一种SLC25A13基因突变位点检测试剂盒及方法

摘要

本发明公开一种SLC25A13基因突变位点检测试剂盒及方法。所述试剂盒主要成分为PCR扩增引物SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:28和质谱延伸引物SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:43。通过使用本发明试剂盒，能够一次性同时准确检测出SLC25A13基因15个突变位点，具有高效、高通量、低成本、自动化的优点。

权利要求

1.一种检测SLC25A13基因位点突变试剂盒，其特征在于：由PCR扩增引物和质谱延伸引物，10×PCR反应缓冲液、25mM dNTP Mix、25mM MgCl2、PCR反应Taq酶、SAP反应缓冲液、SAP酶、iPlex反应缓冲液、iPlex Termination Mix、Extension反应Taq酶、MassARRAY芯片组成，所述PCR扩增引物序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:28所示，所述质谱延伸引物序列如SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:43所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的PCR扩增引物为包含扩增引物的混合物，扩增引物序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:28所示；所述的PCR延伸引物为包含延伸引物的混合物，延伸引物序列如SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:43中所示。

说明书

一种SLC25A13基因突变位点检测试剂盒及方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种检测SLC25A13基因位点突变试剂盒及检测方法，是一种基于MassARRAY质谱平台的SLC25A13基因突变型检测方法。

背景技术

[0002] 希特林蛋白缺乏症(Citrin deficiency)是由SLC25A13基因突变引起的Citrin转运体功能障碍的一种常染色体隐性遗传疾病。本病发病时期从新生儿到成人年龄不一，根
据发病年龄不同，临床表现不同，早期发病多表现为肝内胆汁淤积(NICCD)，脂肪肝，成人期
发病(CTLN2)多为高氨血症、脂肪肝或合并胰腺炎、肝细胞癌等，同时不同发病期都伴有不
同程度的高氨血症和高瓜氨酸血症，临床上容易与其他肝病、胆汁淤积性肝炎、氨基酸代谢
疾病等混乱。

[0003] 目前，我国采用串联质谱技术(MS‑MS)测定新生儿末梢血中瓜氨酸浓度来对该病进行早期筛查。但据研究报道，仅40‑50％的NICCD患者通过新生儿串联质谱筛查最终确诊，
大多数患者出现黄疸、发育迟缓等症状后才就医确诊，原因可能为部分患者瓜氨酸迟发升
高，新生儿串联筛查结果阴性，导致该疾病漏筛率较高。有研究采用分子检测技术对
SLC25A13基因3个热点突变进行该疾病新生儿筛查，检出率虽有所提高但仍远低于发病率。
在临床实践中随着NICCD患者数的不断增加，该病日益得到临床医生的重视。因此，急需提
高NICCD新生儿筛查的敏感性。

[0004] 国内外正式报道的SLC25A13突变类型超过60余种，我国人群突变频率最高主要为c.851_854del4bp、IVS16ins3kb、c.1638_1660dup、IVS6+5G>A、c.1399C>T，总体大约占
NICCD患者的85％以上。该基因突变在我国患者中高度的集中性，突变热点明确，有利于进
行早期新生儿基因筛查。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种SLC25A13基因突变位点检测试剂盒，是一种基于MassARRAY质谱平台的SLC25A13基因突变检测试剂盒。

[0006] 本发明提供的试剂盒，由PCR扩增引物和质谱延伸引物，10×PCR反应缓冲液、dNTP Mix(25mM)、MgCl2(25mM)、PCR反应Taq酶、SAP反应缓冲液、SAP酶、iPlex反应缓冲液、iPlex 
Termination Mix、Extension反应Taq酶、MassARRAY芯片组成。其中：PCR扩增引物序列如
SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:28所示，质谱延伸引物序列如SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:43中
所示。

[0007] 所述的PCR扩增引物为包含序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:28所示的1管扩增引物的混合物，所述的PCR延伸引物为包含序列如SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:43中所示的1管
延伸引物的混合物。

[0008] 本发明的另一目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测SLC25A13基因突变试剂盒的使用方法，通过以下步骤实现：

[0009] (1)设计如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:28所示的扩增引物和如SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:43所示的延伸引物；

[0010] (a)PCR扩增引物：

[0011] PCR扩增引物为根据SLC25A13基因设计的特异性针对15个热点突变位点的扩增引物，所述扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列。

[0012] 本发明的扩增引物选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:28中；优选地，本发明的扩增引物包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:28；最优选地，本发明的扩增引物由SEQ ID NO:1～SEQ 
ID NO:28组成。

[0013] (b)延伸引物：

[0014] 延伸引物的长度为15‑26个碱基并且其3’端位于突变位点的上一个碱基，延伸引物在发生延伸反应时，只延伸一个碱基，延伸的碱基即为SLC25A13基因热点突变位点。

[0015] 本发明的延伸引物选自SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:43中，优选地，本发明的延伸引物包括SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:43；最优选地，本发明的延伸引物由SEQ ID NO:29～
SEQ ID NO:43组成。

[0016] (2)将SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:28所示的扩增引物混合得到1管扩增引物混合液，将SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:43所示的延伸引物混合得到1管延伸引物混合液；

[0017] (3)检测模板的制备：提取待测样本DNA；

[0018] (4)以步骤(3)中提取的DNA为模板，利用步骤(1)中的扩增引物进行PCR扩增，获得靶序列的PCR产物；

[0019] (5)SAP酶处理，除去步骤(4)获得的扩增产物中含有的未反应的dNTP；

[0020] (6)以步骤(5)中获得的扩增产物为模板，使用步骤(2)中的延伸引物通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物；

[0021] (7)采用树脂纯化步骤(6)中获得的延伸产物；

[0022] (8)采用飞行时间质谱基因分型系统对纯化产物进行扫描、检测，检测结果使用TYPER4.0软件分型并输出结果，通过质谱峰变异碱基处是否出峰来判断是否突变。

[0023] 本发明试剂盒能一次性检测15种常见的SLC25A13突变类型，基于Massarry平台的检测方法简便，准确率高，同时还具有高通量、低成本、自动化等特点。

附图说明

[0024] 图1表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为7383.9Da的T峰位置，此数据表明该样本为纯合T，为IVS16ins3kb野生纯合型样本的质
谱峰图结果。

[0025] 图2表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为7383.9Da的T峰和7399.9Da的C峰，此数据表明该样本为杂合，为IVS16ins3kb杂合型样
本的质谱峰图结果。

[0026] 图3表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为5423.4Da的峰位置，此数据表明该样本为纯合，为c.852_855del野生型纯合型样本的
质谱峰图结果。

[0027] 图4表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为5367.5Da的del峰位置，此数据表明该样本为纯合，为c.852_855del突变纯合型样本的
质谱峰图结果。

[0028] 图5表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为5367.5Da的del峰和5423.4Da的峰位置，此数据表明该样本为杂合，为c.852_855del杂
合型样本的质谱峰图结果。

[0029] 图6表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为6425.2Da的G峰位置，此数据表明该样本为纯合G，为野生纯合型样本的质谱峰图结果。

[0030] 图7表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为6425.2Da的G峰和6409.2Da的A峰位置，此数据表明该样本为杂合，为c.1177+1G>A杂合
型样本的质谱峰图结果。

[0031] 图8表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为6780.5Da的G峰位置，此数据表明该样本为纯合G，为野生纯合型样本的质谱峰图结果。

[0032] 图9表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为6780.5Da的G峰和6764.5Da的A峰位置，此数据表明该样本为杂合，为c.615+5G>A杂合
型样本的质谱峰图结果。

具体实施方式

[0033] 下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。本发明的实施例提供了对15种SLC25A13基因突变型进行检测的方法。

[0034] 下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法，所用试剂均为市售商品。

[0035] 实施例1引物设计

[0036] (1)PCR扩增引物

[0037] 根据所选择的待检测的15种SLC25A13基因突变型(具体的突变未定信息见表1)，设计出特异性针对每种SLC25A13基因突变型的PCR扩增引物，PCR扩增引物可扩增包括突变
位点在内的一段DNA序列。所述PCR扩增引物在3’端具有与其所针对的基因序列完全匹配的
至少15个碱基，在5’端具有10个碱基(ACGTTGGATG)的标签序列，以区分PCR扩增引物与延伸
引物，所设计的PCR扩增引物详见表2所示。

[0038] (2)延伸引物：

[0039] 设计延伸引物，所述延伸引物长度为15‑26个碱基，并且其3’端位于SLC25A13基因突变位点的上一个碱基，延伸引物在发生延伸反应时，只延伸一个碱基，延伸的碱基即为
SLC25A13基因突变位点。

[0040] 表1：SLC25A13(NM_014251.2)基因突变信息

[0041]

[0042] 其中，上述符号“>”表示碱基突变。

[0043] 表2：针对所述PCR扩增的PCR扩增引物序列

[0044]

[0045]

[0046] 表3：针对所述延伸反应的延伸引物

[0047]SEQ ID NO 检测位点 延伸引物序列5’→3’
29 c.1399C_T ATCACCACTGGTCCT
30 c.1177+1G>A GAGCATGTGGCACTAA
31 c.852_855del TTTTTCCCCTACAGACG
32 c.1231G>A TCCCTCACAAAATCGTTCA
33 c.1638_1660dup GGGCAGCCACCTGTAATCTC
34 c.955C>T AACTTGTAGAAGAACTGGTC
35 IVS6+5G>A AAGAATGTCTAGTAGCTGTAA
36 IVS4ins6kb cTCCTCTGAAAAGAGAAAAGAC
37 c.754G>A AATTCAGATATATTCTCACTCAC
38 IVS16ins3kb AGCTTTAAAAAAATGGAGAAATC
39 c.775C>T TGGGTGTAACCTGACCAAATTTCT
40 c.550C>T GGCGGATGGTGACCATGATGTCTC
41 c.265delG aGAAAGGCTACCATAAACAAAGCAT
42 c.1095delT tgTTTATACATGAGTTCTCCCACAAA
43 c.1063C>G/T ggaAGTTGATCGTTGGTTCTGCATTC

[0048] 实施例2检测模板的制备

[0049] 应用Tiangen的干血斑基因组DNA提取试剂盒提取收集血样的基因组DNA，具体操作过程按说明书要求进行。

[0050] 实施例3SLC25A13基因突变型的检测方法

[0051] (1)以实施例2中提取的DNA为模板，使用实施例1中的PCR扩增引物通过PCR扩增，获得靶序列扩增产物。PCR扩增反应体系参见表4.其中，所用试剂购自Agena Bioscience公
司。PCR扩增反应条件见表5。

[0052] 表4：PCR扩增反应体系

[0053]试剂 体积(ul)/反应
水 1.8
10×PCR反应缓冲液 0.5
dNTP Mix(25mM) 0.1
MgCl2(25mM) 0.4
表2中PCR扩增引物混合物 1.0
PCR反应Taq酶 0.2
模板DNA 1.0
总体积 5.0

[0054] 表5：PCR扩增反应条件

[0055]

[0056] (2)通过SAP酶处理，除去步骤(1)获得的扩增产物中含有的未反应的dNTP。SAP酶反应体系见表6。所用试剂购自Agena Bioscience公司。SAP反应条件见表7。

[0057] 表6：SAP酶反应体系

[0058]试剂 体积(ul)/反应
水 1.53
SAP反应缓冲液 0.17
SAP酶 0.3
步骤(1)中获得PCR扩增产物 5.0
总体积 7.0

[0059] 表7：SAP反应条件

[0060] 温度 时间37℃ 40min
85℃ 5min
4℃ Hold

[0061] (3)以步骤(2)中获得的扩增产物为模板，使用实施例1中的延伸引物通过延伸反应，在延伸引物的3’端链接一个碱基，从而得到延伸产物。延伸反应体系见表8。所用试剂购
自Agena Bioscience公司。延伸反应条件见表9。

[0062] 表8：延伸反应体系

[0063]试剂 体积(ul)/反应
水 0.659
iPlex反应缓冲液 0.2
iPlex Termination Mix 0.2
表3中延伸引物混合物 0.9
Extension反应Taq酶 0.041
步骤(2)中获得PCR扩增产物 7.0
总体积 9.0

[0064] 表9：延伸反应条件

[0065]

[0066] (4)采用树脂resin纯化步骤(3)中获得延伸产物，去除干扰离子。

[0067] 在延伸产物中加入20ul水和6mg洁净干燥的树脂，低速垂直旋转30min，使树脂与反应物充分接触。4000rpm离心5min使树脂沉入孔底部，上清可直接用于质谱检测。

[0068] (5)芯片点样

[0069] 启动MassARRAYNanodispenserRS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上。

[0070] (6)质谱分析

[0071] 将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI‑TOF分析，检测结果使用TYPER4.0软件分型并输出结果。

[0072] (7)SLC25A13基因检测结果

[0073] 图1为IVS16ins3kb野生纯合型样本的检测结果，起峰在分子质量为7383.9Da的T峰位置，此数据表明该样本为纯合T；图2为IVS16ins3kb杂合型样本的检测结果，起峰在分
子质量为7383.9Da的T峰和7399.9Da的C峰，此数据表明该样本为杂合。图3为c.852_855del
野生型纯合型样本的检测结果，起峰在分子质量为5423.4Da的峰位置，此数据表明该样本
为纯合；图4为c.852_855del突变纯合型样本的检测结果，起峰在分子质量为5367.5Da的
del峰位置，此数据表明该样本为纯合；图5为c.852_855del杂合型样本的检测结果，起峰在
分子质量为5367.5Da的del峰和5423.4Da的峰位置，此数据表明该样本为杂合。图6为野生
纯合型样本的检测结果，起峰在分子质量为6425.2Da的G峰位置，此数据表明该样本为纯合
G；图7为c.1177+1G>A杂合型样本的检测结果，起峰在分子质量为6425.2Da的G峰和
6409.2Da的A峰位置，此数据表明该样本为杂合。图8为野生纯合型样本的检测结果，起峰在
分子质量为6780.5Da的G峰位置，此数据表明该样本为纯合G；图9为c.615+5G>A杂合型样本
的检测结果，起峰在分子质量为6780.5Da的G峰和6764.5Da的A峰位置，此数据表明该样本
为杂合。

[0074] 以上所述的实验结果，仅为表示本发明的SLC25A13基因的突变位点的检测方法实际应用效果，因此不应以此实验结果限制本发明的范围。