一种甲型流感病毒通用DNA疫苗及其构建方法

摘要

本发明公开了一种甲型流感病毒通用DNA疫苗及其构建方法，属于基因工程技术领域。所述DNA疫苗包括基因构建体、载体和递送系统，所述基因构建体插入所述载体构建表达质粒，所述递送系统包被所述表达质粒构成甲型流感病毒通用DNA疫苗，其中，所述基因构建体是由四种不同亚型甲型流感病毒的保守序列M2e基因串联组合而成，所述递送系统为细胞穿透肽。该疫苗将甲型流感病毒M2蛋白胞外区、通用疫苗和DNA疫苗的优势结合，可以有效预防和控制不同亚型甲型流感病毒，具有重要的科学意义和社会价值。

权利要求

1.一种甲型流感病毒通用DNA疫苗，其特征在于，包括基因构建体、载体和递送系统，所述基因构建体插入所述载体构建表达质粒，所述递送系统包被所述表达质粒构成甲型流感病毒通用DNA疫苗，其中，所述基因构建体是由四种不同亚型甲型流感病毒的保守序列M2e基因串联组合而成，所述递送系统为细胞穿透肽；

所述甲型流感病毒的四种不同亚型为H1亚型、H3亚型、H5亚型和H9亚型；

所述表达质粒：所述细胞穿透肽按照质量比为1：20混合，实现包被；

所述基因构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述细胞穿透肽包括RVG9dR和Protamine至少一种。

2.如权利要求1所述的甲型流感病毒通用DNA疫苗，其特征在于，所述细胞穿透肽是由RVG9dR和Protamine按质量比(1‑3)：(1‑3)混合而成。

3.一种如权利要求1‑2任一项所述的甲型流感病毒通用DNA疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将四种不同亚型甲型流感病毒的保守序列M2e基因串联，形成基因构建体；

将所述基因构建体转入真核表达载体构建表达质粒；

用细胞穿透肽包被所述表达质粒，构建甲型流感病毒通用DNA疫苗。

4.如权利要求3所述的甲型流感病毒通用DNA疫苗的构建方法，其特征在于，所述基因构建体还包括组织纤溶酶原激活物tPA的分泌序列，所述分泌序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

说明书

一种甲型流感病毒通用DNA疫苗及其构建方法

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，涉及一种甲型流感病毒通用DNA疫苗及其构建方法。

背景技术

[0002] 流感是由流感病毒感染引起的一种严重的急性呼吸道传染病。每年在全球造成人和动物的大量死亡，给全球的公共卫生健康以及经济发展带来了严重的威胁。流感病毒根据病毒核衣壳蛋白(NP)和基质蛋白M的特征，可将其分为甲、乙、丙三种亚型，其中甲型流感病毒(Influenza A virus)是目前流行最广和影响最深远的流感病毒。甲型流感病毒其基因特性使其经常发生不可预测的变异，因此，对于甲型流感病毒的研究与防制不容忽视。

[0003] 预防和控制甲型流感的最有效方法是接种疫苗，目前可获得的大多数甲型流感疫苗是亚型特异性的，甲型流感病毒又极易发生变异出现新变异株，并且不能保护患者免受其他病毒亚型的影响，这大大限制了疫苗的适用性和有效性。开发新型通用甲型流感疫苗可以提供较为广泛的保护。其中，DNA疫苗是根据实验需求利用分子生物学技术进行设计，与减毒疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗等传统疫苗相比具有较强的可控性。通过设计安全、高效的递送载体有助于DNA疫苗顺利靶向免疫细胞，提高其免疫效力。因此，基于现有技术中甲型流感病毒疫苗存在的问题，设计一种新型的通用性甲型流感疫苗非常必要。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种甲型流感病毒通用DNA疫苗及其构建方法，该疫苗将甲型流感病毒M2蛋白胞外区、通用疫苗和DNA疫苗的优势结合，可以有效预防和控制甲型流感病毒。

[0005] 为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

[0006] 本发明提供了一种甲型流感病毒通用DNA疫苗，包括基因构建体、载体和递送系统，所述基因构建体插入所述载体构建表达质粒，所述递送系统包被所述表达质粒构成甲型流感病毒通用DNA疫苗，其中，所述基因构建体是由四种不同亚型甲型流感病毒的保守序列M2e基因串联组合而成，所述递送系统为细胞穿透肽。

[0007] 优选的是，所述基因构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

[0008] 优选的是，所述甲型流感病毒的四种不同亚型为H1亚型、H3亚型、H5亚型和H9亚型。

[0009] 优选的是，所述表达质粒：所述细胞穿透肽按照质量比为(1：10)‑(1：20)混合，实现包被。

[0010] 优选的是，所述细胞穿透肽包括RVG9dR和Protamine至少一种。

[0011] 优选的是，所述细胞穿透肽是由RVG9dR和Protamine按质量比(1‑3)：(1:3)混合而成。

[0012] 优选的是，所述疫苗为预防甲型流感病毒通用DNA疫苗。

[0013] 本发明还提供一种所述的甲型流感病毒通用DNA疫苗的构建方法，包括以下步骤：

[0014] 将四种不同亚型甲型流感病毒的保守序列M2e基因串联，形成基因构建体；

[0015] 将所述基因构建体转入真核表达载体构建表达质粒；

[0016] 用细胞穿透肽包被所述表达质粒，构建甲型流感病毒通用DNA疫苗。

[0017] 优选的是，所述基因构建体还包括组织纤溶酶原激活物tPA的分泌序列，所述分泌序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

[0018] 本发明公开了以下技术效果：

[0019] 本发明通过将H1、H3、H5、H9亚型流感病毒的M2e序列串联(4M2e)基因片段克隆到真核表达载体，构建出真核表达质粒，然后通过筛选，以最佳细胞穿透肽包被适量的DNA进行小鼠免疫实验，发现对甲型流感病毒H1N1和H9N2均具有高保护效力。本发明将甲型流感病毒胞外区、通用疫苗和DNA疫苗的优势结合，设计基于甲型流感病毒M2胞外区的通用DNA疫苗，该疫苗可以有效的预防和控制甲型流感病毒，具有重要的科学意义和社会价值。

附图说明

[0020] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0021] 图1为目的基因4M2e的设计结构图；

[0022] 图2为目的片段4M2e的凝胶电泳图；

[0023] 图3为三种细胞穿透肽的凝胶阻滞实验凝胶电泳图；A为实施例2实验一组的凝胶阻滞实验凝胶电泳图，2‑6分别为按照1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8的比例将pVax1‑4M2e与RVG(9dR)混合，1为对照；B为实施例2实验二组的凝胶阻滞实验凝胶电泳图，2‑6分别为按照1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8的比例将pVax1‑4M2e与Protamine混合，1为对照；C为实施例2实验三组的凝胶阻滞实验凝胶电泳图，2‑8分别为按照1:0.125、1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8的比例将pVax1‑4M2e与细胞穿透肽复合物RVG(9dR)+Protamine混合液混合，1为对照；

[0024] 图4为pVax1‑EGFP：细胞穿透肽RVG9dR的重量比分别为1:2、1:4、1:8、1:10、1:20(对应A‑E；F为阴性对照)进行转染后随机拍摄的荧光图；

[0025] 图5为细胞穿透肽RVG9dR不同实验组随机拍摄的荧光图荧光强度分析图；横坐标1‑5分别代表pVax1‑EGFP：细胞穿透肽RVG9dR的重量比分别为1:2、1:4、1:8、1:10、1:20；纵坐标为荧光强度；

[0026] 图6为pVax1‑EGFP：细胞穿透肽Protamine的重量比分别为1:2、1:4、1:8、1:10、1:20(对应A‑E；F为阴性对照)进行转染后随机拍摄的荧光图；

[0027] 图7为细胞穿透肽Protamine不同实验组随机拍摄的荧光图荧光强度分析；横坐标1‑5分别代表pVax1‑EGFP：细胞穿透肽Protamine的重量比分别为1:2、1:4、1:8、1:10、1:20；
纵坐标为荧光强度；

[0028] 图8为pVax1‑EGFP：细胞穿透肽复合物RVG9dR+protamine的重量比分别为1：1、1:2、1:4、1:8、1:10、1:20(对应A‑F；G为阴性对照)进行转染后随机拍摄的荧光图；

[0029] 图9为细胞穿透肽复合物RVG9dR+protamine不同实验组随机拍摄的荧光图进行荧光强度分析；横坐标1‑6分别代表pVax1‑EGFP：细胞穿透肽Protamine的质量比分别为1:1、1:2、1:4、1:8、1:10、1:20；纵坐标为荧光强度；

[0030] 图10为H1N1攻毒组的小鼠21d内小鼠的体重变化情况以及存活率；A为体重变化，B为存活率；

[0031] 图11为H9N2攻毒组的小鼠21d内小鼠的体重变化情况以及存活率；A为体重变化，B为存活率。

具体实施方式

[0032] 现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0033] 下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

[0034] 实施例1构建质粒pVAX1‑4M2e

[0035] 根据4种亚型甲型流感病毒的M2e的核苷酸序列通过一种组合策略设计通用DNA疫苗的目的基因4M2e序列。

[0036] 首先，将H9亚型、H1亚型、H3亚型和H5亚型的基因串联组合形成一个基因构建体，并进行密码子优化后，将所设计的基因构建体与组织纤溶酶原激活物(tPA)的分泌序列(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)结合，进一步改善目的蛋白的分泌(如图1)。

[0037] 利用PCR技术进行目的片段4M2e的扩增，扩增引物为：

[0038] 上游引物序列：AATCGAATTCATGGATGCAATGAAGAGAGG

[0039] 下游引物序列：AATCCTCGAGTCAATCAGAGGAGTAGTGTCACTAC

[0040] 目的基因4M2ePCR扩增体系如表1所示：

[0041] 表1

[0042]

[0043] 目的基因4M2e的PCR反应程序如表2所示：

[0044] 表2

[0045]

[0046]

[0047] 扩增产物用2％琼脂凝胶进行电泳，结果如图2所示，在378bp出现亮条带，与预期片段长度相同。其中，新合成的目的片段4M2e的DNA序列(SEQ ID NO：1)为：

[0048] atggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtttcgcccagccaggaatcttcaagtcttctaaccgaggtcgaaacgcttaccagaaccggatgggggtgcaactgcagcggttcaagtgattccctgctgacagaggtggaaacccctacaaggtccgagtgggaatgccgctgttctgactctagtgatgcagccgctagcctgctgactgaggtggaaaccccaattcgaaacgagtggggctgccggtgtaatgactcaagcgatgcagccgcttctctgctgaccgaagtggaaactcccaccagaaacgagtgggaatgcaggtgtagtgactcctctgattga

[0049] 回收PCR产物，并将PCR胶回收的4M2e目的片段和真核表达质粒pVAX1使用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行酶切；利用T4 DNA Ligase连接以上两个酶切片段，构建质粒pVAX1‑4M2e。

[0050] 实施例2凝胶阻滞实验

[0051] 实验分为如下三组：

[0052] 实验一组：从‑20℃中将储存浓度为1mg/mL的细胞穿透肽RVG(9dR)(上海生工生物工程股份有限公司)取出提前放入冰盒上自然融化，然后从大量提取的pVax1‑4M2e真核表达质粒中取出1μg，按照1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8的比例与RVG(9dR)配置好混合液，用移液枪轻轻吹打混匀，室温下静置20min，使其充分结合。

[0053] 实验二组：从‑20℃中将储存浓度为1mg/mL的细胞穿透肽Protamine(上海生工生物工程股份有限公司)取出提前放入冰盒上自然融化，然后从大量提取的pVax1‑4M2e真核表达质粒中取出1μg，按照1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8的比例与Protamine配置好混合液，用移液枪轻轻吹打混匀，室温下静置20min,使其充分结合。

[0054] 实验三组：从‑20℃中将储存浓度为1mg/mL的细胞穿透肽RVG(9dR)和Protamine取出提前放入冰盒上自然融化，使细胞穿透肽RVG(9dR)和Protamine按质量比1：1先结合形成多肽混合物，然后从大量提取的pVax1‑4M2e真核表达质粒中取出1μg，按照1:0.125、1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8的比例与多肽复合物配置好混合液，用移液枪轻轻吹打混匀，室温下静置20min，使其充分结合。

[0055] 将上述三组实验组进行1％的琼脂糖电泳，120V，200mA，30min，利用紫外凝胶成像系统观察。结果如图3所示：DNA与RVG9dR最适合结合比例为1:2，DNA与Protamine的最适合结合比例为1:2，DNA与RVG9dR+protamine的最适合结合比例是1:1。

[0056] 实施例3细胞转染实验

[0057] 细胞培养：293T细胞培养在含有10％胎牛血清的(Fetal Bovine Serum，FBS)和1％双抗(Penicillin‑Streptomycin Solution，PS)的DMEM培养液于37℃培养箱培养。(培养基和血清均购自Biological Industries公司)。

[0058] 转染：将293T细胞铺在6孔细胞培养板中，每孔1×106个细胞，待其长成均匀的单层细胞，次日进行后续转染实验。

[0059] 以质粒DNA(pVAX1‑EGFP)为模型进行细胞转染实验，从细胞荧光及荧光强度来判断3种细胞穿透肽在细胞水平上对质粒DNA递送效果。具体步骤如下：

[0060] (1)将6孔板中各个孔内的原细胞培养液弃掉，并用磷酸盐缓冲液PBS液清洗1‑2次。

[0061] (2)6孔板每孔中需在加入2mL Opti‑MEM培养基，置于37℃、5％CO2细胞培养箱。

[0062] (3)取出1.5mL灭菌后的离心管，按照所需实验计划分成四组，每个1.5mL离心管需要加入100μLOpti‑MEM无血清培养基。

[0063] (4)实验分组：

[0064] 第一组：1‑5号离心管中分别加入1μg pVax1‑EGFP，相对应的6‑10号离心管中分别加入RVG(9dR)2μg、4μg、8μg、10μg、20μg，室温静置5min后将1‑5号离心管中的试剂加入到相应的6‑10号离心管中，轻轻地吹打混匀，室温静置20‑30min。

[0065] 第二组：1‑5号离心管中分别加入1μg pVax1‑EGFP，相对应的6‑10号离心管中分别加入protamine 2μg、4μg、8μg、10μg、20μg，室温静置5min后将1‑5号离心管中的试剂加入到相应的6‑10号离心管中，轻轻地吹打混匀，室温静置20‑30min。

[0066] 第三组：1‑5号离心管中分别加入1μg pVax1‑EGFP，相对应的6‑10号离心管中分别加入(RVG9dR+protamine)1μg、2μg、4μg、8μg、10μg、20μg，室温静置5min后将1‑5号离心管中的试剂加入到相应的6‑10号离心管中，轻轻地吹打混匀，室温静置20‑30min。

[0067] (5)取出6孔板，做好标记，每孔加入相应的混合液，预留一个细胞培养孔不做处理将其作为空白对照，于37℃、5％CO2培养箱中培养。

[0068] (6)培养6‑8h后，将6孔板中的Opti‑MEM无血清培养基替换成DMEM细胞培养基，继续培养24h，利用荧光倒置显微镜观察荧光并利用ImageJ软件进行荧光强度分析。

[0069] 如图4和图5所示，结果显示随着穿透肽RVG9dR质量比逐渐增加，细胞转染后细胞荧光及荧光强度越高，其与质粒DNA的结合效果越明显，且质粒DNA与细胞穿透肽RVG9dR在质量比1:20处结合效果最好。

[0070] 如图6和图7所示，结果显示随着穿透肽Protamine质量比逐渐增加，细胞转染后细胞荧光及荧光强度越高，其与质粒DNA的结合效果越明显，且质粒DNA与细胞穿透肽Protamine在质量比1:20处结合效果最好。

[0071] 如图8和图9所示，结果显示随着细胞穿透肽复合物(RVG9dR+Protamine)质量比逐渐增加，细胞转染后细胞荧光及荧光强度越高，其与质粒DNA的结合效果越明显，且质粒DNA与细胞穿透肽复合物(RVG9dR+Protamine)在质量比1:20处结合效果最好。

[0072] 综上所述，以质粒DNA(pVAX1‑EGFP)为模型进行的三组细胞转染试验，从细胞荧光及荧光强度结果得出：随着细胞穿透肽RVG9dR、Protamine以及(RVG9dR+Protamine)质量比逐渐增加(1:2、1:4、1:8、1:10、1:20)，其与质粒DNA的结合效果越明显，并且细胞穿透肽复合物(RVG9dR+Protamine)的效果最佳，其中质粒DNA与细胞穿透肽(RVG9dR+Protamine)在质量比1:20处结合效果最好。

[0073] 实施例4DNA疫苗免疫小鼠

[0074] 根据细胞转染实验结果得出，(RVG9dR+Protamine)多肽包被DNA的效果较好，且质量比1:20的效果最好。按照DNA：RVG9dR+Protamine多肽质量比为1:20进行小鼠免疫实验。实验共8组BALB/c小鼠，8只/每组，按照以下实验分组操作。

[0075] 第一组(25ug pVax1‑4M2e+500ug多肽免疫组，PR8 H1N1攻毒组)：一次免疫肌注小鼠25ug pVax1‑4M2e+500ug(RVG9dR+Protamine)，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的PR8 H1N1病毒原液稀释1000倍滴鼻，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。

[0076] 第二组(25ug pVax1‑4M2e+500ug多肽免疫组，WM01‑p15 H9N2攻毒组)：一次免疫肌注小鼠25ug pVax1‑4M2e+500ug(RVG9dR+Protamine)，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的WM01‑p15 H9N2代病毒原液稀释1000倍滴鼻，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。

[0077] 第三组(50ug pVax1‑4M2e+1000ug多肽免疫组，PR8 H1N1攻毒组)：一次免疫肌注小鼠50ug pVax1‑4M2e+1000ug(RVG9dR+Protamine)，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的PR8 H1N1病毒原液稀释1000倍滴鼻，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。

[0078] 第四组(50ug pVax1‑4M2e+1000ug多肽免疫，WM01‑p15 H9N2攻毒组)：一次免疫肌注小鼠50ug pVax1‑4M2e+1000ug(RVG9dR+Protamine)，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的WM01‑p15 H9N2代病毒原液稀释1000倍进行攻毒，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。

[0079] 第五组(25ug载体pVax1免疫+500ug多肽免疫组、PR8 H1N1攻毒组)：一次免疫肌注小鼠25ug pVax1+500ug(RVG9dR+Protamine)，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的PR8 H1N1病毒原液稀释1000倍进行攻毒，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。

[0080] 第六组(25ug载体pVax1免疫+500ug多肽免疫组、WM01‑p15 H9N2攻毒组)：一次免疫肌注小鼠25ug pVax1+500ug(RVG9dR+Protamine)，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的WM01‑p15 H9N2代病毒原液稀释1000倍进行攻毒，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。

[0081] 第七组(PR8 H1N1免疫组)：将实验室保存的PR8 H1N1病毒原液稀释500万倍，滴鼻免疫小鼠(50μL/只)一次，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的PR8 H1N1病毒原液稀释1000倍进行攻毒，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。

[0082] 第八组(WM01‑p15 H9N2免疫组)：将实验室WM01‑p15 H9N2病毒原液稀释100万倍，滴鼻免疫小鼠(50μL/只)一次，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的WM01‑p15 H9N2病毒原液稀释1000倍进行攻毒，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。

[0083] H1N1攻毒组和H9N2攻毒组21d内小鼠的存活率和体重变化情况，如图10和11所示。从图10A和B可以看出，PR8 H1N1免疫组感染PR8 H1N1后，小鼠体重无明显变化；25μg pVax1‑4M2e+500μg(RVG9dR+Protamine)免疫组和50μgpVax1‑4M2e+1000μg(RVG9dR+Protamine)免疫组在感染PR8 H1N1后，小鼠临床表现较明显，被毛粗乱、呼吸急促、弯腰驼背、活动迟缓、扎堆聚集以及体重下降等症状；25μg pVax1‑4M2e+500μg(RVG9dR+Protamine)免疫组，有4只小鼠死亡，剩余小鼠攻毒后第7天后体重又开始回升；50μg pVax1‑4M2e+1000μg(RVG9dR+Protamine)免疫组，未出现小鼠死亡，6‑7d后体重开始逐渐回升；25μg载体pVax1+500μg(RVG9dR+Protamine)免疫组在感染PR8 H1N1后，小鼠临床表现明显，体重急剧下降，5d内小鼠全部死亡。(P值<0.0001，体重百分比下降>25％人为判定其死亡)。

[0084] 从图11A、B可看出，WM01‑p15 H9N2免疫组感染WM01‑p15 H9N2后，未发生小鼠死亡，小鼠体重无明显变化；25μg pVax1‑4M2e+500μg(RVG9dR+Protamine)免疫组和50μg pVax1‑4M2e+1000μg(RVG9dR+Protamine)免疫组在感染WM01‑p15H9N2后，小鼠临床表现也较明显，被毛粗乱、呼吸急促、弯腰驼背、活动迟缓、扎堆聚集以及体重下降等症状；25μg pVax1‑4M2e+500μg(RVG9dR+Protamine)免疫组，有1只小鼠死亡，其余小鼠攻毒后第7d起体重开始回升；50μg pVax1‑4M2e+1000μg(RVG9dR+Protamine)免疫组，无小鼠死亡，攻毒后第7d后体重逐渐回升；25μg载体pVax1+500μg多肽复合物免疫组在感染WM01‑p15 H9N2后，小鼠临床表现明显，体重急剧下降，8d内小鼠全部死亡。(P值<0.0001，体重百分比下降>25％人为判定其死亡)。

[0085] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。