一种检测尿液中免疫球蛋白G的试剂盒

摘要

本申请公开了一种检测尿液中免疫球蛋白G的试剂盒，属于医学体外诊断技术领域。所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包括以下组分：Tris碱、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、表面活性剂S9、EDTA‑Na2和苯甲酸钠；所述试剂R2包括以下组分：tris碱、羊抗人免疫球蛋白G多克隆抗体、动物血清、苯甲酸钠、海藻糖、EDTA‑Na2和吐温。本申请试剂盒具有较高的灵敏度、较宽的线性范围和较好的重复性，可以对低值样本进行准确检测；同时本申请试剂盒还具有较好的稳定性，试剂能够稳定保存14个月，省去了试剂使用前的过滤步骤，简化了操作步骤的同时提高了检测结果的准确性。

权利要求

1.一种检测尿液中免疫球蛋白G的试剂盒，其特征在于：包括试剂R1和试剂R2；

所述试剂R1包括以下组分：Tris碱 2.42g/L；

聚乙二醇6000 40g/L；

聚乙烯吡咯烷酮 30 g/L；

氯化钠 9 g/L；

表面活性剂S9 1 g/L；

EDTA‑Na2 10 g/L；

苯甲酸钠 5 g/L；

所述试剂R2包括以下组分：Tris碱 2.42g/L；

羊抗人免疫球蛋白G多克隆抗体 100ml/L；

马血清 10 ml/L；

苯甲酸钠 5 g/L；

海藻糖 5g/L；

EDTA‑Na2 10 g/L；

吐温20 0 .5 ml/L。

2.根据权利要求1所述的一种检测尿液中免疫球蛋白G的试剂盒，其特征在于：所述试剂R1和试剂R2的pH值为7 .2‑7 .6。

3.根据权利要求1‑2任一所述的一种检测尿液中免疫球蛋白G的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括校准品和质控品，所述校准品和质控品为含有不同浓度的免疫球蛋白G抗原的样品。

4.根据权利要求3所述的一种检测尿液中免疫球蛋白G的试剂盒，其特征在于：所述校准品和质控品中，免疫球蛋白G抗原稀释液包括以下组分：终浓度为20mmol/L的PBS缓冲液、

10‑50 ml/L的动物血清、5‑10g/L的苯甲酸钠、0 .5‑1ml/L的吐温，溶液pH为7 .2。

5.根据权利要求1‑2任一所述的一种检测尿液中免疫球蛋白G的试剂盒，其特征在于：反应体系中待测样本与试剂R1、试剂R2的体积比为3:240:60；检测主波长为600nm，副波长为800nm。

说明书

一种检测尿液中免疫球蛋白G的试剂盒

技术领域

[0001] 本申请涉及医学体外诊断技术领域，特别涉及一种检测尿液中免疫球蛋白G的试剂盒。

背景技术

[0002] 免疫球蛋白(Ig)指具有抗体(Ab)活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。免疫球蛋白G是血液中主要的免疫球蛋白，多数以单体形式存在，主要由脾脏和淋巴结合成，不
能通过肾小球过滤，因此在正常人尿液中含量极低。

[0003] IgG在原发性肾小球肾炎和慢性肾炎患者尿中含量较高，其他类型肾小球疾病中仅轻度增高；IgM仅出现在慢性肾炎患者尿中，而在原发性肾小球肾炎和隐匿性肾炎患者尿
中含量甚微。故可分析尿中Ig增高的类型来帮助鉴别诊断肾小球疾病的种类。

[0004] 另外，IgG属大分子蛋白，分子量为150000道尔顿，如果尿中高分子蛋白排出增多，提示肾小球损伤较重，基底膜通透性增加，使大分子IgG漏出，成为非选择性蛋白尿，是肾小
球滤过膜选择通透性异常的重要指标。有研究提示，尿IgG水平和尿蛋白成正相关，尿IgG/
血IgG水平和蛋白尿成正相关。随着膜性肾病危险级别的提高，尿IgG也显著增高，从而说明
机械屏障损失越多。故尿IgG水平也是反映膜性肾病病情轻重的一个指标。

[0005] 目前国内外市场上检测免疫球蛋白G的方法有ELISA和免疫比浊法。免疫比浊法其原理为IgG与相应的抗体在适宜的液相中特异性结合，形成可溶性的抗原抗体复合物，在促
聚剂(如聚乙二醇等)的作用下，抗原抗体复合物自溶液中析出形成微粒，使反应液出现浊
度。免疫比浊法因其样本用量少，可直接在全自动生化分析仪上进行批量样本分析，操作简
单，而在临床上广泛应用。但目前免疫比浊法使用的试剂以及构建的方法都存在一些缺点
和不足，主要表现在：免疫比浊试剂R2中抗体在保存过程中，随着时间延长非常容易出现絮
状沉淀，出现浑浊沉淀的多少与抗体的浓度呈正比，一般使用时需要过滤去除，但过滤后可
能除去抗体，使抗体性能变差、线性不足、检测样本重复性变差及变异系数(CV)变大，从而
造成检测结果不准确，耽误患者的病情，而且增加过滤步骤，操作复杂，不能满足临床检测
要求。

发明内容

[0006] 针对现有的免疫比浊试剂中抗体不稳定易出现沉淀影响检测结果准确性的问题，本申请提供一种检测尿液中免疫球蛋白G的试剂盒。

[0007] 本申请的一种检测尿液中免疫球蛋白G的试剂盒，是通过以下技术方案得以实现的。

[0008] 一种检测尿液中免疫球蛋白G的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；

[0009] 所述试剂R1包括以下组分：

[0010]

[0011] 所述试剂R2包括以下组分：

[0012]

[0013] 通过采用上述技术方案，本申请在现有的免疫比浊试剂盒的试剂R1和试剂R2含有的组分的基础上进行优化和改进，在试剂R1中加入一定比例的聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、
表面活性剂S9，明显提高了试剂的灵敏度，同时拓宽了试剂的线性范围，使本申请试剂盒的
线性范围在0.2‑80g/L，从而能够对较低浓度的样本进行检测，还能够使较高浓度的样本在
不需要进行多次稀释的前提下直接进行检测，降低了检测过程的繁琐程度；

[0014] 同时，本申请在试剂R2中加入一定比例的动物血清、苯甲酸钠、海藻糖、EDTA‑Na2和吐温，明显提高了抗体稳定性，使试剂在长期的低温保存过程中不会出现大量浑浊，从而
省去了试剂在使用前需要进行过滤的预处理步骤。本申请试剂盒可以有效保证试剂的稳定
性，试剂能够稳定保存14个月，不影响试剂性能，采用保存14个月后的试剂对待测样本进行
检测，检测结果仍然具有较高的准确性。

[0015] 综上所述，本申请试剂盒一方面具有较高的灵敏度、较宽的线性范围和优异的重复性，可对较低浓度的样本进行检测，避免了检测结果假阴性的发生和患者病情的延误；另
一方面具有较好的稳定性，检测试剂可保存14个月，检测结果依旧准确可靠。

[0016] 可选的，所述试剂R1包括以下组分：

[0017]

[0018] 通过采用上述技术方案，本申请进一步优化试剂R1中各组分的含量，试剂盒的分析灵敏度进一步提高，试剂在0.2‑80g/L的线性范围内准确度进一步提高。

[0019] 可选的，所述试剂R2包括以下组分：

[0020]

[0021] 通过采用上述技术方案，本申请进一步优化试剂R2中各组分的含量，试剂盒的稳定性进一步提高，试剂R2在存放过程中出现絮状沉淀的发生率进一步减小，试剂的浊度进
一步降低，避免了过滤对试剂性能的影响，从另一方面提高了试剂盒的灵敏度，提高了低值
样本检测的准确度，重复性更好，很好的控制了变异系数。

[0022] 可选的，所述试剂R1和试剂R2的pH值为7.2‑7.6。

[0023] 通过采用上述技术方案，本申请将试剂R1和试剂R2的pH值控制在7.2‑7.6，能够为抗原、抗体提供稳定的反应环境、贮存环境，提高了检测结果的准确性。

[0024] 可选的，所述动物血清选用马血清、牛血清和鸡血清中的任意一种。

[0025] 通过采用上述技术方案，本申请的动物血清选用马血清、牛血清和鸡血清，这三种血清加入试剂R2中，能够模拟生物体内环境，为免疫球蛋白G多克隆抗体提供更加适宜的保
存环境，提高了抗体的稳定性，延长了抗体的保存期限，使试剂R2不容易出现浑浊现象。

[0026] 可选的，所述聚乙二醇选用聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000和聚乙二醇8000中的一种或几种。

[0027] 通过采用上述技术方案，本申请的聚乙二醇可以选用不同分子量的聚乙二醇，将其加入到试剂R1中，可以使试剂R1中的其他各组分充分的分散，使试剂R1具有很好的均一
度。

[0028] 可选的，所述吐温选用吐温20和吐温80中的一种或两种。

[0029] 通过采用上述技术方案，本申请的吐温选用吐温20和吐温80，将其加入到试剂R2中，可以使试剂R2中的其他各组分充分的分散，提高了试剂R2的均匀度，可以为抗体提供稳
定的环境，防止沉淀的发生。

[0030] 可选的，所述试剂盒还包括校准品和质控品，所述校准品和质控品为含有不同浓度的免疫球蛋白G抗原的样品。

[0031] 通过采用上述技术方案，本申请试剂盒还包括校准品和质控品，校准品用于定标曲线的绘制，待测样本通过将测定得到的吸光度变化值带入定标曲线便可得到待测样本的
浓度，测定方法简单；质控品的设置用于指示试剂盒中试剂R1和R2的有效性，从而提高检测
结果的准确性和可靠性。

[0032] 可选的，所述校准品和质控品中，免疫球蛋白G抗原稀释液包括以下组分：终浓度为20mmol/L的PBS缓冲液、10‑50ml/L的动物血清、5‑10g/L的苯甲酸钠、0.5‑1ml/L的吐温，
溶液pH为7.2。

[0033] 通过采用上述技术方案，本申请进一步优化校准品和质控品中免疫球蛋白G抗原稀释液的组分，优化后的稀释液可以将免疫球蛋白G抗原稀释至合适的工作浓度，也可以为
免疫球蛋白G抗原提供一个稳定的工作环境，更好的与免疫球蛋白G多克隆抗体结合，从而
用于定标曲线的绘制以及试剂有效性的检测。

[0034] 可选的，反应体系中待测样本与试剂R1、试剂R2的体积比为3:240:60；检测主波长为600nm，副波长为800nm。

[0035] 通过采用上述技术方案，本申请进一步优化反应体系以及检测条件，在此反应体系和检测条件下对样本进行检测，具有较高的检测敏感性和特异性，更加适用于抗原含量
较低的样本的检测。

[0036] 综上所述，本申请具有以下有益效果：

[0037] 1、本申请通过对试剂R1的成分进行优化和改进，显著提高了试剂的灵敏度，检出限为0.2g/L，同时拓宽了试剂的线性范围，线性范围在0.2‑80g/L，使本申请的试剂盒能够
对低值样本进行检测，还能够使高值样本无需进行多次稀释便可直接进行检测，操作步骤
更加简单；

[0038] 2、本申请通过对试剂R2的成分进行优化和改进，明显提高了抗体稳定性，使试剂在长期的保存过程中不会出现大量浑浊，试剂能够稳定保存14个月，省去了试剂在使用之
前的过滤步骤，简化了检测步骤的同时提高了检测结果的准确性。

附图说明

[0039] 图1是本申请实施例1试剂盒线性相关性图；

[0040] 图2是本申请实施例2试剂盒线性相关性图。

具体实施方式

[0041] 以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。

[0042] 本申请的羊抗人免疫球蛋白G多克隆抗体购自北京达成生物技术有限公司；

[0043] 本申请的免疫球蛋白G抗原购自北京阿匹斯生物科技有限公司；

[0044] 本申请的全自动生化仪的型号为Hitachi7170；

[0045] 本申请的表面活性剂S9(TETRONIC 1307)购自Sigma‑Aldrich公司；

[0046] 本申请的马血清、鸡血清和牛血清购自Sigma‑Aldrich公司；

[0047] 本申请的免疫比浊法对照试剂购自北京百奥莱博科技有限公司。

[0048] 实施例1

[0049] 一种检测尿液中免疫球蛋白G的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；

[0050] 试剂R1的配置方法为：称取Tris碱2.42g、聚乙二醇6000 40g、聚乙烯吡咯烷酮30g、氯化钠9g、表面活性剂S9 1g、EDTA‑Na2 10g、苯甲酸钠5g，加水至950mL，调节溶液pH至
7.6，定容到1L，即为试剂R1。

[0051] 试剂R2的配置方法为：称取Tris碱2.42g、羊抗人免疫球蛋白G多克隆抗体100ml、马血清10ml、苯甲酸钠5g、海藻糖5g、EDTA‑Na2 10g、吐温20 0.5ml，加水至950mL，调节溶液
pH至7.6，定容到1L，即为试剂R2。

[0052] 免疫球蛋白G抗原稀释液的配置方法为：取10╳PBS溶液200mL、马血清50mL、苯甲酸钠5g，吐温1ml，加水至950mL，调节溶液pH至7.2，最后定容至1L。

[0053] 校准品稀释方法：

[0054] 将免疫球蛋白G抗原用稀释液分别稀释至80g/L、40g/L、20g/L、10g/L、5g/L、0g/L，共6个水平。

[0055] 质控品稀释方法：

[0056] 将免疫球蛋白G抗原用稀释液分别稀释至6g/L、12g/L，共2个水平。

[0057] 反应体系中加入试剂R1 240μL、试剂R2 60μL，待测样本3μL，采用全自动生化分析仪测定待测样本的吸光度，检测主波长为600nm，副波长为800nm，两点终点法读取16‑34两
点读数并计算。

[0058] 1.定标准曲线的绘制

[0059] 将校准品在全自动生化分析仪进行吸光度检测，具体的检测数据参见表1。

[0060] 表1定标曲线结果

[0061]水平 S1 S2 S3 S4 S5 S6
浓度(g/L) 0 5 10 20 40 80
吸光度变化值 41 1600 2907 4796 5607 6105

[0062] 2.线性度检测

[0063] 选择线性高值样本用低值样本稀释成80g/L、40g/L、20g/L、5g/L、2.5g/L、0.2g/L六水平；使用全自动生化分析仪每个样本检测三次，计算相对偏差和相关系数，具体的实验
结果参见表2。以理论浓度为横坐标，检测浓度的平均值为纵坐标，绘制线性相关性图，参见
图1。

[0064] 表2线性范围稀释

[0065]

[0066] 从表2和图1中可以看出，采用本实施例试剂盒对上述样本进行检测，得到的检测浓度与理论浓度非常相近，线性度非常好，线性范围在0.2‑80g/L之间，相关系数R≥0.990，
检测结果准确可靠。

[0067] 3.重复性检测

[0068] 使用全自动生化分析仪对两个浓度水平的质控品进行吸光度检测，每个浓度水平检测10次，计算标准偏差和变异系数，具体的实验结果参见表3。

[0069] 表3检测重复性

[0070] 理论值 6g/L 12g/L1次 6.02 11.83
2次 6.05 11.99
3次 6.04 11.75
4次 6.03 11.85
5次 6.10 11.95
6次 6.01 11.78
7次 6.06 11.85
8次 6.13 11.99
9次 6.05 11.95
10次 6.04 11.76
均值 6.05 11.87
SD 0.03 0.09
CV％ 0.57 0.75

[0071] 从表3可以看出，采用本实施例试剂盒对6g/L、12g/L样本进行重复检测，所得结果的变异系数CV＜5％，符合要求，重复性优异，检测结果的准确度高。

[0072] 4.稳定性检测

[0073] 将本实施例的试剂R1、试剂R2和校准品在2‑8℃中进行储存，每三个月定标一次，记录各浓度校准品和试剂空白的吸光度变化值，实验结果参见表4。

[0074] 表4长期稳定性数据结果

[0075]

[0076]

[0077] 从表4可以看出，本试剂盒的试剂R1、试剂R2和校准品在2‑8℃中储存420天，每个水平校准品和试剂空白的吸光度变化与最初配制时相比，相对偏差均在10％以内，而且试
剂R2中没有出现明显的絮状沉淀，试剂稳定性好，长期储存后无需进行过滤便可直接使用，
抗体性能不会受到影响，检测结果的线性度、重复性保持在较高水平，试剂盒的使用有效期
较长。

[0078] 5.灵敏度实验

[0079] 灵敏度实验的目的是检测试剂盒的试剂在测试生理盐水以及一定浓度的临床样本时的吸光度变化值。

[0080] 采用本实施例的试剂盒和对照试剂(免疫比浊法)测定0.9％的生理盐水和5g/L的临床样本(尿样)的吸光度变化值，每个样本测试3次，实验结果参见表5。

[0081] 表5试剂灵敏度对比

[0082]

[0083] 从表5可以看出，采用本实施例试剂盒对生理盐水进行测定，吸光度变化值为39(10000A)；对理论浓度为5g/L尿液样本进行测定时，吸光度变化值为1620(10000A)。而采用
对照试剂对生理盐水进行测定，吸光度变化值为91(10000A)；对理论浓度为5g/L尿液样本
进行测定时，吸光度变化值为572(10000A)。本申请试剂盒检测临床样本吸光度变化值与空
白对照信号值差别较大，对于低值部分检测结果更灵敏，而采用对照试剂检测临床样本吸
光度变化值与空白对照信号值差别小或接近，对于低值部分容易检出0值。所以，本申请试
剂盒灵敏度要显著高于普通免疫比浊试剂。

[0084] 实施例2

[0085] 一种检测尿液中免疫球蛋白G的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；

[0086] 试剂R1的配置方法为：称取Tris碱6.057g、聚乙二醇4000 50g、聚乙烯吡咯烷酮40g、氯化钠9g、表面活性剂S9 2g、EDTA‑Na2 20g、苯甲酸钠10g，加水至950mL，调节溶液pH
至7.2，定容到1L，即为试剂R1。

[0087] 试剂R2的配置方法为：称取Tris碱6.057g、羊抗人免疫球蛋白G多克隆抗体200ml、牛血清50ml、苯甲酸钠10g、海藻糖3g、EDTA‑Na2 20g、吐温80 1ml，加水至950mL，调节溶液
pH至7.2，定容到1L，即为试剂R2。

[0088] 免疫球蛋白G抗原稀释液的配置方法为：取10╳PBS溶液200mL、牛血清10mL、苯甲酸钠10g，吐温0.5ml，加水至950mL，调节溶液pH至7.2，最后定容至1L。

[0089] 校准品稀释方法：

[0090] 将免疫球蛋白G抗原用稀释液分别稀释至80g/L、40g/L、20g/L、10g/L、5g/L、0g/L，共6个水平。

[0091] 质控品稀释方法：

[0092] 将免疫球蛋白G抗原用稀释液分别稀释至6g/L、12g/L，共2个水平。

[0093] 反应体系中加入试剂R1 240μL、试剂R2 60μL，待测样本3μL，采用全自动生化分析仪测定待测样本的吸光度，检测主波长为600nm，副波长为800nm，两点终点法读取16‑34两
点读数计算。

[0094] 1.定标准曲线的绘制

[0095] 将校准品在全自动生化分析仪进行吸光度检测，具体的检测数据参见表1。

[0096] 表6定标曲线结果

[0097] 水平 S1 S2 S3 S4 S5 S6浓度(g/L) 0 5 10 20 40 80
吸光度变化值 41 2650 3921 4986 6087 8034

[0098] 2.线性度检测

[0099] 选择线性高值样本用低值样本稀释成80g/L、60g/L、30g/L、10g/L、2g/L、0.2g/L六水平；使用全自动生化分析仪每个样本检测三次，计算相对偏差和相关系数，具体的实验结
果参见表7。以理论浓度为横坐标，检测浓度的平均值为纵坐标，绘制线性相关性图，参见图
2。

[0100] 表7线性范围稀释

[0101]

[0102]

[0103] 从表7和图2中可以看出，采用本实施例试剂盒对待测样本进行检测，得到的检测浓度与理论浓度非常相近，线性度非常好，线性范围在0.2‑80g/L之间，相关系数R≥0.990，
满足线性要求，检测结果准确可靠。

[0104] 3.重复性检测

[0105] 使用全自动生化分析仪对两个浓度水平的质控品进行吸光度检测，每个浓度水平检测10次，计算标准偏差和变异系数，具体的实验结果参见表8。

[0106] 表8检测重复性

[0107]理论值 6g/L 12g/L
1次 6.12 12.02
2次 6.13 12.12
3次 6.08 12.03
4次 6.13 12.09
5次 6.09 12.03
6次 6.01 12.12
7次 6.16 12.13
8次 6.03 12.09
9次 6.15 12.08
10次 6.14 11.98
均值 6.10 12.07
SD 0.05 0.05
CV％ 0.79 0.40

[0108] 从表8可以看出，采用本实施例试剂盒对6g/L、12g/L样本进行重复检测，所得结果的变异系数CV＜5％，符合要求，重复性优异，检测结果的准确性较高。

[0109] 4.检出限确定

[0110] 采用本实施例试剂盒检测5份浓度在0.2‑0.3g/L之间的低值样本，每份样本检测5次，对检测结果进行统计，低于空白限0.08g/L的检测结果数量应小于等于3个，且无高于
0.5g/L的检测结果，具体统计结果参见表9。

[0111] 表9检测限检测结果

[0112]  1次 2次 3次 4次 5次
样本1 0.21 0.2 0.19 0.18 0.19
样本2 0.21 0.18 0.17 0.16 0.17
样本3 0.19 0.21 0.2 0.18 0.17
样本4 0.21 0.2 0.19 0.18 0.16
样本5 0.05 0.2 0.18 0.17 0.16

[0113] 从表9可以看出，采用本实施例试剂盒对5份低值样本进行检测，每份样本检测5次，检测结果中，低于空白限0.08g/L的检测结果数量为0个，满足小于等于3个的要求，同时
无高于0.5g/L的检测结果，检测结果符合要求。所以，本实施例试剂盒的检出限不高于
0.2g/L，检测灵敏度较高，即使当待测样本中抗原量较低，抗原抗体结合物较少，形成浊度
程度较轻时，本申请试剂盒依旧能够检测出待测样本中IgG的含量，可以有效避免检测结果
假阴性，从而耽误患者病情的情况的发生。

[0114] 本具体实施方式的实施例均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之
内。