EGTA用于预防或治疗非洲猪瘟的新用途转让专利
申请号 : CN202110293021.7
文献号 : CN113181154B
文献日 : 2021-12-21
发明人 : 郑海学 , 李丹 , 李玲霞 , 杨文萍 , 田宏 , 茹毅 , 朱国强 , 任静静 , 杨帆 , 张克山 , 杨波
申请人 : 中国农业科学院兰州兽医研究所
摘要 :
本发明属于非洲猪瘟治疗技术领域，具体涉及一种EGTA用于预防或治疗非洲猪瘟的新用途。本发明意外发现，EGTA能够显著抑制非洲猪瘟病毒蛋白p72的表达，阻止病毒入侵宿主细胞，可用于抑制非洲猪瘟病毒的感染；并且EGTA能够显著抑制非洲猪瘟病毒的复制，降低非洲猪瘟病毒感染后的病毒滴度，可作为非洲猪瘟病毒的抑制剂，用于预防或治疗非洲猪瘟。
权利要求 :
1.EGTA在制备非洲猪瘟病毒p72蛋白表达抑制剂中的应用，所述EGTA的结构式如下式(Ⅰ)所示：
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述EGTA加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
3.EGTA在制备治疗非洲猪瘟药物中的应用，所述EGTA的结构式如下式(Ⅰ)所示：
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述EGTA加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
说明书 :
EGTA用于预防或治疗非洲猪瘟的新用途
技术领域
[0001] 本发明属于非洲猪瘟治疗技术领域，具体涉及一种EGTA用于预防或治疗非洲猪瘟的新用途。
背景技术
[0002] 非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种以猪发热和猪全身脏器出血为特征的急性烈性传染病，对于家猪的病死率高达100％。该病
首先于1921在肯尼亚爆发，随后在整个非洲的家猪和野猪中广泛流行。20世纪50年代传入
欧洲，整个欧洲用了40年消除该病。然而，该病自2007年再次从东非传入格鲁吉亚，随后便
广泛在东欧散播，并于2017年传入俄罗斯远东地区伊尔库斯克。
首先于1921在肯尼亚爆发，随后在整个非洲的家猪和野猪中广泛流行。20世纪50年代传入
欧洲，整个欧洲用了40年消除该病。然而，该病自2007年再次从东非传入格鲁吉亚，随后便
广泛在东欧散播，并于2017年传入俄罗斯远东地区伊尔库斯克。
[0003] p72是ASFV中的关键结构蛋白，是一种衣壳蛋白，是非洲猪瘟病毒的主要结构蛋白，能保护病毒核酸免受环境中核酸酶或其他理化因素破坏，同时参与病毒的感染过程且
具有良好的免疫原性，该蛋白产生于病毒感染晚期，p72作为ASFV的重要抗原蛋白，是病毒
二十面体的主要成分，对于病毒衣壳的形成至关重要，参与病毒结合细胞。
具有良好的免疫原性，该蛋白产生于病毒感染晚期，p72作为ASFV的重要抗原蛋白，是病毒
二十面体的主要成分，对于病毒衣壳的形成至关重要，参与病毒结合细胞。
[0004] EGTA是一种化学物质，即乙二醇双(2‑氨基乙基醚)四乙酸，分子式是C14H24N2O10，是一种钙鳌合剂。其中有文献(Yang,et al.Gammaherpesvirus BoHV‑4infects bovine
respiratory epithelial cells mainly at the basolateral side.)公开了在鼻腔上皮
细胞顶端接种EGTA后，能够促进牛疱疹病毒4型(BoHV‑4)的产生，即EGTA能够促进BoHV‑4的
复制。
respiratory epithelial cells mainly at the basolateral side.)公开了在鼻腔上皮
细胞顶端接种EGTA后，能够促进牛疱疹病毒4型(BoHV‑4)的产生，即EGTA能够促进BoHV‑4的
复制。
[0005] 而本发明意外发现，EGTA能够显著抑制非洲猪瘟病毒p72蛋白的表达，可用于抑制ASFV 的晚期感染；并且EGTA能够显著抑制非洲猪瘟病毒的复制，降低非洲猪瘟病毒感染后
病毒滴度，可作为非洲猪瘟病毒的抑制剂，用于预防或治疗非洲猪瘟。
病毒滴度，可作为非洲猪瘟病毒的抑制剂，用于预防或治疗非洲猪瘟。
发明内容
[0006] 针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种EGTA用于抑制非洲猪瘟病毒的新用途。具体包括以下方案：
[0007] 第一方面，本发明提供了一种EGTA或其药学上可接受的盐在制备非洲猪瘟病毒p72蛋白表达抑制剂中的应用，所述EGTA的结构式如下式(Ⅰ)所示：
[0008]
[0009] 优选地，所述EGTA或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
[0010] 第二方面，本发明提供了一种EGTA或其药学上可接受的盐在制备治疗非洲猪瘟药物中的应用，所述EGTA的结构式如下式(Ⅰ)所示：
[0011]
[0012] 优选地，所述EGTA或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
[0013] 第三方面，本发明提供了一种EGTA或其药学上可接受的盐在制备预防非洲猪瘟药物中的应用，所述EGTA的结构式如下式(Ⅰ)所示：
[0014]
[0015] 优选地，所述EGTA或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
[0016] 本发明的有益效果是：本发明意外发现，EGTA能够显著抑制非洲猪瘟病毒蛋白p72的表达，可用于抑制ASFV的感染；并且EGTA能够显著抑制非洲猪瘟病毒的复制，降低非洲猪
瘟病毒感染后的病毒滴度，可作为非洲猪瘟病毒的抑制剂，用于预防或治疗非洲猪瘟。
瘟病毒感染后的病毒滴度，可作为非洲猪瘟病毒的抑制剂，用于预防或治疗非洲猪瘟。
附图说明
[0017] 图1非洲猪瘟病毒感染基因拷贝数；
[0018] 图2非洲猪瘟病毒感染后的病毒滴度；
[0019] 图3非洲猪瘟病毒感染后p72蛋白表达结果图；
[0020] 图4EGTA的细胞毒性结果图。
具体实施方式
[0021] 为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
[0022] 以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和非洲猪瘟实验室活动许可：
[0023] 中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL‑3)和非洲猪瘟相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农
业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安
全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性ASFV病原及动物研究许可，并已在农业
农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。
业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安
全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性ASFV病原及动物研究许可，并已在农业
农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。
[0024] 以下实施例中所述的实验细胞、病毒来源：
[0025] 原代猪骨髓巨噬细胞(BMDM)取自2‑4月龄健康SPF巴马小型猪，无菌采集细胞后，用红细胞裂解液(购自索莱宝公司)，去除红细胞，低速离心后，弃上清，将细胞沉淀重悬于
含有10％FBS(购自Hyclone公司)的RPMI 1640完全培养基(购自Gibco公司)中，置于 37℃，
5％CO2培养箱中培养。
含有10％FBS(购自Hyclone公司)的RPMI 1640完全培养基(购自Gibco公司)中，置于 37℃，
5％CO2培养箱中培养。
[0026] ASFV CN/GS/2018分离株为Ⅱ型非洲猪瘟病毒株来自国家非洲猪瘟区域实验室7
(兰州)，属于基因Ⅱ型，病毒效价为5×10 TCID50/mL，为PAM细胞扩繁后的第4代种毒，于
2020年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：V202096；保藏地址：
中国武汉，武汉大学；联系电话：027‑68752319。
(兰州)，属于基因Ⅱ型，病毒效价为5×10 TCID50/mL，为PAM细胞扩繁后的第4代种毒，于
2020年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：V202096；保藏地址：
中国武汉，武汉大学；联系电话：027‑68752319。
[0027] EGTA，购买于Sigma公司。
[0028] 实验中其他试剂如果没有特别说明均为常见的市售试剂；实验中的操作如果没有特别说明均是本领域知晓的操作方法。
[0029] 本发明中所述的非洲猪瘟病毒p72蛋白表达抑制剂是指科学研究用的实验试剂。本发明所述化合物EGTA能够抑制非洲猪瘟病毒p72蛋白的表达，可作为科学研究用的实验
试剂用于研究非洲猪瘟病毒p72蛋白的相关机理。
试剂用于研究非洲猪瘟病毒p72蛋白的相关机理。
[0030] 实施例1 EGTA对非洲猪瘟病毒感染复制和基因转录表达的影响
[0031] 1.非洲猪瘟病毒感染检测病毒基因转录水平表达
[0032] 用培养基RPMI 1640(含10％FBS培养+1％双抗)将BMDM细胞铺于12孔板，过夜培养。实验组加入EGTA(6mM)，对照组用DMSO(1％)处理细胞2h；然后弃掉上清，采用 ASFV CN/
GS/2018毒株(MOI＝0.1)同时感染两组细胞。在37℃，5％CO2条件下继续培养6h、12h、24h。
按照以上不同感染时间点收取细胞，在‑80℃反复冻融后收集细胞培养物，离心，取上清。用
Q‑PCR方法检测EGTA对ASFV病毒复制的影响，利用公式计算ASFV病毒基因拷贝数。
GS/2018毒株(MOI＝0.1)同时感染两组细胞。在37℃，5％CO2条件下继续培养6h、12h、24h。
按照以上不同感染时间点收取细胞，在‑80℃反复冻融后收集细胞培养物，离心，取上清。用
Q‑PCR方法检测EGTA对ASFV病毒复制的影响，利用公式计算ASFV病毒基因拷贝数。
[0033] Q‑PCR反应体系总体积为25μL，包括2×Pro Taq HS Probe Premix12.5μL，上下游引物各 1μL，ASFV探针引物1μL，模板3μL，补充无菌去离子水至总体积为25μL；
[0034] 上游引物5’‑CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA‑3’；
[0035] 下游引物5’‑GATACCACAAGATCAGCCGT‑3’。
[0036] 反应程序为：95℃，2min；95℃，7s，60℃，12s，3cycles；95℃，6s，58℃，11s，40cycles。
[0037] 基因拷贝数检测结果如图1所示，随着ASFV感染时间的延长，病毒基因复制水平逐渐升高；并且在病毒感染后12h和24h时，与对照DMSO处理组相比，加入EGTA后能显著抑制
ASFV病毒的复制。结果表明，化合物EGTA能够显著抑制非洲猪瘟病毒基因表达，抑制 ASFV
病毒的复制。
ASFV病毒的复制。结果表明，化合物EGTA能够显著抑制非洲猪瘟病毒基因表达，抑制 ASFV
病毒的复制。
[0038] 2.非洲猪瘟病毒感染后病毒滴度检测
[0039] 用培养基RPMI 1640(含10％FBS培养+1％双抗)将BMDM细胞铺于12孔板，过夜培养。实验组加入EGTA(6mM)，对照组用DMSO(1％)处理细胞2h；然后弃掉上清，采用 ASFV CN/
GS/2018毒株(MOI＝0.1)同时感染两组细胞。在37℃，5％CO2条件下继续培养 6h、12h、24h。
按照以上不同感染时间点收取细胞，在‑80℃反复冻融后收集细胞培养物，离心，取上清。然
后实验组和对照组各取100μL上清，用无抗无血清的RPMI 1640培养基做连续10倍梯度稀
‑1 ‑2 ‑3 ‑4 ‑5 ‑6 ‑7 ‑8
释，共8个稀释度(包括10 ，10 ，10 ，10 ，10 ，10 ，10 ，10 )，接种到含有BMDM细胞的96
孔板中进行培养，每个稀释度重复8个孔，独立重复实验3次。将细胞培养板置于37℃，5％
CO2条件继续培养5天，每天观察各细胞培养孔中细胞病变情况，最后计算TCID50值。
GS/2018毒株(MOI＝0.1)同时感染两组细胞。在37℃，5％CO2条件下继续培养 6h、12h、24h。
按照以上不同感染时间点收取细胞，在‑80℃反复冻融后收集细胞培养物，离心，取上清。然
后实验组和对照组各取100μL上清，用无抗无血清的RPMI 1640培养基做连续10倍梯度稀
‑1 ‑2 ‑3 ‑4 ‑5 ‑6 ‑7 ‑8
释，共8个稀释度(包括10 ，10 ，10 ，10 ，10 ，10 ，10 ，10 )，接种到含有BMDM细胞的96
孔板中进行培养，每个稀释度重复8个孔，独立重复实验3次。将细胞培养板置于37℃，5％
CO2条件继续培养5天，每天观察各细胞培养孔中细胞病变情况，最后计算TCID50值。
[0040] 病毒感染细胞会产生细胞病变，通过细胞病变数计算TCID50值。结果如图2所示，相较于DMSO对照组，ASFV病毒感染12h及24h时，用EGTA处理后的ASFV病毒TCID50值显著降低。
以上结果进一步表明，化合物EGTA能够显著抑制ASFV的病毒滴度，抑制ASFV 病毒复制。
以上结果进一步表明，化合物EGTA能够显著抑制ASFV的病毒滴度，抑制ASFV 病毒复制。
[0041] 3.非洲猪瘟病毒感染p72蛋白表达水平
[0042] 用培养基RPMI 1640(含10％FBS培养+1％双抗)将BMDM细胞铺于12孔板，过夜培养。实验组加入EGTA(6mM)，对照组用DMSO(1％)处理细胞2h；然后弃掉上清，采用 ASFV CN/
GS/2018毒株(MOI＝0.1)同时感染两组细胞。在37℃，5％CO2条件下继续培养 6h、12h、24h。
按照以上不同感染时间点收取细胞，在2000rpm，4℃离心10min，弃上清收取细胞。然后采用
细胞裂解液裂解细胞，置于冰上裂解30min。12000rpm，4℃离心10min，收取上清，按比例加
入4×loading buffer，100℃煮沸10min，12000rpm，4℃离心10min。进行蛋白电泳。转膜后，
NC膜在室温封闭2h。加入一抗，抗兔P72抗体(1:1000)，内参抗兔β‑actin抗体(1:5000)，4℃
过夜，TBST洗膜3次，每次10min。加入二抗，抗兔‑HRP(1:5000)，室温1h。TBST洗膜3次，每次
10min。最后采用ECL显影液曝光。
GS/2018毒株(MOI＝0.1)同时感染两组细胞。在37℃，5％CO2条件下继续培养 6h、12h、24h。
按照以上不同感染时间点收取细胞，在2000rpm，4℃离心10min，弃上清收取细胞。然后采用
细胞裂解液裂解细胞，置于冰上裂解30min。12000rpm，4℃离心10min，收取上清，按比例加
入4×loading buffer，100℃煮沸10min，12000rpm，4℃离心10min。进行蛋白电泳。转膜后，
NC膜在室温封闭2h。加入一抗，抗兔P72抗体(1:1000)，内参抗兔β‑actin抗体(1:5000)，4℃
过夜，TBST洗膜3次，每次10min。加入二抗，抗兔‑HRP(1:5000)，室温1h。TBST洗膜3次，每次
10min。最后采用ECL显影液曝光。
[0043] 如图3结果所示：在对照DMSO处理组中，随着ASFV病毒感染P72蛋白表达逐渐升高。而EGTA处理后能够显著抑制非洲猪瘟病毒基因P72蛋白的表达水平，从而阻止病毒入侵宿
主细胞，可用于抑制ASFV的晚期感染。
主细胞，可用于抑制ASFV的晚期感染。
[0044] 实施例2EGTA的细胞毒性
[0045] 为了判定小分子化合物EGTA对原代细胞是否产生毒性或者影响细胞存活，本实验采用 CCK‑8法检测EGTA对细胞活率的影响。首先用培养基RPMI 1640(含10％FBS培养+1％
5
双抗)复苏猪源骨髓巨噬细胞(BMDM)，按2×10/孔铺于96孔板过夜培养。然后向孔中加入
不同浓度的EGTA(0mM、4mM、6mM、8mM、10mM、20mM、30mM、40mM)，同时设置空白孔(仅含有培养
基)，对照孔为0mM EGTA组，每组做6个重复孔。将培养板在37℃培养箱中孵育16h，然后每孔
加入10μL的CCK‑8溶液，混匀后将培养板在培养箱中继续孵育1‑4h。读取酶标仪测量450nm
处的吸光度，利用公式计算细胞存活率。
5
双抗)复苏猪源骨髓巨噬细胞(BMDM)，按2×10/孔铺于96孔板过夜培养。然后向孔中加入
不同浓度的EGTA(0mM、4mM、6mM、8mM、10mM、20mM、30mM、40mM)，同时设置空白孔(仅含有培养
基)，对照孔为0mM EGTA组，每组做6个重复孔。将培养板在37℃培养箱中孵育16h，然后每孔
加入10μL的CCK‑8溶液，混匀后将培养板在培养箱中继续孵育1‑4h。读取酶标仪测量450nm
处的吸光度，利用公式计算细胞存活率。
[0046] 结果如图4所示，EGTA的细胞毒性较小，用不同浓度的EGTA处理细胞后，细胞存活率均高于50％；且当EGTA在浓度小于6mM时，细胞存活率达到100％以上，对细胞基本无毒
性，安全性较好。
性，安全性较好。
[0047] 综上所述，本发明所述EGTA能够显著抑制非洲猪瘟病毒蛋白p72的表达，阻止病毒入侵宿主细胞，可用于抑制ASFV的感染；并且EGTA能够显著抑制非洲猪瘟病毒的复制，降低
非洲猪瘟病毒感染后病毒滴度，可作为非洲猪瘟病毒的抑制剂，用于预防或治疗非洲猪瘟。
以上之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围故凡依本发明
专利范围的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围。
非洲猪瘟病毒感染后病毒滴度，可作为非洲猪瘟病毒的抑制剂，用于预防或治疗非洲猪瘟。
以上之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围故凡依本发明
专利范围的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围。