一种降解阴离子表面活性剂的脂环酸芽孢杆菌及应用

摘要

本发明公开了一种降解阴离子表面活性剂的脂环酸芽孢杆菌，该脂环酸芽孢杆菌为脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus aeris)A‑YW，于2021年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，菌种保藏号为CCTCC M 2021451，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。本发明通过对从采集自洗涤剂生产厂家污水出口处的污泥分离，获得脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus aeris)A‑YW，经过阴离子表面活性剂的降解试验表明该菌株对阴离子表面活性有很好的降解作用，是一株在污水治理上具有潜在意义的环保菌株，具有降解效率高、降解速率快等特点，为我国环境保护提供帮助。

权利要求

1.一种降解阴离子表面活性剂的脂环酸芽孢杆菌，其特征在于：该脂环酸芽孢杆菌为脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus aeris)A‑YW，于2021年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2021451。

2.一种根据权利要求1所述的降解阴离子表面活性剂的脂环酸芽孢杆菌在高效降解生活污水中阴离子表面活性剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的降解阴离子表面活性剂的脂环酸芽孢杆菌在高效降解生活污水中阴离子表面活性剂中的应用，其特征在于：将培养至对数期的A‑YW菌种子液接种到生活污水进行阴离子表面活性剂降解处理。

4.根据权利要求3所述的降解阴离子表面活性剂的脂环酸芽孢杆菌在高效降解生活污水中阴离子表面活性剂中的应用，其特征在于：挑取活化的菌落，接种于种子培养基中，随后将A‑YW菌于30℃、200rpm培养3d使其生长处在对数期，制备成种子液。

5.根据权利要求4所述的降解阴离子表面活性剂的脂环酸芽孢杆菌在高效降解生活污水中阴离子表面活性剂中的应用，其特征在于：所述种子培养基每升含有0.5g蛋白胨、0.5g蔗糖、0.2g K2HPO4、0.1g MgSO4·7H2O、0.1g (NH4)2SO4、0.001g FeSO4·7H2O、0.02g CaCl2，pH 6.0，121℃ 20min高压灭菌。

6.根据权利要求4所述的降解阴离子表面活性剂的脂环酸芽孢杆菌在高效降解生活污水中阴离子表面活性剂中的应用，其特征在于：所述A‑YW菌种子液接种量为1％～3％。

7.根据权利要求6所述的降解阴离子表面活性剂的脂环酸芽孢杆菌在高效降解生活污水中阴离子表面活性剂中的应用，其特征在于：所述A‑YW菌种子液接种量为1％。

说明书

一种降解阴离子表面活性剂的脂环酸芽孢杆菌及应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种用于环境保护的菌种，具体涉及脂环酸芽孢杆菌A‑YW株(Alicyclobacillus aeris)及其在降解生活污水中阴离子表面活性剂中的应
用。

背景技术

[0002] 生活污水中的表面活性剂主要包括洗涤衣物的肥皂、洗衣粉和洗涤碗筷的洗洁净等中的阴离子表面活性剂如硬脂酸钠、十二烷基苯磺酸钠和辛基酚环氧乙烷聚合物等物
质。近年来，随着人们生活水平的不断提高，人口的不断增加，大量生活中的污水以不同方
法排入水体，给江河水源造成了不同程度的污染，其中污水中的阴离子表面活性剂对江河
环境的污染已引起人们的普遍关注。阴离子表面活性剂对江河和周边环境的影响主要体现
在以下几个方面：(1)大量的阴离子表面活性剂排入江河后，会使江河水面产生大量的泡
沫，这非但有碍观瞻，且妨碍了水体表面与空气中氧的交换，影响到水体的自净速率。(2)阴
离子表面活性剂对水中的微生物、水藻、水草和鱼等都会产生不同的危害。当水中含有1mg/
L的阴离子表面活性剂时，会阻断绿色植物的生长，当含有6～7mg/L的阴离子表面活性剂
时，就会导致鱼类中毒。(3)阴离子表面活性剂可通过饮水、洗涤或其他渠道进入人体，与人
体组织内的蛋白质形成新的复合体，使人诱发癌变。随着人们对洗涤剂消费的增大，洗涤剂
对江河环境的污染程度也越来越严重，因而去除江河和周边环境中的洗涤剂污染已成为广
大环境保护工作者的重大任务和研究课题。

[0003] 目前常用的治理此类废水的方法主要有活性炭吸附法、泡沫分离法、光催化氧化法、超声降解法、膜过滤技术、化学絮凝法和微生物法等。这些方法在治理此类废水时虽然
都有不同程度的应用，但都存在一定的局限性，需要进一步改进：活性炭吸附法在常温下吸
附效果较好，但活性炭再生能耗大，且再生后吸附能力会有不同程度的降低，限制了它的应
用。泡沫分离法工艺简单、操作简便、运行稳定，但此法在处理过程中会造成阴离子表面活
性剂的转移，污染空气，同时会使致病菌也一起扩散，从而增加流行病的危险性。光催化氧
化法在处理过程中需要不断向其中曝气，以保证提供充分的溶解氧，运行成本较高。超声降
解法的降解能力受pH影响较大，降解程度随超声作用的功率、作用时间的增加而增加。膜过
滤技术分离效率高、过程简单，但膜价昂贵且容易堵塞。化学絮凝法对阴离子表面活性剂具
有一定的处理效果，但在处理过程中，需要以氧化钙作为助凝剂，且会产生废渣和污泥，处
理不当会造成二次污染。微生物法处理的投资和运行费用较低，但其应用的条件和可供选
择的微生物有限，且低浓度的阴离子表面活性剂会引起微生物的增殖，高浓度的阴离子表
面活性剂会抑制生物的增长。生物处理技术是利用微生物的代谢作用将有机污染物分解为
CO2和H2O，或者有机酸和醇等，从而达到净化污水的目的。与物理化学方法相比，生物处理法
费用低廉，同时用于污水处理的微生物繁殖快，容易培养，适应不同种类废水环境的能力
强。在生物处理技术领域通常对高效降解生活污水中特征污染物的菌株进行筛选，以实现
对污水的生物降解处理。因此寻找能够高效降解生活污水中阴离子表面活性剂的菌株具有
重要意义。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供了一种高效降解阴离子表面活性剂的脂环酸芽孢杆菌。

[0005] 为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种降解阴离子表面活性剂的脂环酸芽孢杆菌，其中：该脂环酸芽孢杆菌为脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus aeris)A‑
YW，于2021年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，菌种保藏号为CCTCC M 
2021451，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。

[0006] 进一步地，所述脂环酸芽孢杆菌分离于高浓度阴离子表面活性剂污水，经形态学、培养性状、常规生理生化化和DNA序列鉴定，该菌株为脂环酸芽孢杆菌的变种，是脂环酸芽
孢杆菌的一个新菌株，命名为脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus aeris)A‑YW。

[0007] 进一步地，脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus aeris)A‑YW的基本生物学特性为：

[0008] 菌株在平板TYS培养基上形成的菌落均呈乳白色，边缘较整齐，湿润，中心稍凸起，有光泽，有同心圆，半透明，不易挑起，圆形。从扫描电镜照片中可以看出细菌的呈杆状，在
培养基中培养3天后，大部分菌体都产生了芽孢，芽孢端生或次端生，并使菌体细胞膨大，菌
体宽0.3～0.8um，长2.0～6.0um，如图1所示。

[0009] 本发明的另一目的在于提供降解阴离子表面活性剂的脂环酸芽孢杆菌在高效降解生活污水中阴离子表面活性剂中的应用。

[0010] 进一步地，含有所述脂环酸芽孢杆菌活性成分的生物制剂也可以应用在高效降解生活污水中阴离子表面活性剂。该生物制剂可以包含生物制剂制备的常用载体和辅料。

[0011] 进一步地，将培养至对数期的A‑YW菌种子液接种到生活污水进行阴离子表面活性剂降解处理。

[0012] 进一步地，挑取活化的菌落，接种于种子培养基中，随后将A‑YW菌于30℃、200rpm培养3d使其生长处在对数期，制备成种子液。

[0013] 进一步地，所述种子培养基每升含有0.5g蛋白胨、0.5g蔗糖、0.2g K2HPO4、0.1g MgSO4·7H2O、0.1g(NH4)2SO4、0.001g FeSO4·7H2O、0.02g CaCl2，pH 6.0，121℃20min高压
灭菌。

[0014] 进一步地，所述A‑YW菌种子液接种量为1％～3％。

[0015] 进一步地，所述A‑YW菌种子液接种量为1％。

[0016] 本发明通过直接将培养好的脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus aeris)A‑YW接入含阴离子表面活性剂生活污水中检测脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus aeris)A‑YW
对阴离子表面活性剂的降解作用，实验结果表明脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus 
aeris)A‑YW对阴离子表面活性剂有降解作用。表明该菌株是一株在治理含阴离子表面活性
剂生活污水上具有潜在意义的环境治理菌株。

[0017] 本发明通过对从采集自洗涤剂生产厂家污水出口处的污泥分离，获得脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus aeris)A‑YW，经过阴离子表面活性剂的降解试验表明该菌株对阴
离子表面活性有很好的降解作用，是一株在污水治理上具有潜在意义的环保菌株，具有降
解效率高、降解速率快等特点，为我国环境保护提供帮助。

附图说明

[0018] 图1为本发明降解阴离子表面活性剂的脂环酸芽孢杆菌菌株的扫描电镜照片。

具体实施方式

[0019] 下面对本发明的实施案例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实
施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建
议的条件。

[0020] 一、菌株的筛选及其鉴定

[0021] 筛选高效降解生活污水中阴离子表面活性剂污染物的菌株方法，包括以下步骤：

[0022] 1、菌种的分离

[0023] (1)称取污泥样品1g于含有9ml无菌水的三角瓶中振荡得悬液；

[0024] (2)分别接种10ml悬液，于250ml三角瓶内装90ml富集培养液中30℃200rpm摇床振荡培养。富集培养基每升含有0.05g酵母提取物，0.3g K2HPO4·2H2O，0.15g KH2PO4，0.025g 
MgSO4，0.1g(NH4)2SO4，0.001g FeSO4·7H2O，100ppm表面活性剂，pH 6.0、121℃下20min高压
灭菌；

[0025] (3)5天为一个驯化周期，每个驯化周期结束时从原培养物中取1ml移入新鲜的同样条件的培养基中，共进行3个驯化周期；

[0026] (4)将驯化结束后的培养物在初筛平板上进行平板涂布分离倒置，30℃培养2天；

[0027] (5)根据平板上菌落生长情况挑单菌落在新的平板划线纯化；

[0028] (6)从平板上挑单菌落接入斜面培养基上；

[0029] (7)对菌株进行鉴定。

[0030] 2、菌株形态鉴定

[0031] 将分离纯化得到的菌株在直径为90mm的平板TYS(胰蛋白胨0.5g/L、酵母提物0.25g/L、NaCL 0.25g/L用稀硫酸调整培养基的值至6.0，然后进行121℃20min高压灭菌高
压蒸汽灭菌)培养基上划线置30℃培养箱培养，得到单个菌落。形成的菌落均呈乳白色，边
缘较整齐，湿润，中心稍凸起，有光泽，有同心圆，半透明，不易挑起，圆形。用革兰氏染色检
测为阳性。从扫描电镜照片中可以看出细菌的呈杆状，在培养基中培养3天后，大部分菌体
都产生了芽孢，芽孢端生或次端生，并使菌体细胞膨大，菌体宽0.3～0.8um，长2.0～6.0um，
见图1。

[0032] 3、16S rRNA基因扩增、克隆和测序

[0033] 用接种环从保存的斜面挑去少量菌种接入装有5ml TYS液体培养基的试管中，置25℃摇床200转/min培养24小时，收集菌液，转移到10ml EP管中，置于离心机中5000rpm离
心10min。弃上清，加入480μL TE缓冲液，振荡溶解菌体，加入5μL溶菌酶，在37℃保温3～5h；
加入20％SDS摇匀后再加入5μL蛋白酶K，55～65℃水浴5～10min，直至澄清；加入100μL量浓
度为5mol/L的NaCl和80μL CTAB/NaCl，在65℃水浴10min；加入等体积氯仿：异戊醇(24∶1)，
12000r/min离心10min；取上清液加入等体积的异丙醇，12000r/min离心5min去上清液，沉
淀用70％乙醇洗两次后晾干；加入200μLTE溶解DNA，加入5μLRNA酶，在37℃保温2～5h；加入
等体积(24∶1)氯仿：异戊醇重新抽提，再用异丙醇析出DNA，用70％乙醇洗涤两次，晾干后加
入30～40μLTE待用。以提取的基因组DNA为模板，采用27F(5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’)/
1492R(5’‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3’)引物对，在梯度PCR仪(Biometra)上进行16S rRNA基
因扩增。反应体系为：2.5μL 10×Taq Buffer、2.5μLMgCl2 1μL10×dNTPs、1μL引物27f、1μL
引物1492R、1μLTaq DNA polymerase、1μL模板DNA，加无菌水至25μL体系。对照组将模板DNA
换成等体积无菌水。扩增条件：94℃预处理5min，94℃变性40s，52℃退火45s和72℃延伸
90s，共30个循环，最后72℃保温10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后用回收试剂盒
(OMEGA)进行纯化，使用连接试剂盒(Promega)与pGEM‑Tvecter连接并转化到E.coil DH5α
中，涂平板，筛选阳性克隆，PCR克隆检测，确定转化成功的克隆子送上海生工生物工程有限
公司测序。根据及其相近种属的16S rRNA基因序列，用MEGA3.1软件构建系统进化树，进行
系统发育分析。

[0034] 序列分析结果显示该菌A‑YW与脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus aeris)的亲缘关系最为接近，两者的16S rDNA序列相似性达到99.2％。

[0035] 二、菌株对阴离子表面活性剂降解能力测定

[0036] 1、菌株的培养

[0037] 挑取活化的菌落，接种于种子培养基中，随后将A‑YW菌于30℃、200rpm培养3d使其生长处在对数期，制备成种子液；种子培养基每升含有0.5g蛋白胨、0.5g蔗糖、0.2g K2HPO4、
0.1g MgSO4·7H2O、0.1g(NH4)2SO4、0.001g FeSO4·7H2O、0.02g CaCl2，pH 6.0，121℃20min
高压灭菌。

[0038] 2、对比污水处理前和处理后LAS含量的变化

[0039] 以1％接种量将培养至对数期的A‑YW菌种子液接种到100mL生活污水中，随后在摇床上以30℃、110rpm的条件进行为期7天的净化处理，取上清液测定污水中LAS的含量；处理
后检测阴离子表面活性剂去除率的变化。结果见表1所示。

[0040] 表1水中LAS含量的变化

[0041]

[0042]

[0043] 以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。