一种水稻粒形主效QTL的InDel分子标记GW6a-InDel及其检测引物和应用转让专利
申请号 : CN202110622680.0
文献号 : CN113151575B
文献日 : 2022-04-29
发明人 : 占小登 , 孙廉平 , 龚柯 , 薛炮 , 彭泽群 , 陈代波 , 程式华 , 曹立勇 , 周正平
申请人 : 中国水稻研究所
摘要 :
权利要求 :
1.一种水稻粒形主效QTL的InDel分子标记GW6a‑InDel,其特征在于,所述GW6a‑InDel的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;在所述SEQ ID NO:1中存在连续的2或3个重复序列;所述重复序列为CGTCTT。
2.一种检测水稻粒形的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)提取待测水稻的DNA;
2)以步骤1)提取的DNA为模板,用引物对进行PCR扩增,得到扩增产物;所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所述的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物;
3)对步骤2)中扩增产物进行分析,根据扩增产物的长度判断待测水稻的粒形情况:当所述扩增产物长度为130bp,则待测水稻的基因型为GW6a,粒型为短粒;如果所述扩增产物的长度为136bp,则所述待测水稻的基因型为gw6a‑2,粒型表现为细长粒;如果扩增产物为杂合型,则待测水稻的基因型为GW6a/gw6a‑2,粒形介于两者之间。
3.根据权利要求2所述检测水稻粒形的方法,其特征在于,步骤2)中所述PCR扩增的反应体系如下:1μL DNA、0.5μL 10mmol的正向引物、0.5μL 10mmol的反向引物、1μL含20mM
2+
Mg 的10×Taq buffer、0.2μL 10mM dNTPs、0.2μL 2U/μLTaq DNA聚合酶和6.6μL ddH2O。
4.根据权利要求2所述检测水稻粒形的方法,其特征在于,步骤2)中所述PCR扩增的反应程序为95℃预变性4min;95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s,共32个循环;最后72℃延伸10min。
5.根据权利要求2~4任意一项所述检测水稻粒形的方法,其特征在于,所述待测水稻的品种包括日本晴、9311、中恢9308、中恢8015、长粒粳、BG1、IR56、华占、中花11、02428、南京11、玉针香、IR24、IR26和IR64。
说明书 :
一种水稻粒形主效QTL的InDel分子标记GW6a‑InDel及其检测
引物和应用
技术领域
背景技术
株穗数、每穗粒数和粒重决定。其中,粒形是影响水稻粒重的最重要因素之一,同时也影响
着稻米品质。粒形有关的三个主要性状分别为粒长、粒宽、千粒重。水稻粒形不仅直接决定
水稻品种的外观品质,而且对水稻品种的高产起重要作用。因此,发掘利用新的粒形基因等
位变异也是水稻分子育种的研究目的之一。
定的遗传背景中被发现和定位,存在于其他的品种中的等位变异却并没有被发现以及研
究,导致对这些QTL的基因分布和功能研究不够完善。现在主要利用分子测序手段,对这些
主效QTL在一些特异种质中检测分析。通过基因序列分析的策略,对已克隆的主效QTL 的新
型等位变异进行挖掘,以期对这些主效QTL的在不同材料中的分布和功能进行完善。
持。
发明内容
型等位变异gw6a‑2的水稻品种,进而实现细长粒表型的目标水稻品种的选择。
列;所述重复序列为CGTCTT。
和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物。
产物的长度为136bp,则所述待测水稻的基因型为gw6a‑2,粒型表现为细长粒;如果扩增产
物为杂合型,则待测水稻的基因型为GW6a/gw6a‑2,粒形介于两者之间。
物、0.5μL 10mmol的反向引物、1μL含20mM Mg 的10×Taq buffer、0.2μL 10mM dNTPs、0.2μ
L 2U/μLTaq DNA聚合酶和6.6μL ddH2O。
区分二者的InDel分子标记GW6a‑InDel。只需要检测上述标记的扩增条带特性,可以判断目
标材料中的GW6a位点是否是新的等位变异gw6a‑2,用于指导水稻粒形改良的育种工作,如
可以实现具有细长粒表型品种的筛选。本发明所述分子标记不仅在苗期就能区别水稻品种
的基因型,而且能够方便、快捷、直接地实现目标基因在水稻种质资源以及育种后代中的鉴
定,极大的降低了劳动成本、节约时间且不受环境及人为因素的影响。
附图说明
BG1;7,IR56;8,华占;9,中花11;10, 02428;11,南京11;12,玉针香;13,IR24;14,IR26;15,
IR64。
具体实施方式
(CGTCTT)2或3GGTCTTCTTCTTCTCCTTGGCGGCGGCGCCGTCGCCGTCGTCGGCGTG GTCGTGAACCGCCGCCA
TGTCGCCGGACAGGCC;在所述SEQ ID NO:1 中存在连续的2或3个重复序列;所述重复序列为
CGTCTT。本发明在GW6a 精确定位的基础上,对其在多个品种上进行测序鉴定分析(具体为
对大粒籼稻品种BG1和XLJ中的GW6a基因座进行二代测序,与参照品种日本晴的基因组序列
进行比对),发现新的等位变异,即在第一个外显子的+202位点插入了一段CGTCTT的重复序
列,命名该主效粒形QTL为gw6a‑2。序列表中提供了大粒籼稻品种BG1(SEQ ID NO.4,gw6a‑
2)、XLJ(SEQ ID NO.5, gw6a‑2)和日本晴(SEQ ID NO.6,GW6a)的GW6a基因序列。与GW6a 的
编码区序列(对应2个重复序列)相比,新的等位变异(对应3个重复序列)在第一个外显子的
一段CGTCTT重复序列处(+202位点),多插入了一段CGTCTT,原本的两个重复,插入后产生三
个重复。对应的编码序列转录产物在原本的对应位点是一段富含赖氨酸(K)和苏氨酸(T)的
氨基酸序列,新等位变异的转录产物在此处额外增加了一对赖氨酸(K)和苏氨酸(T),使其
T‑K富集度增加。当GW6a基因包含3个重复序列时,水稻粒形表现为细长粒,当GW6a基因包含
2次重复序列时,水稻粒形表现为短粒。本发明通过PCR扩增水稻粒形主效QTL的InDel分子
标记GW6a‑InDel,根据扩增产物的长度判断水稻粒形性状。本发明针对上述变异,获得分子
标记,能够大大提高水稻粒形基因GW6a的鉴定选育效率、加快育种进展。
(GGCCTGTCCGGCGAC)和核苷酸序列如 SEQ ID NO:3所示的反向引物
(GCTCGACGCAGAGAGACA)。本发明对所述引物对的来源没有特殊限制,采用本领域所熟知的
引物对的来源即可。在本发明实施例中,所述引物优选对委托杭州有康生物科技有限公司
合成。
buffer。本发明对所述dNTPs、Taq DNA聚合酶和含镁离子的10×Taq buffer的来源不做具
体限定,采用本领域所熟知的dNTPs、 Taq DNA聚合酶和含镁离子的10×Taq buffer等试剂
的来源即可。在本发明实施例中,所述dNTPs、Taq DNA聚合酶和含镁离子的10×Taq buffer
分别购自诺唯赞公司。
产物的长度为136bp,则所述待测水稻的基因型为gw6a‑2,粒型表现为细长粒;如果扩增产
物为杂合型,则待测水稻的基因型为GW6a/gw6a‑2,粒形介于两者之间。
物DNA的方法即可,例如试剂盒法和CTAB法。本发明提供的方法对待测水稻的品种不做具体
限定,采用本领域所熟知的水稻品种即可,在本发明中,所述待测水稻的品种优选包括日本
晴、9311、中恢9308、中恢8015、长粒粳、BG1、IR56、华占、中花11、02428、南京 11、玉针香、
IR24、IR26和IR64。
2+
引物、0.5μL 10mmol的反向引物、 1μL含20mM Mg 的10×Taq buffer、0.2μL 10mM dNTPs、
0.2μL 2U/μLTaq DNA聚合酶和6.6μL ddH2O。在本发明中,所述PCR扩增的反应程序优选为
95℃预变性4min;95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s,共32个循环;最后72℃延伸
10min。本发明对所述PCR扩增用仪器没有特殊限制,采用本领域所熟知的PCR仪即可。
粒;如果所述扩增产物的长度为136bp,则所述待测水稻的基因型为gw6a‑2,粒型表现为细
长粒;如果扩增产物为杂合型,则待测水稻的基因型为GW6a/gw6a‑2,粒形介于两者之间。在
本发明中,对所述扩增产物分析的方法优选包括PAGE凝胶电泳或测序。本发明对所述 PAGE
凝胶电泳或测序的方法均没有特殊限制,采用本领域所熟知的PAGE 凝胶电泳或测序即可。
下实施例。
恢8015、长粒粳、BG1、IR56、华占、中花11、02428、南京11、玉针香、IR24、IR26和IR64等15个
亲本进行标记鉴定。
1μL 10×Taq buffer(20mM Mg ),0.2μL dNTPs(10mM), 0.2μL Taq DNA聚合酶(2U/μL)和
6.6μL ddH2O。
进行电泳分离。
分子标记辅助选择。以分子标记 GW6a‑InDel对15个常规亲本进行聚丙烯凝胶电泳实验进
行鉴定,鉴定结果如图1所示。
列插入,为串联重复插入型。
与长粒型优质粳稻育种进展.中国水稻科学 (06),665‑672.doi:10.16819/j.1001‑
7216.2017.7115)。本发明所鉴定的gw6a‑2 的等位变异会导致粒长变长。
扩增出136bp片段则说明目标品种中存在CGTCTT插入,其基因型为gw6a‑2,如果能扩增出杂
合带型,说明该单株基因型为GW6a/gw6a‑2。
是否存在导致籽粒变细长的新型等位变异 gw6a‑2,提高了水稻粒形基因GW6a的多样性基
因座,提高了选择效率、加快了育种进度。
视为本发明的保护范围。