磷脂1g/L、吐温807g/L、
琼脂15g/L、水;虎红培养基是由如下组分配制成pH值7.2的培养基:蛋白胨5g/L、葡萄糖
10g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂15g/L、孟加拉红0.03g/L、氯霉素0.1g/L、水。
加入3g的β‑环糊精使溶解,分装,121℃,灭菌15min,即得三种包含3%β‑环糊精的稀释液和
培养基。
含菌数为5000cfu~10000cfu的菌悬液;将黑曲霉菌制成为含3000cfu~6000cfu的孢子悬
液。
液的2份中分别注入15~20ml的卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基和含3%β‑环糊精卵磷脂吐
温‑80营养琼脂培养基,36℃培养5天,测定需氧菌总数;同法处理检液b测定需氧菌总数;
平皿中,向每种菌液的2份中分别注入15~20ml的孟加拉红培养基和含3%β‑环糊精孟加拉
红培养基,28℃培养7天,测定霉菌和酵母菌总数;同法处理检液b测定霉菌和酵母菌总数。
在0.5~2.0之间。霉菌和酵母总数的回收比值完全按照标准中的虎红培养基,回收比值均
达不到0.5,在虎红培养基中加入3%β‑环糊精后,两种菌的回收比值均超过了0.5。具体结
果见表1。
比值为0.49。当同时在培养基中加入3%β‑环糊精后,需氧菌、霉菌和酵母菌的所有菌株的
回收比值都达到了0.5~2.0。具体结果见表2。
药典:2020年版四部[S].北京:中国医药科技出版社,2015:145‑149]通则1105的指导原则,
选用β‑环糊精等中和剂,对不同品牌的牙膏的微生物检验方法适用性进行了初步的考察,
建立适用于牙膏的微生物计数检测方法。本发明以β‑环糊精为中和剂,根据《化妆品安全技
术规范》(2015年版)第五章要求,对牙膏样品进行微生物计数方法学研究,同时参考中国药
典(2020年版)版四部通则1105、1106项下原则,对该微生物计数方法进行验证。本发明的结
果表明,细菌总数(需氧菌总数)、霉菌和酵母菌总数验证试验中各菌的回收比值均符合《中
国药典》2020年版规定,检查方法可行。这表明,本发明方法适用于牙膏的微生物计数检查。
从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本申请的范围由所附权
利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有
变化囊括在本申请内。