一种用于羚牛防盗猎鉴定的引物及其应用

摘要

本发明提供了一种用于羚牛防盗猎鉴定的引物及其应用，包括Takin‑F和Takin‑R，具体序列为：Takin‑F：5’‑TTCTGCGATTCTGCTTCGTG‑3’；Takin‑R：5’‑CCAGACCCGATGAACACCAG‑3’。本发明的引物Takin‑F和Takin‑R用于鉴定羚牛肌肉组织特异性时采取荧光定量PCR法，提高了鉴定的灵敏性、特异性、精确性和鉴定速度。

权利要求

1.一种用于羚牛防盗猎鉴定的引物，其特征在于，包括Takin‑F和Takin‑R，具体序列为：Takin‑F：5’‑TTCTGCGATTCTGCTTCGTG‑3’；

Takin‑R：5’‑CCAGACCCGATGAACACCAG‑3’。

2.如权利要求1所述的用于羚牛防盗猎鉴定的引物用于羚牛防盗猎鉴定的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，采用荧光定量PCR法，将Takin‑F和Takin‑R作为荧光定量PCR扩增的引物，进行羚牛防盗猎鉴定。

说明书

一种用于羚牛防盗猎鉴定的引物及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于动物分子生物学技术领域，涉及羚牛防盗猎鉴定，具体涉及一种用于羚牛防盗猎鉴定的引物及其应用。

背景技术

[0002] 羚牛(Budorcas taxicolor)为我国的一级保护动物，栖息于高海拔、高寒悬崖地段，体形较大，往往成为非法盗猎的目标，森林公安在缴获盗猎羚牛酮体时，依赖传统分类形态特征无法将其与牛、羊等区分，存在较大的局限性，依赖传统分类形态特征鉴定羚牛不仅费时费力，而且常受主观因素干扰，极易混淆出错，除此之外，传统的鉴定方法难以开展针对残缺个体的鉴别。

发明内容

[0003] 针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于，提供一种用于羚牛防盗猎鉴定的引物及其应用，解决现有技术中羚牛防盗猎鉴定费时费力的技术问题。

[0004] 为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案予以实现：

[0005] 一种用于羚牛防盗猎鉴定的引物，包括Takin‑F和Takin‑R，具体序列为：

[0006] Takin‑F：5’‑TTCTGCGATTCTGCTTCGTG‑3’；

[0007] Takin‑R：5’‑CCAGACCCGATGAACACCAG‑3’。

[0008] 本发明还保护一种如上所述的用于羚牛防盗猎鉴定的引物用于羚牛防盗猎鉴定的应用。

[0009] 具体的，该应用为采用荧光定量PCR法，将Takin‑F和Takin‑R作为荧光定量 PCR扩增的引物，进行羚牛防盗猎鉴定。

[0010] 具体的，荧光定量PCR法具体包括如下步骤：

[0011] 步骤一，提取并保存羚牛肌肉组织总RNA；

[0012] 步骤二，反转录PCR扩增：

[0013] 取出步骤一中所述的羚牛肌肉组织总RNA，将羚牛肌肉组织总RNA去除基因组DNA后作为反转录PCR扩增的RNA模板，混合反转录PCR反应液，设定反转录PCR反应程序，进行反转录PCR扩增，得到cDNA混合液；

[0014] 步骤三，荧光定量PCR扩增：

[0015] 将步骤二中的cDNA混合液用水稀释后，即得到荧光定量PCR扩增的cDNA 模板，分别制备实验组荧光定量PCR反应液和内参组荧光定量PCR反应液，制备好的实验组荧光定量PCR反应液和内参组荧光定量PCR反应液后，设定荧光定量 PCR反应程序，进行荧光定量PCR扩增，获得相应的数据；

[0016] 步骤四，将步骤三中获得的数据进行处理和结果分析。

[0017] 具体的，步骤一中，所述的提取羚牛肌肉组织总RNA的具体方法包括如下步骤：

[0018] 步骤1.1，取出保存在‑80℃的羚牛肌肉组织，加入1mL的Trizol裂解液和两个钢珠后，剧烈震荡，使羚牛肌肉组织在Trizol裂解液中充分裂解，得到混合液 A；

[0019] 步骤1.2，在步骤1.1中所述的混合液A中加入0.2mL氯仿，剧烈震荡30s后，室温孵育3min，得到混合液B；

[0020] 步骤1.3，将步骤1.2中所述的混合液B在4℃，1200r/min的条件下离心15min，得到分层的混合液C，混合液C的上层清液中包含羚牛肌肉组织总RNA，中间层包含羚牛肌肉组织蛋白质，最下层包含氯仿；

[0021] 步骤1.4，将步骤1.3中所述的混合液C中的上层清液转移至1.5mL离心管中，加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min，得到混合液D；

[0022] 步骤1.5，将步骤1.4中所述的混合液D在4℃，1200r/min的条件下离心10 min，离心完成后，离心管中为上清E和沉淀F；

[0023] 步骤1.6，将步骤1.5中所述的上清E弃去，沿离心管壁缓慢加入1mL 75％的预冷过的乙醇，轻轻上下颠倒洗涤沉淀F，将上述包含沉淀F的预冷过的乙醇在 4℃，12000rpm的条件下离心5min，离心完成后，离心管中为上清G和沉淀H；

[0024] 步骤1.7，将步骤1.6中所述的上清G弃去，室温干燥沉淀H 2～5min后，加入适量水使溶解沉淀H，沉淀H完全溶解后即得到羚牛肌肉组织总RNA，测定羚牛肌肉组织总RNA的浓度后，‑80℃保存备用。

[0025] 具体的，步骤二中，所述的反转录PCR反应液由以下组分混合而成：RNA 模板为10μL、反转录缓冲液为4μL、反转录酶液为1μL、通用RT引物为1μL、水4μL，各组分体积之和为20μL；

[0026] 步骤二中，所述的反转录PCR反应程序具体为，37℃反应15min后，再85℃反应5s。

[0027] 具体的，步骤三中，所述的实验组荧光定量PCR反应液由以下组分混合而成： cDNA模板为2μL、Takin‑F为0.6μL、Takin‑R为0.6μL、荧光PCR预混试剂为10μL、水6.8μL，各组分体积之和为20μL；

[0028] 步骤三中，所述的内参组荧光定量PCR反应液由以下组分混合而成：cDNA 模板为2μL、18sPF为0.6μL、18sPR为0.6μL、荧光PCR预混试剂为10μL、水6.8 μL，各组分体积之和为20μL；

[0029] 步骤三中，所述的荧光定量PCR反应程序具体为，95℃预变性30s，循环数为40，每个循环95℃变性10s，60℃退火延伸20s，40个循环结束后，70℃延伸 10min。

[0030] 本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：

[0031] (Ⅰ)本发明对羚牛肌肉组织总RNA的进行转录组测序，根据转录组测序的结果找出了不保守cDNA序列，利用相关生物学分析工具确定了目标cDNA 序列，针对此目标cDNA序列设计了特异性引物Takin‑F和Takin‑R，利用特异性引物Takin‑F和Takin‑R鉴定羚牛肌肉组织，提高了鉴定速度和鉴定结果的可靠性。

[0032] (Ⅱ)本发明的引物Takin‑F和Takin‑R用于羚牛防盗猎鉴定时采取荧光定量PCR法，提高了鉴定的灵敏性、特异性和精确性，同时提高了羚牛防盗猎鉴定的鉴定速度，鉴定结果的观测重复性好、直观性好且可靠性高。

[0033] 以下结合实施例对本发明的具体内容作进一步详细解释说明。

附图说明

[0034] 图1为本发明实施例1和对比例1荧光定量PCR显著性差异的柱状图。

[0035] 图2为本发明实施例1和对比例2荧光定量PCR显著性差异的柱状图。

[0036] 图3为本发明实施例1和对比例3荧光定量PCR显著性差异的柱状图。

[0037] 图4本发明实施例1和对比例4荧光定量PCR显著性差异的柱状图。

[0038] 图5本发明实施例1和对比例5荧光定量PCR显著性差异的柱状图。

[0039] 图中符号表示的含义：图1至图5中， 代表cDNA模板的来源物种为羚牛；图1至图5中， 分别代表cDNA模板的来源物种为秦川牛、绵羊、山羊、鸡和猪；“*”表示当P值<0.05时，图中两组数据之间具有显著性差异，“*”的数目越多代表显著性差异越大。

具体实施方式

[0040] 本发明对羚牛肌肉进行无参转录组测序，根据比对结果筛选出在羚牛与牛、羊、猪、鸡等不保守的转录组序列，通过设计特异性的定量引物，运用相对定量检测其在羚牛、牛、羊、猪、鸡肌肉组织cDNA中相对表达量，得到一对可用于鉴定羚牛肌肉组织的引物Takin‑F和Takin‑R，能够快速准确鉴定出羚牛肌肉组织。

[0041] 需要说明的是，本申请中：

[0042] 羚牛(Budorcas taxicolor)、秦川牛(Bos taurus)、绵羊(Ovis aries)、山羊(Capra hircus)、鸡(Gallus gallus)和猪(Sus scrofa)的肌肉组织均为本申请发明人所在的实验室所保存。

[0043] Trizol裂解液为RNAiso plus，货号为9109，购自Takara公司。

[0044] DNA酶反应缓冲液、DNA酶、反转录缓冲液、反转录酶液和通用RT引物均来自PrimeRT reagent Kit Perfect Real Time试剂盒，购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

[0045] 荧光PCR预混试剂为 Premix Ex Taq TM II，购自宝日医生物技术 (北京)有限公司。

[0046] Nano Drop 1000分光光度计购自美国Nanodrop公司，用于测定RNA的浓度。

[0047] S1000 Thermal Cycler PCR仪购自美国BIO‑RAD公司，用于进行除基因组反应和反转录PCR扩增反应。

[0048] CFX Connect荧光定量PCR仪购自美国BIO‑RAD公司，用于进行荧光定量 PCR扩增反应。

[0049] 以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。

[0050] 实施例1：

[0051] 本实施例提供一种用于羚牛防盗猎鉴定的引物，包括Takin‑F和Takin‑R，具体序列为：

[0052] Takin‑F：5’‑TTCTGCGATTCTGCTTCGTG‑3’；

[0053] Takin‑R：5’‑CCAGACCCGATGAACACCAG‑3’。

[0054] 本实施例中，获得Takin‑F和Takin‑R的具体方法包括如下步骤：

[0055] 步骤一，提取羚牛肌肉组织总RNA，将提取的羚牛肌肉组织总RNA送至联川生物科技有限公司进行测序，根据测序公司提供的测序结果，整理出多个不保守cDNA序列；

[0056] 步骤二，将步骤一中所述的不保守cDNA序列序列在NCBI网站上进行序列比对，序列比对使用NCBI网站(网址为http s://www.ncbi.nlm.nih.gov/)自带的bla stn在线工具和Nucleotide collection(nr/nt)数据库，序列比对结束后后，找出与 Nucleotide collection(nr/nt)数据库中的序列相似度最低的不保守cDNA序列，获得一个目标cDNA序列；

[0057] 步骤三，以步骤二中所述的目标cDNA序列为模板设计引物，设计引物采取本领域技术人员常规方法，最终获得Takin‑F和Takin‑R。

[0058] 本实施例的用于羚牛防盗猎鉴定的引物用于羚牛防盗猎鉴定的应用。该应用的具体方法，包括以下步骤：

[0059] 步骤一，提取并保存羚牛肌肉组织总RNA；作为本实施例的一种具体方案，所述的提取羚牛肌肉组织总RNA的具体方法包括如下步骤：

[0060] 步骤1.1，取出保存在‑80℃的羚牛肌肉组织，加入1mL的Trizol裂解液和两个钢珠后，剧烈震荡，使羚牛肌肉组织在Trizol裂解液中充分裂解，得到混合液 A；

[0061] 步骤1.2，在步骤1.1中所述的混合液A中加入0.2mL氯仿，剧烈震荡30s后，室温孵育3min，得到混合液B；

[0062] 步骤1.3，将步骤1.2中所述的混合液B在4℃，1200r/min的条件下离心15min，得到分层的混合液C，混合液C的上层清液中包含羚牛肌肉组织总RNA，中间层包含羚牛肌肉组织蛋白质，最下层包含氯仿；

[0063] 步骤1.4，将步骤1.3中所述的混合液C中的上层清液转移至1.5mL离心管中，加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min，得到混合液D；

[0064] 步骤1.5，将步骤1.4中所述的混合液D在4℃，1200r/min的条件下离心10 min，离心完成后，离心管中为上清E和沉淀F；

[0065] 步骤1.6，将步骤1.5中所述的上清E弃去，沿离心管壁缓慢加入1mL 75％的预冷过的乙醇，轻轻上下颠倒洗涤沉淀F，将上述包含沉淀F的预冷过的乙醇在 4℃，12000rpm的条件下离心5min，离心完成后，离心管中为上清G和沉淀H；

[0066] 步骤1.7，将步骤1.6中所述的上清G弃去，室温干燥沉淀H 2～5min后，加入适量水使溶解沉淀H，沉淀H完全溶解后即得到羚牛肌肉组织总RNA，测定羚牛肌肉组织总RNA的浓度后，‑80℃保存备用。

[0067] 本实施例中，步骤一中所述的水均为用质量分数为0.1％焦碳酸二乙酯处理过且无核糖核酸酶(RNase)的水。

[0068] 本实施例中，羚牛肌肉组织总RNA的浓度采用Nano Drop 1000分光光度计进行测定，测定结果见表1。

[0069] 步骤二，反转录PCR扩增：

[0070] 提取好羚牛肌肉组织总RNA后，取出步骤一中所述的羚牛肌肉组织总RNA，将羚牛肌肉组织总RNA去除基因组NDA后作为反转录PCR扩增的RNA模板，混合反转录PCR反应液，设定反转录PCR反应程序，进行反转录PCR扩增，得到 cDNA混合液；

[0071] 反转录PCR反应液由以下组分混合而成：RNA模板为10μL、反转录缓冲液为4μL、反转录酶液为1μL、通用RT引物为1μL、水4μL，各组分体积之和为20 μL；反转录PCR反应程序具体为，37℃反应15min后，再85℃反应5s。

[0072] 本实施例中，步骤二中所述的去除基因组DNA的具体为，制备除基因组DNA 反应液，设定除基因组DNA反应程序，进行除基因组DNA反应；除基因组DNA 反应液由以下组分混合而成：羚牛肌肉组织总RNA为2μL、DNA酶反应缓冲液为2μL、DNA酶为1μL、水为5μL，各组分体积之和为10μL；除基因组DNA反应程序具体为，42℃反应2min。

[0073] 本实施例中，步骤二中所述的水均为用质量分数为0.1％焦碳酸二乙酯处理过且无核糖核酸酶(RNase)的水。

[0074] 步骤三，荧光定量PCR扩增：

[0075] 将步骤二中的cDNA混合液用水稀释后，即得到荧光定量PCR扩增的cDNA 模板，分别制备实验组荧光定量PCR反应液和内参组荧光定量PCR反应液，制备好的实验组荧光定量PCR反应液和内参组荧光定量PCR反应液后，设定荧光定量 PCR反应程序，进行荧光定量PCR扩增，获得相应的数据；

[0076] 实验组荧光定量PCR反应液由以下组分混合而成：cDNA模板为2μL、 Takin‑F为0.6μL、Takin‑R为0.6μL、荧光PCR预混试剂为10μL、水6.8μL，各组分体积之和为20μL；

[0077] 内参组荧光定量PCR反应液由以下组分混合而成：cDNA模板为2μL、18sPF 为0.6μL、18sPR为0.6μL、荧光PCR预混试剂为10μL、水6.8μL，各组分体积之和为20μL；

[0078] 荧光定量PCR反应程序具体为，95℃预变性30s，循环数为40，每个循环95℃变性10s，60℃退火延伸20s，40个循环结束后70℃退火延伸10min。

[0079] 本实施例中，18sPF和18sPR的具体序列为：

[0080] 18sPF：5’‑CCTGCGGCTTAATTTGACTC‑3’；

[0081] 18sPR：5’‑ACCTAAGAACGGCCATGCAC‑3’。

[0082] 本实施例中，Takin‑F和Takin‑R在实验组荧光定量PCR反应液中的终浓度均为150nmol/L，18sPF和18sPR内参组荧光定量PCR反应液中的终浓度均为150 nmol/L；步骤二中用水稀释的稀释倍数为3～4倍，合适的模板浓度保证了荧光定量PCR的扩增效率。

[0083] 本实施例中，还制备了相应的空白组荧光定量PCR反应液，以确保荧光定量 PCR扩增使体系没有被污染，空白组荧光定量PCR反应液的制备采取本领域技术人员常规设置。

[0084] 步骤四，将步骤三中获得的数据进行处理和结果分析，数据采用双ΔCt法进行相对定量分析，数据的分析结果见图1至图5。

[0085] 对比例1：

[0086] 本对比例将用于羚牛防盗猎鉴定的引物用于鉴定秦川牛肌肉组织特异性的应用，其中，用于羚牛防盗猎鉴定的引物采用实施例1中的用于羚牛防盗猎鉴定的引物，即包括Takin‑F和Takin‑R的引物。

[0087] 该应用的具体方法与实施例1基本相同，区别在于，步骤一为提取并获得秦川牛肌肉组织总RNA，秦川牛肌肉组织总RNA的浓度测定结果见表1；步骤二中所述的反转录PCR扩增的RNA模板为秦川牛肌肉组织总RNA；步骤三中，荧光定量PCR扩增的cDNA模板具体为，步骤二提取的秦川牛肌肉组织总RNA经反转录PCR扩增后，再用水稀释后得到的。

[0088] 本对比例中，步骤四与实施例1相同，数据的分析结果见图1。

[0089] 对比例2：

[0090] 本对比例将用于羚牛防盗猎鉴定的引物用于鉴定绵羊肌肉组织特异性的应用，其中，用于羚牛防盗猎鉴定的引物采用实施例1中的用于羚牛防盗猎鉴定的引物，即包括Takin‑F和Takin‑R的引物。

[0091] 该应用的具体方法与实施例1基本相同，区别在于，步骤一为提取并获得绵羊肌肉组织总RNA，绵羊肌肉组织总RNA的浓度测定结果见表1；步骤二中所述的反转录PCR扩增的RNA模板为绵羊肌肉组织总RNA；步骤三中，荧光定量PCR 扩增的cDNA模板具体为，步骤二提取的绵羊肌肉组织总RNA经反转录PCR扩增后，再用水稀释后得到的。

[0092] 本对比例中，步骤四的数据的分析结果见图2。

[0093] 对比例3：

[0094] 本对比例将用于羚牛防盗猎鉴定的引物用于鉴定山羊肌肉组织特异性的应用，其中，用于羚牛防盗猎鉴定的引物采用实施例1中的用于羚牛防盗猎鉴定的引物，即包括Takin‑F和Takin‑R的引物。

[0095] 该应用的具体方法与实施例1基本相同，区别在于，步骤一为提取并获得山羊肌肉组织总RNA，山羊肌肉组织总RNA的浓度测定结果见表1；步骤二中所述的反转录PCR扩增的RNA模板为山羊肌肉组织总RNA；步骤三中，荧光定量PCR 扩增的cDNA模板具体为，步骤二提取的山羊肌肉组织总RNA经反转录PCR扩增后，再用水稀释后得到的。

[0096] 本对比例中，步骤四的数据的分析结果见图3。

[0097] 对比例4：

[0098] 本对比例将用于羚牛防盗猎鉴定的引物用于鉴定鸡肌肉组织特异性的应用，其中，用于羚牛防盗猎鉴定的引物采用实施例1中的用于羚牛防盗猎鉴定的引物，即包括Takin‑F和Takin‑R的引物。

[0099] 该应用的具体方法与实施例1基本相同，区别在于，步骤一为提取并获得鸡肌肉组织总RNA，鸡肌肉组织总RNA的浓度测定结果见表1；步骤二中所述的反转录PCR扩增的RNA模板为鸡肌肉组织总RNA；步骤三中，荧光定量PCR扩增的cDNA模板具体为，步骤二提取的鸡肌肉组织总RNA经反转录PCR扩增后，再用水稀释后得到的。

[0100] 本对比例中，步骤四的数据的分析结果见图4。

[0101] 对比例5：

[0102] 本对比例将用于羚牛防盗猎鉴定的引物用于鉴定猪肌肉组织特异性的应用，其中，用于羚牛防盗猎鉴定的引物采用实施例1中的用于羚牛防盗猎鉴定的引物，即包括Takin‑F和Takin‑R的引物。

[0103] 该应用的具体方法与实施例1基本相同，区别在于，步骤一为提取并获得猪肌肉组织总RNA，猪肌肉组织总RNA的浓度测定结果见表1；步骤二中所述的反转录PCR扩增的RNA模板为猪肌肉组织总RNA；步骤三中，荧光定量PCR扩增的cDNA模板具体为，步骤二提取的猪肌肉组织总RNA经反转录PCR扩增后，再用水稀释后得到的。

[0104] 本对比例中，步骤四的数据的分析结果见图5。

[0105] 从表1中可知，实施例1和对比例1～5中，各物种肌肉组织总RNA的浓度较高，OD260/OD280比值在2.0左右，说明RNA提取效果好，可以作为反转录PCR 扩增的模板。

[0106] 表1实施例1和对比例1～5中各物种肌肉组织总RNA的浓度

[0107]

[0108]

[0109] 由图1至图5可得出如下结论：

[0110] 从图1至图5可知，当P值<0.05时，实施例1相对于对比例1～5具有显著性差异，说明本发明的引物Takin‑F和Takin‑R能特异性地鉴定出羚牛肌肉组织，将引物Takin‑F和Takin‑R用于羚牛防盗猎鉴定的特异性和可靠性高。