一种基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法

摘要

本发明提供了一种基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法，属于病毒检测技术领域。检测RNA病毒高级结构的方法是将RNA病毒与交联剂混合，在紫外光下交联，回收RNA病毒；提取交联RNA病毒的RNA，用RNaseⅢ进行片段化处理，将RNA片段连接后解交联，将解交联的RNA片段建立测序文库；将测序文库进行高通量测序，对测序结果进行RNA高级结构分析。本发明利用高效的近距离连接反应，可以实现细胞培养或者收集的上清病毒颗粒内进行RNA病毒基因组高级结构解析。同时所述方法适用于起始量低至200ng的总RNA的样品进行实验。本发明提供的方法能大大提高近距离连接反应应用在病毒等微量RNA结构研究的适用性。

权利要求

1.一种基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法，其特征在于，由以下步骤组成：

1)将RNA病毒与交联剂混合，在紫外光下交联，回收RNA病毒，得到交联的RNA病毒；所述交联剂还包括洋地黄皂苷；所述洋地黄皂苷的质量浓度为0.01％～1％；

2)提取步骤1)中所述交联的RNA病毒的RNA；

3)将步骤2)中所述RNA用RNaseⅢ进行片段化处理，得到RNA片段；

4)将步骤3)中所述RNA片段连接后解交联，得到解交联的RNA片段；

5)将步骤4)中所述解交联的RNA片段建立测序文库；

6)将步骤5)中所述测序文库进行高通量测序，对测序结果进行RNA高级结构分析。

2.根据权利要求1所述基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法，其特征在于，步骤1)中所述交联剂为含补骨脂素类交联剂的PBS溶液；

在所述交联剂中，补骨脂素类交联剂的终浓度为1～4μmol/L。

3.根据权利要求2所述基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法，其特征在于，所述补骨脂素类交联剂包括AMT或EZ‑Link TM Psoralen‑PEG3‑Biotin。

4.根据权利要求1～3任意一项所述基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法，其

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特征在于，步骤1)中所述混合后，RNA病毒的终浓度为10～10拷贝数/mL。

5.根据权利要求1所述基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法，其特征在于，步骤1)中紫外光的波长为360～370nm；

所述交联的时间包括15～25min。

6.根据权利要求1所述基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法，其特征在于，步骤3)中用RNaseⅢ进行片段化处理的反应体系为10×RNaseⅢbuffer 1μl、200ng RNA、RNaseⅢ1μl，用无RNase的水补齐到20μl。

7.根据权利要求1或6所述基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法，其特征在于，所述用RNaseⅢ进行片段化处理的时间为1～10min；所述用RNaseⅢ进行片段化处理的温度为36～38℃。

8.根据权利要求1所述基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法，其特征在于，步骤4)中解交联的方法用紫外光照射所述RNA片段；

所述紫外光的波长为250～260nm；

紫外光照射的时间为1～10min。

9.根据权利要求1～3、5、6和8任意一项所述基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法，其特征在于，所述RNA病毒包括冠状病毒和柯萨奇病毒。

说明书

一种基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法

技术领域

[0001] 本发明属于病毒检测技术领域，具体一种基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法。

背景技术

[0002] 病毒是目前发现的最简单的生命体。除朊病毒以外，病毒由核酸和蛋白组成。根据病毒的核酸类型，分为RNA病毒和DNA病毒。完整的病毒核酸也称为病毒基因组。病毒基因组
是病毒的全套遗传密码，指导所有病毒蛋白的翻译，并调控病毒生命周期。近年来研究表明
病毒基因组结构不仅具有编码病毒蛋白的功能，其片段间可以相互折叠，形成复杂的空间
结构。而这种空间(高级)结构对于病毒基因编码、病毒感染复制都具有重要的意义。因此，
研究病毒的基因组的高级结构对于理解病毒的致病性和感染与复制的过程具有重要的意
义。

[0003] 理论上，细胞内RNA或者DNA高级结构的鉴定方法适用于病毒基因组结构的研究。目前，研究细胞内RNA高级结构的技术大体可分为如下几类：X‑ray、NMR、点击化学方法和现
有邻位连接法。其中X‑ray和NMR均具有分辨率高的特点，但也存在技术复杂，不能研究生理
条件下RNA结构的缺陷，适用于精细判断RNA复合体结构。点击化学方法具有简便、高通量的
特点，但只能判断RNA是否是双链，不能判定互作关系，适于细胞内RNA结构预测。现有邻位
连接法虽然适用于细胞内RNA结构及互作，也具有高通量、生理条件下RNA结构绘制的特点，
但存在操作步骤复杂，对样本要求较高的缺陷，不适用于研究低含量的病毒样本。

[0004] 研究RNA高级结构，根本在于研究RNA分子内局部片段间空间接触或相互作用的频率。为解决上述问题，近年来研究者发展出一系列研究技术，基本思想是利用RNA交联剂将
相互靠近(相互作用)的RNA固定，再对RNA末端进行处理并连接相互作用的RNA片段，并通过
高通量测序和生物信息学分析鉴定“嵌合”RNA的发生频率来判断RNA片段的相互作用关系。
这些研究方法自从早期发明以来为不同的生理条件下研究鉴定RNA结构和相互作用发挥了
重要的作用。前期公开的论文中所有的方法都包含富集交联片段，这就对起始样本量提出
了很高的要求。通常需要至少20μg的总RNA才能满足实验需求。但相对于细胞内RNA，病毒基
因组存在如下特点：病毒基因组拷贝数可能较低，总的病毒核酸量很低；病毒基因组占全部
宿主基因数数量很低。因此，常规的RNA结构的研究策略在研究病毒基因组结构时存在诸多
困难。特别是很难满足实验所需要的病毒核酸量，导致分析覆盖度不够，进而导致大量结构
细节丢失。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法，能够实现对低浓度的病毒样本进行RNA病毒基因组高级结构解析，并且所得高级结构
信息较为全面。

[0006] 本发明提供了一种基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法，包括以下步骤：

[0007] 1)将RNA病毒与交联剂混合，在紫外光下交联，回收RNA病毒，得到交联的RNA病毒；

[0008] 2)提取步骤1)中所述交联的RNA病毒的RNA；

[0009] 3)将步骤2)中所述RNA用RNaseⅢ进行片段化处理，得到RNA片段；

[0010] 4)将步骤3)中所述RNA片段连接后解交联，得到解交联的RNA片段；

[0011] 5)将所述解交联的RNA片段建立测序文库；

[0012] 6)将步骤5)中所述测序文库进行高通量测序，对测序结果进行RNA高级结构分析。

[0013] 优选的，步骤1)中所述交联剂为含补骨脂素类交联剂的PBS溶液；

[0014] 所述交联剂中，补骨脂素类交联剂的终浓度为1～4μmol/L。

[0015] 优选的，所述补骨脂素类交联剂包括AMT或EZ‑LinkTMPsoralen‑PEG3‑Biotin。

[0016] 优选的，所述交联剂还包括洋地黄皂苷；所述洋地黄皂苷的质量浓度为0.01％～1％。

[0017] 优选的，步骤1)中所述混合后，RNA病毒的终浓度为107～109拷贝数/mL。

[0018] 优选的，步骤1)中紫外光的波长为360～370nm；

[0019] 所述交联的时间包括15～25min。

[0020] 优选的，步骤3)中用RNaseⅢ进行片段化处理的反应体系为10×RNaseⅢbuffer 1μl、200ng RNA、RNaseⅢ1μl，用无RNase的水补齐到20μl。

[0021] 优选的，所述用RNaseⅢ进行片段化处理的时间为1～10min；所述用RNaseⅢ进行片段化处理的温度为36～38℃。

[0022] 优选的，步骤4)中解交联的方法用紫外光照射所述RNA片段；

[0023] 所述紫外光的波长为250～260nm；

[0024] 紫外光照射的时间为1～10min。

[0025] 优选的，所述RNA病毒包括冠状病毒和柯萨奇病毒。

[0026] 本发明提供了一种基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法，将RNA病毒在交联剂的作用下进行紫外光交联，使互相作用(靠近)的RNA片段形成共价键，在较低的起始样
本量的基础上，采用RNase III核酸酶片段化，从而保证每个片段化的RNA末端都适合连接，
有利于提高连接效率。本发明提供的方法被称作高通量RNA互作分析的(High thoughput 
RNA interaction analysis，Hi‑R)方法，所述高通量RNA互作分析可以在全基因组范围内
以高灵敏地绘制体内成对RNA相互作用。同时本发明提供的方法可以减少由于末端处理和
富集嵌合片段带来的RNA损失，从而使得其适合对微量的病毒颗粒直接进行实验。采用本发
明提供的Hi‑R方法将可以应用于绘制病毒基因组中片段互作以及高级结构图谱，为研究相
关病毒生命周期中结构变化及其与功能的联系提供基础。

附图说明

[0027] 图1为本发明提供的Hi‑R方法检测RNA病毒，其中图1A为样品收集和主要实验步骤的示意图；在病毒感染的不同阶段收集病毒感染的细胞及培养上清，加入含补骨脂素类交
联剂，固定相互作用的RNA片段；RNA经片段化后连接，并对连接形成的嵌合RNA片段建立
cDNA文库，高通量测序；图1B为Dotplot显示来自两次重复的嵌合读计数，表明接近方案具
有良好的重现性；图1C为SARS‑CoV‑2病毒RNA‑RNA相互作用的热图，每个点表示在x和y轴上
的基因组坐标之间的相互作用信号，X轴表示嵌合体的5'臂的坐标，Y轴表示嵌合体的3'臂，
因此，5'‑3'嵌合体在对角线上方，3'‑5'嵌合体在对角线下方；图1D为每个样品中映射的单
端RNA，3'‑5'嵌合体和5'‑3'嵌合体的统计数据；

[0028] 图2为Hi‑R方法鉴定发现新冠病毒可变的UTR结构；图2A为5'‑UTR区域中的标准化接触矩阵；图2B为标准化的SARS‑CoV‑25'‑UTR结构，颜色代表支持每个碱基对的非冗余嵌
合读段的log2嵌合读段计数；图2C为3'‑UTR区域中的标准化接触矩阵；图2D为标准的SARS‑
CoV‑23'‑UTR和可变的S2M结构，指定拱的碱基配对，颜色代表支持每个碱基对的非冗余嵌
合读段的log2嵌合读段计数；图2E为支持基因组环化的标准化接触矩阵；图2F为C、L和V样
本中的5'‑UTR和3'‑UTR碱基配对，颜色代表支持每个碱基对的非冗余嵌合读段的log2嵌合
读段计数；

[0029] 图3为Hi‑R方法发现TRS‑L座位与TRS‑B座位的远程互作，图3A为指定样品中沿SARS‑CoV‑2基因组的TRS‑L区(第一个100nt)的结合位置，分别绘制了3'‑5'嵌合体和5'‑3'
嵌合体，黑色箭头指示orf1a中的其他峰；图3B为丰富的TRS‑L的相互作用峰由Z评分法推
导，通过Z分数归一化来自bin‑bin接触的嵌合读计数，然后绘制Z分数>2.13(高于平均水平
的95％置信度)并通过TRS‑L介导的相互作用；图3C为在TRS‑L区域(最初的100nt)上的接合
位点分布，在完全特定的碱基处断裂的嵌合体被计数，表明连接在不同的位点处发生；图3D
为跨TRS‑L：S连接位点的3'‑5'嵌合读码的接触矩阵，其中颜色表示每100万个映射读段的
嵌合读段数(CPM)；图3E为支持TRS‑L和S基因互作的嵌合reads映射的具体位点。每一条线
代表一个读段(read)的映射(mapping)，从这个图中可以反映每一个支持TRS‑L和S基因互
作的嵌合reads的细节，发现这些互作可能来自于sgRNA环化和TRS‑L互作两种模式；图3F为
根据上述分析发现的TRS‑L和S互作片段之间碱基互补的细节；

[0030] 图4为比较病毒在不同状态下的结构结果，其中图4A为热图显示了病毒粒子与感染早期细胞(VvsC)和病毒粒子与感染后期细胞裂解物(VvsL)中RNA‑RNA相互作用的比较，
VvsL在上象限中，而VvsC在下象限中；图4B为强弱发生变化的互作的跨度分布，点状图显示
了差异相互作用的分布，***p<0.001，双向两样本Kolmogorov‑Smirnov检验；图4C为在
SARS‑CoV‑2病毒生命周期中保持了结构域特征；热图显示了C、L和V样本中所有边界及其附
近区域(±0.5域长度)的归一化平均相互作用频率，热图以10nt的分辨率分窗；图4D为在从
上游1/2到下游1/2的边界周围绘制平均归一化绝缘分数(insulation score)；图4E为小提
琴图比较C、L和V样品之间的边界强度，在V样品中显示出更高的边界强度；图4F为以10nt分
辨率分装的RNA相互作用图(顶部)显示了C、L和V样品中SARS‑CoV‑2基因组上的相互作用距
离为10～15kb，线图(中位数)显示绝缘曲线，短线(底部)反映了边界；

[0031] 图5为接触矩阵比较两次生物学重复结果，两个生物学重复的柯萨奇病毒颗粒RNA经Hi‑R实验处理后，接触矩阵图显示生物学重复的相似性高；

[0032] 图6为GFP插入前后柯萨奇病毒结构比较结果，图6A为柯萨奇病毒CVB3型RNA‑RNA相互作用的热图；图6B为柯萨奇病毒CVB3型在插入GFP后RNA‑RNA相互作用的热图；图6C为
GFP插入前后的相互作用差异图谱，红色点代表GFP插入后增强的相互作用，蓝色点代表GFP
插入后减弱的相互作用；

[0033] 图7为比较两株柯萨奇病毒结构特征结果，图7A利用方向指数描绘GFP插入前后的柯萨奇病毒基因组结构域特点，显示GFP插入后结构域获得增强；图7B为利用强度指数描绘
GFP插入前后的柯萨奇病毒基因组结构域特点，显示GFP插入后结构域获得增强；

[0034] 图8为柯萨奇病毒RNA的交联效率检测结果。

具体实施方式

[0035] 本发明提供了一种基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法，包括以下步骤：

[0036] 1)将RNA病毒与交联剂混合，在紫外光下交联，回收RNA病毒，得到交联的RNA病毒；

[0037] 2)提取步骤1)中所述交联的RNA病毒的RNA；

[0038] 3)将步骤2)中所述RNA用RNaseⅢ进行片段化处理，得到RNA片段；

[0039] 4)将步骤3)中所述RNA片段连接后解交联，得到解交联的RNA片段；

[0040] 5)将所述解交联的RNA片段建立测序文库；

[0041] 6)将步骤5)中所述测序文库进行高通量测序，对测序结果进行RNA高级结构分析。

[0042] 本发明将RNA病毒与交联剂混合，在紫外光下交联，回收RNA病毒，得到交联的RNA病毒。

[0043] 本发明提供的方法对所有种类的RNA病毒均适用。本发明实施例中，以冠状病毒和柯萨奇病毒为例加以说明具体的实施方法。

[0044] 在本发明中，所述RNA病毒的制备方法，优选将RNA病毒感染细胞，培养，分离RNA病毒，得到RNA病毒粒子。所述感染的时间优选为20～25h，更优选为24h。所述RNA病毒的MOI为
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0.01。所述细胞的浓度为1.0×10～1.0×10个/ml。

[0045] 在本发明中，将收集的RNA病毒与交联剂混合后，RNA病毒的终浓度优选为107～1097 8
拷贝数/mL，更优选为5×10～5×10 拷贝数/mL。混合后体系的总体积优选为50μl～10ml，
更优选为100μl。所述交联剂优选为含补骨脂素类交联剂的PBS溶液。所述交联剂中，补骨脂
素类交联剂的终浓度优选为1～4μmol/L，更优选为2μmol/L。所述补骨脂素类交联剂优选包
TM
括AMT或EZ‑Link Psoralen‑PEG3‑Biotin。所述交联剂优选还包括洋地黄皂苷
(digitonin)；所述PBS溶液中洋地黄皂苷的质量浓度优选为0.01％～1％，更优选为0.01％
～0.5％。所述洋地黄皂苷作为透过剂，提高交联剂透过病毒壳蛋白达到RNA，提高交联效
率。

[0046] 在本发明中，紫外光的波长优选为360～370nm，更优选为365nm。所述交联的时间优选包括5～25min，更优选为10～20min。所述交联时优选在冰浴条件下进行。所述紫外光
交联有利于使病毒中互相作用的RNA分子形成共价键，为后续近距离连接反应提供便利。

[0047] 在本发明中，所述回收RNA病毒的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的回收病毒的方法即可。

[0048] 得到交联的RNA病毒后，本发明提取步骤1)中所述交联的RNA病毒的RNA。

[0049] 本发明对所述提取RNA病毒的方法没有特殊显著，采用本领域所熟知的提取病毒方法即可，例如Trizol法或QIAGEN试剂盒RNeasy Plus Mini Kit RNA提取。

[0050] 在本发明中，提取RNA病毒的RNA后，优选对提取的RNA进行定量和质量检测。所述定量检测优选采用Qubit检测RNA的浓度，以便指导后续上样体积。优选采用Agilent 2100
检测RNA完整性，推荐RIN值大于7。

[0051] 在本发明中，得到提取RNA病毒的RNA后，优选检测紫外交联效果。所述检测紫外交联效果优选Dotblot试剂盒。

[0052] 得到RNA后，本发明将步骤2)中所述RNA用RNaseⅢ进行片段化处理，得到RNA片段。

[0053] 在本发明中，步骤3)中用RNaseⅢ进行片段化处理的反应体系优选为10×RNaseⅢbuffer 1μl、200ng RNA、RNaseⅢ1μl，用无RNase的水补齐到20μl。所述用RNaseⅢ进行片段
化处理的时间优选为1～10min，更优选为2～8min，更优选为5min；所述用RNaseⅢ进行片段
化处理的温度优选为36～38℃，更优选为37℃。采用RNaseⅢ进行片段化处理，得到的RNA片
段可以直接连接，而采用其他种类内切酶进行片段处理，则需要对RNA片段末端进行PNK处
理才能连接。因此采用RNaseⅢ酶可以减少实验步骤，减少实验操作过程中RNA的损失，同时
提高反应效率。

[0054] 得到RNA片段后，本发明将所述RNA片段连接后解交联，得到解交联的RNA片段。

[0055] 在本发明中，所述连接的反应体系为10×T4 RNA Ligase buffer 20μl、10MmATP 20μl、Superase In 1μl、Ribolock RI 5μl、T4 RNA Ligase 15μl、200ng RNA片段，用无
RNase的水补充至200μl。所述连接的反应条件优选为16℃下水浴过夜。

[0056] 解交联后，优选对连接的RNA片段进行纯化处理。本发明对所述纯化处理的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的纯化方法即可，例如采用RNeasy Plus Mini Kit RNA
(Qiagen)回收微量RNA。

[0057] 在本发明中，解交联的方法优选用紫外光照射所述RNA片段。所述紫外光的波长优选为250～260nm，更优选为254nm。紫外光照射的时间优选为1～10min，更优选为5min。所述
解交联优选在冰上进行。所述解交联的目的时破坏共价键，使避免后续建库时因交联形成
的共价键影响逆转录反应。

[0058] 得到解交联的RNA片段后，本发明将所述解交联的RNA片段建立测序文库。

[0059] 在本发明中，所述建立测序前，优选采用Agilent2100解交联的RNA片段进行检测。本发明对所述建立测序文库的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的建立测序文库方法
即可，例如参见SMARTer Stranded Total RNA‑Seq Kit v2‑Pico Input Mammalian User 
Manual。

[0060] 得到测序文库后，本发明将所述测序文库进行高通量测序，对测序结果进行RNA高级结构分析。

[0061] 本发明对所述高通量文库的构建方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的高通量文库测序方法即可。在本发明中，所述高通量测序委托安诺优达基因科技有限公司完成。

[0062] 在本发明中，所述对测序结果进行嵌合读段分析优选参见现有技术进行分析(Travis,A.J.,Moody,J.,Helwak,A.,Tollervey,D.,&Kudla,G.(2014).Hyb:a 
bioinformatics pipeline for the analysis of CLASH(crosslinking,ligation and 
sequencing  of  hybrids)data.Methods,65(3),263‑273.doi:10.1016/
j.ymeth.2013.10.015)。

[0063] 本发明提供的方法利用高效的近距离连接反应，可以实现细胞培养或者收集的上清病毒颗粒内进行RNA病毒基因组高级结构解析。同时对低至200ng的总RNA起始量进行实
验。因此，本发明提供的方法大大提高近距离连接反应应用在病毒等微量RNA结构研究的适
用性。

[0064] 下面结合实施例对本发明提供的一种基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0065] 实施例1

[0066] Hi‑R技术应用于新型冠状病毒基因组结构解析

[0067] 1.实验材料：Vero细胞感染新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)的细胞及上清交联剂：EZ‑LinkPsoralen‑PEG3‑Biotin(Thermo Fisher Scientific)透化剂：digitonin(Sigma)

[0068] 2.实验步骤

[0069] 2.1交联

[0070] 将9×107个/ml VeroE6用MOI为0.01的Wuhan‑Hu‑1株SARS‑CoV‑2病毒感染24小时。其中三个重复样本用PBS洗涤细胞三次，收集上述洗涤的细胞(记为C1，C2和C3)。剩余感
染样本继续培养48小时，病毒培养上清液与等体积饱和硫酸钠溶液在4℃混合1小时。用PBS
洗涤细胞三次，收集上述病毒沉淀(记为V1，V2和V3)及洗涤的细胞(记为L1，L2和L3)。用含
0.01％digitonin的PBS稀释EZ‑Link Psoralen‑PEG3‑Biotin到2μM，并重悬病毒颗粒或细
胞。在37℃保温10分钟后，均匀铺到6孔板的一个孔里。6孔板去盖放入交联仪，在365nm条件
下交联10分钟两次(交联仪需放入安全柜内)。每次交联时六孔板放置于冰上。交联十分钟
后取出六孔板置换新的冰，再次交联一次。

[0071] 2.2 RNA提取

[0072] 使用RNeasy mini kit(Qiagen)，按照试剂盒说明书操作。

[0073] 2.3 RNA片段化

[0074] 配制RNA片段化反应体系，具体见表1。

[0075] 表1 RNA片段化反应体系

[0076]

[0077] 将反应体系在37℃保温5分钟，立即转入RNA纯化。

[0078] 2.4纯化片段化的RNA

[0079] 用RNeasy Plus Mini Kit RNA(Qiagen)回收微量RNA，按照说明书操作。

[0080] 2.5连接

[0081] 配制连接反应的反应体系，具体见表2。

[0082] 表2连接反应体系

[0083]

[0084] 将反应体系混匀后在16℃水浴过夜。

[0085] 2.6纯化连接的RNA

[0086] 使用RNeasyPlus Mini Kit RNA回收微量连接RNA，按照说明书操作。

[0087] 2.7解交联

[0088] 在超净工作台剪取无RNA酶的EP管盖，将回收的RNA加到无RNA酶的EP管盖中，于冰上254nm紫外照射5min以解交联。

[0089] 2.8建立测序文库

[0090] RNA建库前用Agilent2100检测，建库参见SMARTer Stranded Total RNA‑Seq Kit v2‑Pico Input Mammalian User Manual。

[0091] 2.9高通量测序及高级结构分析

[0092] 送Novaseq 6000测序，按照测序服务提供商要求提供测序文库。将测序结果参见现有技术(Travis,A.J.,Moody,J.,Helwak,A.,Tollervey,D.,&Kudla,G.(2014).Hyb:a 
bioinformatics pipeline for the analysis of CLASH(crosslinking,ligation and 
sequencing  of  hybrids)data.Methods,65(3),263‑273.doi:10.1016/
j.ymeth.2013.10.015)进行新冠病毒的RNA高级结构分析。

[0093] 3.实验结果

[0094] 3.1各组样本数据评估

[0095] 各组样本数据评估结果见表3。

[0096] 表3各组样本数据评估

[0097]

[0098] 从上述数据可以看出，连接组比不连接的对照组嵌合片段比例显著增加，在感染细胞连接组嵌合片段比例在10％附近，而病毒上清连接的嵌合片段比例超过20％，提示RNA
压缩比较紧密。

[0099] 作为对照，进一步分析了类似的COMRADES方法检测新冠病毒基因组结构的连接效率。结果见表4。

[0100] 表4本实施例方法及COMRADES方法检测新冠病毒基因组结构结果

[0101]

[0102] 由表3和表4整体检测结果来看，本发明提供的方法使得连接产生的嵌合片段比率提高，即有效数据率有所提高。推测主要原因是RNase III片段化后所有末端适合连接，从
而大幅提高了连接的效率。

[0103] 同时本实例通过对不同生命阶段的新冠病毒基因组结构进行解析，通过数据分析表明技术可靠性，并且可以发现新冠病毒基因组内部相互作用的细节。通过分析TRS‑L介导
的相互作用揭示新冠病毒转录的机制。并可以比较不同生命状态新冠病毒基因组结构在互
作细节和基因组整体结构域层次的异同。具体结果如下：

[0104] 图3为Hi‑R方法发现TRS‑L座位与TRS‑B座位的远程互作结果。由图3结果显示本技术产生的高通量测序数据可用于揭示与新冠病毒转录过程密切相关的远距离互作的细节。

[0105] 图4为比较病毒在不同状态下的结构结果，其中图4A为热图显示了病毒粒子与感染早期细胞(VvsC)和病毒粒子与感染后期细胞裂解物(VvsL)中RNA‑RNA相互作用的比较，
VvsL在上象限中，而VvsC在下象限中；图4B为强弱发生变化的互作的跨度分布，点状图显示
了差异相互作用的分布，***p<0.001，双向两样本Kolmogorov‑Smirnov检验，显示病毒不同
生命阶段中呈现变化的互作有不同的跨度；图4C为在SARS‑CoV‑2病毒生命周期中保持了结
构域特征，通过计算位点之间互作作用频率，推导出基因组内互作呈现近距离结构域内互
作频率高于结构域之间的互作特征；热图显示了C、L和V样本中所有边界及其附近区域(±
0.5域长度)的归一化平均相互作用频率，热图以10nt的分辨率分窗；图4D为在从上游1/2到
下游1/2的边界周围绘制平均归一化绝缘分数(insulation score)；图4E为小提琴图比较
C、L和V样品之间的边界强度，在V样品中显示出更高的边界强度；F为以10nt分辨率分装的
RNA相互作用图(顶部)显示了C、L和V样品中SARS‑CoV‑2基因组上的相互作用距离为10～
15kb，线图(中位数)显示绝缘曲线，短线(底部)反映了边界。综上，图4展示了利用本发明提
供的方法产生的高通量测序数据可解释新型冠状病毒基因组折叠结构的规律，及比较病毒
在不同生命状态下折叠的动态特征。

[0106] 实施例2

[0107] Hi‑R技术应用于柯萨奇病毒基因组结构解析

[0108] 1实验材料

[0109] HeLa细胞感染柯萨奇病毒(CVB‑3)上清中的病毒颗粒；

[0110] 交联剂：EZ‑Link Psoralen‑PEG3‑Biotin(Thermo Fisher Scientific)；

[0111] 透化剂：digitonin(Sigma)。

[0112] 2.实验步骤

[0113] 2.1交联

[0114] 1×108个/ml的HeLa细胞用MOI为0.01CVB‑3病毒株感染24小时。超速离心浓缩病毒。0.6μm微孔滤膜过滤，转移到38ml超离管中，小心轻轻加入经过0.2μm微孔滤膜过滤的
35％蔗糖溶液5ml至超离管底部。烙铁封口。在4℃、10万g离心16h，将病毒粒子离心至管底，
小心去掉上层培养基，收集病毒粒子。用100μl 2μM的交联剂(含0.1％透化剂)重悬病毒粒
子，37℃保温10分钟。均匀铺到6孔板的一个孔里。6孔板去盖放入交联仪，365nm交联10分钟
两次。(交联仪需放入安全柜内)每次交联时六孔板放置于冰上。交联十分钟后取出六孔板
置换新的冰，再次交联一次。交联完成后取出6孔板，用1ml Trizol处理交联的病毒。用
Trizol法提取RNA，按照说明书操作。

[0115] 2.2 RNA提取

[0116] 使用RNeasy mini kit(Qiagen)，按照试剂盒说明书操作。

[0117] 2.3 RNA片段化

[0118] 配制RNA片段化反应体系，具体见表5。

[0119] 表5 RNA片段化反应体系

[0120]

[0121] 在37℃保温5分钟后立即转入RNA纯化。

[0122] 2.4纯化片段化的RNA

[0123] 用RNeasyPlus Mini Kit RNA(Qiagen)回收微量RNA，按照说明书操作。

[0124] 2.5连接:

[0125] 配制连接体系，具体见表6。

[0126] 表6连接体系

[0127]

[0128] 将连接反应体系混匀后在16℃下水浴过夜。

[0129] 2.6纯化连接的RNA

[0130] 在连接体系中加入30μl全式金Magic Pure RNA Beads+370μl Crowd buffer，充分混匀回收。RNase‑free water洗脱15μl。(注:此步若RNA Beads太少，体系大，会影响磁珠
吸附，纯化会非常缓慢。)Qubit定量。

[0131] 2.7解交联

[0132] 在超净工作台剪取无RNA酶的EP管盖，将回收的RNA加到无RNA酶的EP管盖中，于冰上254nm紫外照射5min以解交联。

[0133] 2.8建立测序文库

[0134] RNA建库前用Agilent2100检测，建库参见SMARTer Stranded Total RNA‑Seq Kit v2‑Pico Input Mammalian User Manual。

[0135] 2.9高通量测序

[0136] 送Hiseq Xten测序，委托安诺优达基因科技有限公司进行高通量测序。

[0137] 3实验结果见表7。

[0138] 表7本实施例方法检测柯萨奇病毒的检测结果

[0139]

[0140]

[0141] 由表7结果，连接后嵌合片段比例大幅高于不连接组。

[0142] 通过测序所得数据，较为直观显示利用本发明提出的Hi‑R技术可以揭示柯萨奇病毒CVB13型的基因组结构特征，并可用来比较两株病毒的结构，即可以观察相互作用的强
弱，也可以比较基因组整体的结构域特征。具体结果如下：

[0143] 图5为接触矩阵比较两次生物学重复结果，两个生物学重复的柯萨奇病毒颗粒RNA经Hi‑R实验处理后，接触矩阵图显示生物学重复的相似性高。

[0144] 图6为GFP插入前后柯萨奇病毒结构比较结果，图6A为柯萨奇病毒CVB3型RNA‑RNA相互作用的热图；图6B为柯萨奇病毒CVB3型在插入GFP后RNA‑RNA相互作用的热图；图6C为
GFP插入前后的相互作用差异图谱，红色点代表GFP插入后增强的相互作用，蓝色点代表GFP
插入后减弱的相互作用。由图6可知，利用本发明所述方法获得的高通量测序数据可以揭示
柯萨奇病毒改造前后片段相互作用的变化。

[0145] 图7为比较两株柯萨奇病毒结构特征结果，图7A利用方向指数描绘GFP插入前后的柯萨奇病毒基因组结构域特点，显示GFP插入后结构域获得增强；图7B为利用强度指数描绘
GFP插入前后的柯萨奇病毒基因组结构域特点，显示GFP插入后结构域获得增强。由图7可
知，利用本发明提供的方法获得的高通量测序数据可以揭示柯萨奇病毒折叠结构域在改造
前后的变化。

[0146] 实施例3

[0147] 用dotplot方法来判断柯萨奇病毒RNA的交联效率，具体方法如下：用一定浓度(1μM或2μM)的EZ‑Link Psoralen‑PEG3‑Biotin的PBS(含0.01％digitonin)与柯萨奇病毒颗粒
样本混合，在365nm紫外光照射下交联不同时间(0、10min、20min)，样本检测生物素信号，点
越浓提示交联效率越高。所述dotplot方法可参考现有技术(Aw,J.G.,Shen,Y.,Wilm,A.,
Sun,M.,Lim,X.N.,Boon,K.L.,.Wan,Y.(2016).In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA 
Interactomes Reveals  Principles of  Higher‑Order Organization and 
Regulation.Mol Cell,62(4),603‑617.doi:10.1016/j.molcel.2016.04.028)。

[0148] 结果见图8。图8中上图表示用2μM终浓度的EZ‑LinkTM Psoralen‑PEG3‑Biotin交联剂在不同交联时间下的生物素信号强度，提示20min比10min的交联效率更佳。图8中下图为
分别用1μM和2μM的交联剂的交联效果，1μM和2μM的交联剂均可获得较理想的交联效率，并
且与1μM的交联浓度相比，2μM的交联浓度使交联效率更佳。

[0149] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。