外泌体miR-181b-5p在食管鳞癌诊断和治疗中的应用

摘要

本发明涉及肿瘤外泌体miR‑181b‑5p及其应用，miR‑181b‑5p能够在体内和体外促进肿瘤血管新生，诱导肿瘤的生长和转移，临床患者血清外泌体miR‑181b‑5p可用于食管鳞癌的诊断及预后评估，miR‑181b‑5p抑制剂可以作为抑制血管新生以及抑制食管鳞癌肿瘤生长、转移和肿瘤血管新生的药物。

权利要求

1.miR‑181b‑5p的抑制剂在制备治疗食管鳞癌、抑制食管鳞癌细胞的生长、转移和/或食管鳞癌血管新生的药物中的应用，所述抑制剂能够降低或者抑制miR‑181b‑5p的表达、降低miR‑181b‑5p的稳定性，或者降低或抑制miR‑181b‑5p的功能或活性，其中所述抑制剂为反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的序列为ACCCACCGACAGCAAUGAAUGUU（SEQ ID NO：4）。

说明书

外泌体miR‑181b‑5p在食管鳞癌诊断和治疗中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，具体为肿瘤诊断和治疗领域，特别涉及外泌体miR‑181b‑5p在食管鳞癌诊断和治疗中的应用。

背景技术

[0002] 食管癌是人类常见的恶性肿瘤之一，按照病理形态分类，食管癌主要有两种分型：食管鳞癌(ESCC)和食管腺癌(EAC)，其中西方国家以食管腺癌为主，研究也主要集中在食管腺癌的发病机制和治疗方面；而食管鳞癌则主要发生在中国等亚洲地区，在中国超过90％的食管癌为食管鳞癌。由于缺乏早期诊断方法和生物检测指标，大多数食管癌患者在初次诊断时已经是中晚期，而且患者的5年总体生存率较低，因此寻找有效的早期诊断和预后标志物具有重大的意义。

[0003] 肿瘤的发生与发展是多因素共同介导的，包括遗传、环境、免疫和物质代谢等，其中肿瘤微环境对肿瘤的生长和转移至关重要。肿瘤微环境中的多种细胞和非细胞组分，如免疫细胞、成纤维细胞、脉管系统等，癌细胞外的特殊局部环境均在肿瘤发展的过程中起到了十分重要的作用。基于临床治疗难以突破的现实问题，提示食管癌患者的治疗不能局限于肿瘤本身，可以从靶向调节肿瘤微环境入手。肿瘤血管生成是肿瘤微环境形成的必要条件，亦是肿瘤微环境形成的特征之一。血管生成与肿瘤的发生发展、恶性增殖和转移密切相关，靶向调节肿瘤微环境中血管生成过程是一种有效的抗癌治疗策略。

[0004] 外泌体是一种由多种细胞分泌的纳米级胞外囊泡，直径为30‑100nm，形状为“杯托状”或者“盘状”，由细胞内多囊泡体融合了细胞膜之后以胞吐的形式释放到胞外。外泌体可以作为细胞间信息交流的新型载体，通过影响细胞间的信息交流参与多种生物学进程。外泌体中含有多种内容物，包括mRNA、miRNA、DNA、蛋白质和脂质等物质，在外泌体中发现超过3000多种的RNA，2700多种miRNA以及近千种脂类，这些内容物被外泌体运输并作用于相应的靶细胞而发挥其生物学功能。肿瘤细胞分泌的外泌体携带了肿瘤细胞所具有的特殊信息并通过分泌外泌体的方式将有利于自身生长的信息传递给周围的多种细胞和组织来促进肿瘤细胞的生长和转移，其促进生长的机制主要包括：促进肿瘤血管新生、引起免疫逃逸、诱导肿瘤转移、以及参与肿瘤耐药等。

[0005] 总之，外泌体作为肿瘤微环境中的一个重要组分，携带遗传信息或蛋白质参与调控肿瘤细胞和血管内皮细胞间信号转导，促进肿瘤血管生成和肿瘤恶化过程，对其进行深入的分子机制研究将为癌症患者的临床诊断和治疗提供全新的思路。

发明内容

[0006] 发明人经过多年的研究，鉴定获得了一个与食管鳞癌的诊断和治疗高度相关的miRNA——miR‑181b‑5p，该miRNA存在于食管鳞癌所分泌的外泌体中，高表达的miR‑181b‑5p能够指示食管鳞癌的存在，而抑制miR‑181b‑5p的功能则能够抑制食管鳞癌肿瘤生长和转移或肿瘤血管新生，进而用于治疗食管鳞癌。正是基于上述发现，完成了本发明。具体地，本发明至少包括如下技术方案：

[0007] 本发明的第一个方面提供了miR‑181b‑5p在制备用于食管鳞癌诊断或预后评价的试剂、组合物或者试剂盒中的应用，优选地，所述miR‑181b‑5p的序列为AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU(SEQ ID NO:1)。

[0008] 本发明的第二个方面提供了miR‑181b‑5p的检测试剂在制备用于食管鳞癌诊断或预后评价的试剂、组合物或者试剂盒中的应用，优选地，所述miR‑181b‑5p的序列为AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU(SEQ ID NO:1)。

[0009] 在一个实施方案中，所述检测试剂用于检测来自受试者的样本中miR‑181b‑5p的表达水平，优选地，所述检测试剂用于检测来自受试者样本的外泌体中miR‑181b‑5p的表达水平；还优选地，所述样本为体液样本，例如血液、血清、血浆、泪液、尿液、唾液、组织液、脑脊液或汗液。

[0010] 在另一个实施方案中，所述检测试剂为miR‑181b‑5p的特异性扩增引物和/或miR‑181b‑5p的特异性结合探针；优选地，所述引物序列为：

[0011] 上游引物：5’‑AACATTCATTGCTGTCGGTGGGT‑3’(SEQ ID NO：2)；

[0012] 下游引物：5’‑TTTGGCACTAGCACATT‑3’(SEQ ID NO：3)。

[0013] 本发明的第三个方面提供了一种食管鳞癌诊断或预后评价的方法，其包括检测来自受试者的样本中miR‑181b‑5p的表达水平的步骤，其中与健康对照相比，更高的miR‑181b‑5p的表达水平指示受试者患有或者具有更高风险患有食管鳞癌，和/或不良的预后；

[0014] 优选地，所述样本中miR‑181b‑5p是指样本中存在于外泌体内的miR‑181‑5p；

[0015] 还优选地，所述方法还包含从样本中分离外泌体和/或从外泌体中提取miRNA的步骤；

[0016] 更优选地，所述分离外泌体的方法为超速离心法；进一步优选地，所述样本为体液样本，例如血液、血清、血浆、泪液、尿液、唾液、组织液、脑脊液或汗液。

[0017] 在一个实施方案中，其中所述检测是定量PCR，优选地，所述定量PCR所使用的引物为：

[0018] 上游引物：5’‑AACATTCATTGCTGTCGGTGGGT‑3’(SEQ ID NO：2)；

[0019] 下游引物：5’‑TTTGGCACTAGCACATT‑3’(SEQ ID NO：3)。

[0020] 在另一个实施方案中，其中所述检测为原位杂交，即利用探针对组织样本实施原位杂交检测，所述探针可以利用地高辛标记或者利用荧光标记。

[0021] 本发明的第四个方面提供了一种食管鳞癌诊断或预后评价试剂盒，其包括用于检测miR‑181b‑5p表达水平的试剂，优选地，所述试剂包括miR‑181b‑5p的特异性扩增引物和/或miR‑181b‑5p的特异性结合探针；

[0022] 还优选地，所述试剂盒还包括从体液样本(例如血液、血清、血浆、泪液、尿液、唾液、组织液、脑脊液或汗液)中分离外泌体的试剂，和/或从外泌体中提取miRNA的试剂。

[0023] 本发明的第五个方面提供了一种用于食管鳞癌诊断和/或预后评价的miRNA标志物，所述标志物为miR‑181b‑5p，优选地，所述miR‑181b‑5p的序列为AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU。

[0024] 本发明的第六个方面提供了miR‑181b‑5p的抑制剂在制备治疗食管鳞癌的药物中的应用，优选地，所述抑制剂能够降低或者抑制miR‑181b‑5p的表达、降低miR‑181b‑5p的稳定性，或者降低或抑制miR‑181b‑5p的功能或活性；还优选地，所述抑制剂包括：蛋白、反义寡核苷酸、LNA、PNA或小分子化合物；

[0025] 在一个具体实施方案中，所述抑制剂为反义寡核苷酸，序列例如ACCCACCGACAGCAAUGAAUGUU(SEQ ID NO：4)。

[0026] 本发明的第七个方面提供了一种用于治疗食管鳞癌的药物组合物，包括治疗有效量的miR‑181b‑5p的抑制剂，和药学上可接受的载体；优选地，所述抑制剂能够降低或者抑制miR‑181b‑5p的表达、降低miR‑181b‑5p的稳定性，或者降低或抑制miR‑181b‑5p的功能或活性；还优选地，所述抑制剂包括：蛋白、反义寡核苷酸、LNA、PNA或小分子化合物；

[0027] 在一个具体实施方案中，所述抑制剂为反义寡核苷酸，序列例如ACCCACCGACAGCAAUGAAUGUU(SEQ ID NO：4)。

[0028] 本发明提供的miR‑181b‑5p用于食管鳞癌的诊断和预后，具有极高的灵敏度和特异性，并且miR‑181b‑5p的表达水平与患者的N分期和临床分期密切相关，可以用于癌症的分期。更重要的是，miR‑181b‑5p并不仅能用于食管鳞癌的病变指示，其功能与食管鳞癌细胞的发生和发展具有密切关联，抑制miR‑181b‑5p的功能能够抑制癌细胞的生长和转移以及肿瘤血管新生，因此可作为药物的靶标用于食管鳞癌患者的临床治疗中。

附图说明

[0029] 图1显示了食管鳞癌细胞外泌体标志蛋白表达情况。

[0030] 图2显示了通过透射电镜鉴定外泌体形态的结果。

[0031] 图3显示了食管鳞癌外泌体促进HUVEC体外小管形成。

[0032] 图4显示了食管鳞癌外泌体促进裸鼠体内血管新生。

[0033] 图5显示了食管鳞癌组织和癌旁组织miRNA芯片表达图谱。

[0034] 图6显示了利用qPCR检测43对食管鳞癌组织和癌旁组织中miR‑181b‑5p的表达水平。

[0035] 图7显示了利用qPCR检测10种食管鳞癌细胞系中miR‑181b‑5p的表达水平。

[0036] 图8显示了利用qPCR检测10种食管鳞癌细胞系所分泌的外泌体中miR‑181b‑5p的表达水平。

[0037] 图9显示了食管鳞癌细胞系中miR‑181b‑5p表达水平与其所分泌的外泌体中miR‑181b‑5p表达水平相关性分析结果。

[0038] 图10显示了miR‑181b‑5p促进HUVEC体外小管形成。

[0039] 图11显示了外泌体中miR‑181b‑5p促进HUVEC体外小管形成。

[0040] 图12显示了外泌体中miR‑181b‑5p促进裸鼠体内血管新生。

[0041] 图13显示了miR‑181b‑5p促进食管鳞癌裸鼠皮下移植瘤生长。

[0042] 图14显示了HE染色观察裸鼠肝脏和肺部肿瘤转移情况。

[0043] 图15显示了利用免疫组化检测肿瘤组织中血管新生的结果。

[0044] 图16显示了利用活体成像观察8周内裸鼠体内肿瘤转移情况。

[0045] 图17显示了HE染色观察8周后裸鼠肝脏和肺部肿瘤转移情况。

[0046] 图18显示了免疫组化检测肝脏和肺部血管新生情况。

[0047] 图19显示了38例食管鳞癌患者和32例健康志愿者血浆miR‑181b‑5p的表达水平结果。

[0048] 图20显示了miR‑181b‑5p的表达水平与患者预后相关性分析结果。

[0049] 图21显示了利用原位杂交检测食管鳞癌组织和癌旁组织miR‑181b‑5p的表达水平的结果。

[0050] 图22显示了利用原位杂交检测食管鳞癌组织和癌旁组织miR‑181b‑5p和CD31的表达水平的结果。

具体实施方式

[0051] 还可进一步通过实施例来理解本发明，然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。

[0052] 定义

[0053] miR‑181‑5p是一种微小RNA、或者叫做微RNA、小RNA、microRNA或miRNA，上述名称在本发明中具有相同的含义。miRNA是一类内生的，长度约为20‑24个核苷酸的RNA分子，miRNA的编码基因转录出来之后最初获得的是pri‑miRNA，经过一次加工后，称为pre‑miRNA也就是miRNA的前体，随后经过Dicer酶切后，得到成熟的miRNA。

[0054] 本发明中的miR‑181‑5p可以指代其在上述成熟过程中的不同存在形式，即pri‑miRNA、pre‑miRNA和成熟的miRNA，其成熟miRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。此外，本发明的miR‑181‑5p还包括其功能等同物，即变体形式，这些变体或者功能等同物具有与miR‑181‑5p的内源野生型序列相同的功能，同时相比于野生型的序列，具有一个或更多个核苷酸的缺失、置换或者插入。

[0055] 本领域人员知晓，为了保证微小RNA的稳定性，可以在微小RNA的一端或者两端增加保护性碱基，如TT，也可对微小RNA碱基进行修饰，但是上述修饰不影响微小RNA的功能。因此，在不影响miR‑181b‑5p功能的条件下，对其进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。

[0056] 本发明所述的“检测试剂”是指用于检测miR‑181b‑5p内源表达水平的试剂或者试剂组合，例如引物(引物对)和/或特异性探针等。所述检测试剂可用于多种检测方法，例如定量PCR(更例如荧光定量PCR)，或者原位杂交，如使用标记(例如荧光标记)的特异性探针针对组织样本(如食管鳞癌组织样本、病理切片)进行原位杂交检测，获得特异性的检测信号。

[0057] 本发明所述的“抑制剂”是指miR‑181b‑5p的表达、或者能够抑制miR‑181b‑5p的稳定性、或者能够抑制miR‑181b‑5p的活性、或者能够缩短miR‑181b‑5p的作用时间的试剂。

[0058] 所述抑制剂的靶标不限于miR‑181b‑5p本身，还包括miR‑181b‑5p编码基因的基因组临近序列，还可以包括miRNA‑181b‑5p功能上下游的序列，例如miR‑181b‑5p的靶蛋白或者靶基因或者调控miR‑181b‑5p的蛋白或者基因。

[0059] 抑制剂的种类包括但不限于蛋白、反义寡核苷酸、LNA、PNA或小分子化合物等。

[0060] 实施例

[0061] 实施例1：外泌体的提取与鉴定

[0062] 采用超速离心法提取食管鳞癌细胞TE‑13和Eca‑109细胞培养上清的外泌体，具体步骤如下：首先3000×g，4℃离心15min，去除死细胞；然后6000×g离心40min，去除细胞碎片；10000×g离心1h，取上清；100000×g离心1h，收集沉淀即为外泌体，用400μl PBS重悬外泌体，并放在‑80℃保存。

[0063] 用RIPA蛋白裂解液提取外泌体中的总蛋白，并利用Western blot检测外泌体表面标志蛋白：首先通过SDS‑PAGE电泳2小时，然后利用湿法转膜，将电泳后的凝胶转移至经甲醇活化后的PVDF纤维膜上，采用电流为0.22mA的恒流条件转膜1小时，PVDF纤维膜封闭2小时后，CD9、CD63、TSG101、HSP70一抗孵育过夜，TBST清洗后用二抗孵育2小时，然后使用ECL发光液处理并曝光成像。

[0064] 使用透射电镜观察外泌体的形态，具体步骤为：将透射电镜所用的铜网平放到称量纸上，滴加20μL上述外泌体溶液，于红外灯下烘烤10min；烘干后再滴加2滴磷钨酸，继续烘烤10min，吸走多余液体，于投射电镜下观察外泌体结构。

[0065] 结果：外泌体标志蛋白表达情况如图1所示，透射电镜鉴定外泌体结构如图2所示。

[0066] 实施例2：食管鳞癌细胞外泌体能够促进血管内皮细胞(HUVEC)小管形成[0067] 取5μg食管鳞癌细胞TE‑13和Eca‑109以及食管上皮细胞HEEC所分泌的外泌体分别与HUVEC细胞共孵育24小时。取50μL Matrigel胶平铺于96孔板中，然后将96孔板放置于374
℃培养箱中30min，使Matrigel胶凝固。取各组与外泌体共孵育后的HUVEC细胞1×10个接种于上述96孔板中，6小时后观察各组HUVEC细胞小管形成情况，并记录小管分支。

[0068] 结果：各组HUVEC小管形成情况如图3所示，食管鳞癌细胞TE‑13和Eca‑109细胞所分泌的外泌体能够显著促进HUVEC小管形成，而食管上皮细胞分泌的外泌体对HUVEC小管形成并无显著影响。

[0069] 实施例3：食管鳞癌细胞外泌体能够促进裸鼠体内的血管生成

[0070] 将TE‑13、Eca‑109、HEEC所分泌的外泌体20μg与0.5mL的Matrigel胶混合均匀后皮下接种到BALB/c裸鼠的右侧腋下，14天后解剖取出Matrigel胶，拍照观察，并利用免疫组化和HE染色观察血管标志物CD31。

[0071] 结果：TE‑13和Eca‑109外泌体能够显著促进裸鼠体内的血管新生，而HEEC外泌体对裸鼠体内血管新生并无显著影响(如图4)。

[0072] 实施例4：人食管鳞癌与配对正常组织的表达谱芯片分析

[0073] 由北京博奥晶典生物技术有限公司对7对食管鳞癌癌组织与癌旁组织(来源于南京军区总医院)进行miRNA表达芯片研究，并对差异表达且与血管新生相关的miRNA进行分析。

[0074] 结果：miRNA表达芯片结果表明，miR‑181b‑5p在食管鳞癌组织中高表达(如图5)，其序列为AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU(SEQ ID NO:1)

[0075] 实施例5：RT‑qPCR验证miR‑181b‑5p在食管鳞癌组织、食管鳞癌细胞以及食管鳞癌外泌体中高表达

[0076] 利用Life公司的Trizol试剂和说明书分别提取食管鳞癌组织和癌旁组织(来源于南京军区总医院)、以及10个食管鳞癌细胞系(TE10、TE13、TE12、Eca109、KYSE30、KYSE150、KYSE180、KYSE410、KYSE450和KYSE510)(来源于苏州大学周翊峰教授实验室)中总RNA，外泌体RNA的提取使用外泌体miRNA提取试剂盒(购自QIAGEN)，用NanoDrop ND‑1000核酸定量仪TM定量所提取的RNA的纯度和浓度。采用abm 公司的miRNAcDNASynthesis Kit,with Poly(A)TM
Polymerase Tailing试剂盒对提取的总RNA反转录合成cDNA。采用abm 公司EvaGreen miRNAqPCR MasterMix试剂盒进行PCR反应。通过QuantStudio 3Real‑Time PCR system完成测试分析，所用引物序列：

[0077] 正向引物：5’‑AACATTCATTGCTGTCGGTGGG‑3’(SEQ ID NO:2)

[0078] 反向引物：5’‑TTTGGCACTAGCACATT‑3’(SEQ ID NO:3)

[0079] 结果：miR‑181b‑5p在食管鳞癌组织、食管鳞癌细胞、食管鳞癌细胞所分泌的外泌体中均高表达，且食管鳞癌细胞miR‑181b‑5p表达量与其外泌体中miR‑181b‑5p表达量呈正相关(如图6‑9)。

[0080] 实施例6：miR‑181b‑5p促进体外HUVEC小管形成

[0081] 按照转染试剂说明书(购自abm公司)将miR‑181b‑5p的mimic,inhibitor(反义寡核苷酸),negative control(由苏州吉玛基因股份有限公司合成)转染进HUVEC细胞，培养4
24小时后，每组取1×10个细胞进行小管形成实验，实验方法同实施例2。

[0082] miR‑181b‑5p mimic序列(双链)：

[0083] 正义链：5’‑AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU‑3’(SEQ ID NO:5)；

[0084] 反义链：5’‑CCACCGACAGCAAUGAAUGUUUU‑3’(SEQ ID NO:6)。

[0085] miR‑181b‑5p inhibitor:ACCCACCGACAGCAAUGAAUGUU(SEQ ID NO:4)；

[0086] negative control:CAGUACUUUUGUGUAGUACAA(SEQ ID NO:7)

[0087] 结果：相比于negative control组，miR‑181b‑5p mimic能够显著促进HUVEC小管形成，而miR‑181b‑5p inhibitor则抑制HUVEC小管形成，这进一步表明了miR‑181b‑5p具有促进HUVEC小管形成的作用(如图10)。

[0088] 实施例7：食管鳞癌细胞外泌体miR‑181b‑5p促进体外HUVEC小管形成[0089] 差速离心法提取转染miR‑181b‑5p mimic,inhibitor,negative control的Eca109细胞所分泌的外泌体，然后将上述外泌体与HUVEC共孵育24小时后进行小管形成实验，实验方法同实施例2。

[0090] 结果：如图11所示,转染miR‑181b‑5p mimic的Eca109细胞所分泌的外泌体能够显著促进HUVEC小管形成，而转染miR‑181b‑5p inhibitor的Eca109细胞所分泌的外泌体促进HUVEC小管形成的作用则被显著抑制，说明食管鳞癌细胞外泌体中miR‑181b‑5p促进体外HUVEC小管形成。

[0091] 实施例8：食管鳞癌细胞外泌体中miR‑181b‑5p促进裸鼠体内血管新生[0092] 差速离心法提取转染miR‑181b‑5p mimic,inhibitor,negative control的Eca109细胞所分泌的外泌体，将上述外泌体20μg与0.5mL的Matrigel胶混合均匀后皮下接种到BALB/C裸鼠的右侧腋下，14天后解剖取出Matrigel胶，拍照观察，并利用免疫组化和HE染色观察血管标志物CD31。

[0093] 结果：如图12所示，转染miR‑181b‑5p mimic的Eca109细胞所分泌的外泌体能够显著促进裸鼠体内血管新生，说明食管鳞癌外泌体中miR‑181b‑5p能够促进裸鼠体内血管新生。

[0094] 实施例9：miR‑181b‑5p能够促进食管鳞癌裸鼠皮下移植瘤的生长和血管新生[0095] 将LNA‑miR‑181b‑5p mimic、LNA‑miR‑181b‑5p inhibitor、和LNA‑negative control(即将实施例6中的miR‑181b‑5p mimic、inhibitor和negative control利用LNA修6
饰，提高稳定性)转染进Eca‑109细胞，取上述转染后的Eca‑109细胞，稀释为5×10个/100μL，皮下接种至Balb/c裸鼠右侧腋下，观察裸鼠肿瘤生长，每两天测量一次瘤体积及老鼠体重，20天后结束实验，取血清、肿瘤、肝、肺组织；免疫组化检测肿瘤组织中血管标志物CD31，HE染色和免疫组化分别观察肝、肺组织中转移病灶及血管新生。

[0096] 结果：如图13‑15所示，LNA‑miR‑181b‑5p mimic能够促进食管鳞癌的体内生长、血管新生和转移，相反，LNA‑miR‑181b‑5p inhibitor则能够抑制食管鳞癌的体内生长、血管新生和转移。

[0097] 实施例10：外泌体中miR‑181b‑5p能够促进食管鳞癌裸鼠体内转移

[0098] 用GFP慢病毒感染Eca109细胞，筛选后获得稳定表达GFP的Eca109细胞，稀释至1×6
10个/200μL，然后尾静脉接种至Balb/c裸鼠，接瘤后小鼠随机分为3组，各组小鼠分别尾静脉注射转染miR‑181b‑5p mimic、inhibitor、negative control的Eca109所分泌的外泌体
20μg，每周注射1次，共8周，在此期间每周通过活体成像观察Eca109细胞体内转移情况，8周后解剖小鼠取肝、肺组织进行HE染色和免疫组化，观察转移灶以及血管新生情况。

[0099] 结果：miR‑181b‑5p mimic组裸鼠肝、肺转移明显，且肝、肺组织血管新生显著，而miR‑181b‑5p inhibitor组裸鼠肝、肺转移减少，且肝、肺组织血管新生显著减少(如图16‑18)。

[0100] 实施例11：食管鳞癌患者血清外泌体高表达miR‑181b‑5p且与患者预后相关[0101] 分离38例食管鳞癌患者及32例健康志愿者的血清，使用外泌体miRNA提取试剂盒(exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit，QIAGEN，Cat.No.77064)提取血清中外泌体miRNA，利用RT‑qPCR检测血浆中miR‑181b‑5p表达水平，方法同实施例5。调查38例食管癌患者的随访资料，分析血浆外泌体miR‑181b‑5p的表达水平与患者预后的相关性。

[0102] 结果：食管鳞癌患者血清外泌体miR‑181b‑5p的表达量显著高于健康志愿者血清外泌体miR‑181b‑5p的表达水平，并且miR‑181b‑5p高表达的患者预后较差，说明miR‑181b‑5p可作为食管鳞癌患者诊断和预后评估的生物标志物(如图19、20)。

[0103] 实施例12：miR‑181b‑5p表达水平与患者预后相关性分析

[0104] 获取58例食管鳞癌患者的组织样本(来自南京军区总医院)，qPCR检测肿瘤组织中miR‑181b‑5p的表达水平，根据ΔCt(ΔCt＝Ct癌组织‑Ct癌旁组织)值来判定表达水平高低，其中ΔCt值越高，代表着表达量越低。以中位数ΔCt＝12.97作为cutoff，ΔCt＜12.97为高表达，ΔCt＞12.97为低表达，从而将58例食管鳞癌患者分为miR‑181b‑5p高表达和低表达两组，收集患者临床资料，利用卡方检验分析miR‑181b‑5p表达与各病理特征的相关性。

[0105] 结果：卡方检验结果显示，miR‑181b‑5p表达水平与N分期和临床分期相关(表1)，说明miR‑181b‑5p可以作为食管鳞癌诊断生物标志物和评价临床预后的指标。

[0106] 表1

[0107]

[0108]

[0109] 实施例13：原位杂交检测miR‑181b‑5p与血管新生和临床预后的相关性[0110] 利用原位杂交和免疫组化检测87例食管鳞癌患者癌组织与癌旁组织(来自生物芯片上海国家工程研究中心(上海芯超生物科技有限公司)上海张江生物银行)中miR‑181b‑5p的表达水平与CD31的表达(由上海芯超生物技术有限公司完成)，分析miR‑181b‑5p的表达与CD31表达的相关性；并将原位杂交结果进行打分，打分的标准如下：

[0111] 在Aperio ScanScope CS2下观察肿瘤组织和癌旁组织的切片，使用ImageScope进行扫描分析，根据两部分进行评分，分别是：染色面积和染色程度。

[0112] 对于染色面积：具有5％标记细胞的切片的得分为0；具有5‑30％标记细胞的切片的得分为1；具有31‑70％标记细胞的切片得分为2；超过71％的标记细胞的切片记为3。

[0113] 对于染色程度：根据扫描软件自动评分染色深浅，其中0表示阴性染色，1表示弱阳性染色，2表示中度阳性染色，3表示强阳性染色。

[0114] 将染色面积和染色程度相乘以产生每个切片的染色强度评分，随后将每个患者的肿瘤组织染色强度评分减去癌旁组织染色强度评分，得到每个患者的miR‑181b‑5p表达评分值，评分值大于等于0定义为高表达，评分值小于0定义为低表达。

[0115] 根据评分值分为miR‑181b‑5p高表达组和低表达组，收集患者临床资料，利用卡方检验分析miR‑181b‑5p表达与各病理特征的相关性；利用单变量与多变量Cox回归分析对miR‑181b‑5p以及各病理特征与患者生存时间相关性进行分析。

[0116] 结果：对87对临床肿瘤和癌旁组织进行原位杂交和免疫组化发现miR‑181b‑5p的表达水平与血管标志物CD31表达呈正相关，且二者均在肿瘤组织中高表达，说明miR‑181b‑5p促进肿瘤血管新生，提示miR‑181b‑5p可以作为抗肿瘤血管生成的药物设计新靶点(如图
21、22)。卡方检验结果显示，miR‑181b‑5p表达水平与N分期和临床分期相关(表2)；单变量与多变量Cox回归分析结果显示，miR‑181b‑5p表达水平可作为评价患者预后的独立因素(表3)。说明miR‑181b‑5p可以作为食管鳞癌诊断生物标志物和评价临床预后的指标。

[0117] 表2

[0118]

[0119]

[0120] 表3

[0121]