CD47阻断剂在制备预防和/或治疗急性胰腺炎的药物中的应用

摘要

本发明公开了CD47阻断剂在制备预防和/或治疗急性胰腺炎的药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明通过模拟两种与临床相关的急性胰腺炎模型：雨蛙素诱导C57BL/6小鼠急性胰腺炎模型和胆管结扎诱导C57BL/6小鼠重症急性胰腺炎模型，实验结果证明，将CD47阻断剂腹腔注射小鼠体内，能显著改善上述两种AP模型的发生发展，可用于临床预防/治疗AP。本发明提供的抑制急性胰腺炎的药物安全度高，药理作用较强，疗效明确。本发明为预防、诊断、检测、保护、治疗和研究胰腺炎疾病提供了一种新的药物来源，且容易推广应用临床，能够在较短时间内产生巨大的临床应用前景和社会效益。

权利要求

1.CD47阻断剂在制备预防和/或治疗急性胰腺炎的药物中的应用，其特征在于，所述的药物为通过靶向清除损伤的腺泡细胞减轻炎症反应的药物，所述CD47阻断剂为CD47抗体。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为增加巨噬细胞吞噬损伤腺泡细胞的药物。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为改善胰腺损伤的药物。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为降低血清淀粉酶和血清脂肪酶水平的药物。

说明书

CD47阻断剂在制备预防和/或治疗急性胰腺炎的药物中的

应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，涉及CD47阻断剂在制备预防和/或治疗急性胰腺炎的药物中的应用。

背景技术

[0002] 急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是由胰腺酶原过度激活引起的消化道非感染性炎症性疾病，有疾病急，发病迅速，病死率极高等临床特点。临床轻症病人占AP多数，可通过内科保守治疗恢复胰腺功能，病死率及风险程度较低。少数病人因控制不佳可能累及胰腺周围器官或远端组织，进展为重症急性胰腺炎(sever acute pancreatitis，SAP)，SAP临床早期病死率较高，后期合并全身炎症感染，发展为全身炎症反应综合征，死亡率高达40％‑70％(Chan Y C,Leung P S.Acute pancreatitis:animal models and recent advances in basic research.[J].Pancreas,2007Jan；34(1):1‑14.(Greenberg J A,Jonathan H,Mohammad B,et al.Clinical practice guideline:management of acute pancreatitis.[J].Canadian Journal of Surgery,2016,59(2):128‑140)。

[0003] 腺泡细胞内胰蛋白酶原的激活和释放引起的腺泡细胞损伤/死亡是调控AP发生发展的早期事件之一。过度损伤且未被及时清除的腺泡细胞可持续性损伤胰腺，累及周围器官及远端脏器，调节过度炎症反应及多器官功能障碍。这些受损的腺泡细胞是否能在早期病变中被巨噬细胞识别并及时清除。在AP研究中尚不可知。

[0004] CD47分子，也被称为整合素相关蛋白(IAP)，广泛表达于多种细胞表面，是众所周知的“不要吃我”分子，属于膜表面受体分子的一类，可在多种癌症疾病中发挥着重要的作用。在诸多恶性细胞表面高表达CD47可使其抵抗巨噬细胞识别效应从而逃逸肿瘤细胞的程序化清除(efferocytosis)(Hayat S,Bianconi V,Pirro M,et al.CD47:role in the immune system and application to cancer therapy[J].Cellular Oncology,2019,43(1).)。已有文章表明CD47在动脉粥样硬化疾病中显著高表达，使用抗CD47阻断性抗体有助于清除血管病变物质，并在多种小鼠模型和患者中改善动脉粥样硬化(Ryan,John J.CD47‑Blocking Antibodies andAtherosclerosis[J].Jacc Basic to Translational Science,2016,1(5):413‑415)。

[0005] 而CD47在AP中的调控作用尚不可知，且抑制CD47能否调控损伤/死亡的腺泡细胞早期及时被清除(巨噬细胞胞葬作用)尚待研究。

发明内容

[0006] 为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供CD47阻断剂在制备预防和/或治疗急性胰腺炎的药物中的应用。

[0007] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

[0008] 本发明公开了CD47阻断剂在制备预防和/或治疗急性胰腺炎的药物中的应用。

[0009] 优选地，所述的药物为通过靶向清除损伤的腺泡细胞减轻炎症反应的药物。

[0010] 进一步优选地，所述的药物为增加巨噬细胞吞噬损伤腺泡细胞的药物。

[0011] 优选地，所述的药物为改善胰腺损伤的药物。

[0012] 优选地，所述的药物为降低血清淀粉酶和血清脂肪酶水平的药物。

[0013] 本发明公开了一种产品，其活性成分为CD47阻断剂，所述产品的用途至少包括下述用途中的一种：

[0014] a)改善急性胰腺炎的炎症反应；

[0015] b)增强巨噬细胞胞葬清除作用；

[0016] c)抑制急性胰腺炎的疾病发生/发展；

[0017] 所述产品为药物、添加剂或活性成分剂。

[0018] 本发明还公开了一种用于预防/治疗急性胰腺炎的药物，所述药物是由CD47阻断剂和药学上可添加的辅料组成。

[0019] 优选地，所述辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的一种或多种。

[0020] 优选地，所述药物能够通过口服、注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收，以及物理或化学介导的方法导入机体组织中；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

[0021] 进一步地，本发明所指的CD47阻断剂购买自Bio X Cell公司，货号为BE0283；克隆号：MIAP410。

[0022] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0023] 本发明提供了CD47阻断剂在制备抑制急性胰腺炎药物中的应用，通过模拟两种与临床相关的急性胰腺炎模型：①雨蛙素(100ug/kg，每小时1针，连续7针)腹腔注射诱导C57BL/6小鼠急性胰腺炎；②胆管结扎诱导C57BL/6小鼠重症急性胰腺炎。实验结果证明，将CD47阻断剂腹腔注射小鼠体内，能显著改善上述两种AP模型的发生发展，可用于临床预防/治疗AP。同时，本发明通过实验验证，CD47阻断剂对急性胰腺炎的抑制作用是通过靶向清除损伤的腺泡细胞而实现减轻AP炎症反应、降低AP严重程度的作用。

[0024] 本发明提供的抑制急性胰腺炎的药物安全度高，药理作用较强，疗效明确。本发明为预防，诊断，检测，保护，治疗和研究胰腺炎疾病提供了一种新的药物来源，且容易推广应用临床，能够在较短时间内产生巨大的临床应用前景和社会效益。

附图说明

[0025] 图1为实施例1中雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠胰腺组织CD47表达情况及其统计结果；其中，(a)为CD47和GAPDH蛋白表达情况；(b)为CD47和GAPDH蛋白统计情况；(c)为小鼠胰腺组织CD47 RNA水平。

[0026] 图2为实施例2中CD47阻断剂腹腔注射可显著改善雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠胰腺损伤结果图(水肿，炎症渗出，坏死)；其中，(a)为小鼠胰腺组织HE染色病理图；(b)为胰腺损伤病理评分统计图。

[0027] 图3为实施例2中CD47阻断剂腹腔注射可降低雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎血清淀粉酶和血清脂肪酶水平结果图；其中，(a)为血清淀粉酶水平；(b)为血清脂肪酶水平。

[0028] 图4为实施例2中CD47阻断剂腹腔注射可显著增加巨噬细胞“胞葬作用”；如图(a)为小鼠胰腺组织电镜图，scar bar＝2uM；(b)为巨噬细胞吞噬损伤腺泡细胞比例统计图。

[0029] 图5为实施例3中CD47阻断剂腹腔注射可改善胆管结扎诱导的急性胰腺炎小鼠胰腺损伤；其中，(a)为小鼠胰腺组织HE染色病理图；(b)为胰腺损伤病理评分统计图。

[0030] 图6为实施例3中CD47阻断剂腹腔注射可降低胆管结扎诱导的小鼠急性胰腺炎血清淀粉酶和血清脂肪酶水平结果图；其中，(a)为血清淀粉酶水平；(b)为血清脂肪酶水平。

[0031] 图7为实施例4中在胆囊收缩素(CCK)诱导的腺泡细胞体外急性胰腺炎模型中CD47表达活化情况；其中，(a)为小鼠胰腺组织腺泡细胞CD47 mRNA水平；(b)为小鼠腺泡细胞株266‑6细胞CD47 mRNA水平。

[0032] 图8为实施例5中CD47阻断剂调上调巨噬细胞吞噬作用，且不影响腺泡细胞死亡(CCK诱导的体外急性AP模型)结果图；其中，(a)为巨噬细胞吞噬腺泡细胞水平，(b)为细胞LDH释放检测水平。

[0033] 图9为实施例6中CD47阻断剂调上调巨噬细胞吞噬作用,且不影响腺泡细胞死亡(STS诱导的体外AP损伤模型)结果图；其中，(a)为巨噬细胞吞噬腺泡细胞水平，(b)为细胞CCK8检测水平。

具体实施方式

[0034] 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

[0035] 需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

[0036] 下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

[0037] 本发明实施例所用到的实验方法，如没有特殊说明，均为常规方法。实施例中所应用的试剂材料均可常规购买，实施例中涉及的定量实验，均设置至少三次重复实验，结果取平均值。

[0038] 所用C57/BL6小鼠购买自南京大学模式动物中心。

[0039] 所用雨蛙素(Caerulein)购买自MCE公司，货号为HY‑A0190。

[0040] 所用胆囊收缩素(CCK)购买自sigma‑aldrich公司，货号为T6515。

[0041] 所用CD47阻断剂购买自Bio X Cell公司，货号为BE0283；克隆号：MIAP410。

[0042] 实施例1:CD47在雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎中的活化情况

[0043] 雨蛙素诱导的小鼠轻症急性胰腺炎模型

[0044] 实验动物：6‑8周雄性C57BL/6J小鼠(体重20‑25g)。

[0045] 将实验动物分为正常对照组和不同时间(6h,12h,24h)模型组。模型组小鼠腹腔注射雨蛙素(100ug/kg，间隔1h，连续7针)构建急性胰腺炎模型。对照组小鼠给予严格PBS对照腹腔注射。留取小鼠血清进行血清酶学水平和炎症因子水平检测。随后，小鼠进行在体心脏灌流，以除去循环中的血液，快速提取胰腺组织进行固定脱水，制作HE染色的石蜡切片和免疫组化染色，结果参见图1，在雨蛙素诱导的急性胰腺炎中，胰腺组织水肿，炎症渗出，腺泡细胞坏死是反应疾病严重程度的重要指标。如图1中(a)和(b)所示，western blot观察胰腺组织CD47表达情况，显示CD47在坏死的腺泡细胞上持续高表达，并与急性胰腺炎疾病严重程度呈正相关，GPDH为对照蛋白。如图1中(c)所示，通过Q‑PCR观察小鼠胰腺组织CD47mRNA水平与蛋白水平结果相一致。

[0046] 实施例2:抗CD47阻断剂在预防/治疗急性胰腺炎中的应用

[0047] 一、雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎模型

[0048] 根据实施例1实际操作和模型诱导情况，选取12h雨蛙素诱导模型作为后续研究。造模方式同实施例1。

[0049] 二、抗CD47阻断剂腹腔注射

[0050] 模型组小鼠随机分为Control组，AP(acute pancreatitis)组，抗CD47阻断剂(5mg/kg)治疗组，每组7只，于雨蛙素造模前0h腹腔注射抗CD47阻断剂(可溶于PBS溶液)，AP组给予严格IgG抗体进行严格对照。所有小鼠于腹腔注射第一针雨蛙素后12h进行腹腔注射5％水合氯醛麻醉，留取小鼠血清进行血清酶学水平。随后，小鼠进行在体心脏灌流，以除去循环中的血液，快速提取胰腺组织进行固定脱水，制作HE染色的石蜡切片和免疫组化染色。

[0051] 结果如图2和图3所示，可以看出，5mg/kg抗CD47阻断剂可以显著改善胰腺组织损伤情况(水肿、炎症渗出和腺泡细胞坏死)，改善血清酶学和血清淀粉酶水平。此外，巨噬细胞对于损伤/死亡的腺泡细胞早期清除作用能够改善小鼠急性胰腺炎损伤情况，且如图4小鼠胰腺组织电镜图(scar bar＝2uM)提示：5mg/kg抗CD47阻断剂腹腔注射小鼠体内可显著增加巨噬细胞吞噬作用及吞噬比例(连续吞噬可见)。上述结果提示抑制CD47可能改善或缓解急性胰腺炎的发生发展。*代表显著差异P＜0.05，**代表显著差异P＜0.01，***代表显著差异P＜0.001。

[0052] 实施例3:抗CD47阻断剂在预防/治疗重症急性胰腺炎中的应用

[0053] 一、胆管结扎(PDL)诱导的小鼠重症急性胰腺炎模型

[0054] 实验动物：6‑8周C57/BL6雄性小鼠(体重20‑25g)

[0055] 将实验动物分为假手术组，模型组和抗CD47阻断剂(5mg/kg)治疗组(每组10只)[0056] 1、实验动物腹腔注射5％水合氯醛麻醉(按照体重注射，8ul/g)。

[0057] 2、所有实验动物麻醉后，固定在手术操作台上。模型组开腹后，应用手术镊钝性分离胆总管，于胆总管下端近胰腺处应用#4丝线进行结扎，逐层关闭腹腔并缝合皮肤。假手术组仅进行开腹关腹相关操作，不进行胆管结扎手术。所有小鼠进行手术操作后于37摄氏度恒温操作台恢复30min。

[0058] 二、抗CD47阻断剂腹腔注射

[0059] 治疗组于0h腹腔注射抗CD47阻断剂(5ug/只)，模型组组小鼠腹腔注射IgG对照抗体进行严格对照，假手术小鼠均腹腔注射PBS溶液。所有小鼠于造模开始后24h,48h留取血清，48h进行腹腔注射5％水合氯醛麻醉，留取胰腺组织制作HE染色的石蜡切片。

[0060] 结果如图5中(a)和(b)所示，5mg/kg抗CD47阻断剂可显著改善PDL小鼠胰腺组织损伤情况(胰腺组织水肿、炎症渗出，腺泡细胞坏死)，此外，如图6中(a)和(b)所示，抑制CD47可改善血清酶学和血清淀粉酶水平。

[0061] 实施例4:CD47在胆囊收缩素(CCK)诱导的AP腺泡细胞损伤中表达情况[0062] 原代腺泡细胞：提取6‑8周C57/BL6雄性小鼠胰腺腺泡细胞，接种于六孔板中，使用1M Hepes培养基(含10％FBS)，37摄氏度，5％CO2温箱中稳定培养。给以CCK建立体外细胞损伤(0h，1h，2h，6h)模型。

[0063] 小鼠胰腺腺泡细胞癌株(266‑6细胞)：将266‑6细胞(购买自ATCC库)接种于25cm2细胞培养瓶中，使用DMEM培养基(含10％FBS,100U/ML青霉素和100ug/ml链霉素)，37摄氏度，5％CO2温箱中稳定培养传代。取对数生长期内状态良好的细胞接种到六孔板，更换新的DMEM培养基，给以CCK建立体外细胞损伤(0h，3h，6h，9h)模型。

[0064] 通过Q‑PCR观察腺泡细胞CD47 mRNA水平。如图7(a)和(b)所示CD47在坏死的腺泡细胞上持续高表达，并与腺泡细胞损伤严重程度呈正相关。*代表显著差异P＜0.05，**代表显著差异P＜0.01，***代表显著差异P＜0.001。

[0065] 实施例5:抗CD47阻断剂上调巨噬细胞吞噬作用，且不影响腺泡细胞死亡的应用(CCK诱导的腺泡细胞损伤模型)

[0066] 提取小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)接种到10mm细胞平皿上，使用1640培养基(含10％FBS,100U/ML青霉素和100ug/ml链霉素)培养细胞，同时加入M‑CSF刺激因子体外诱导巨噬细胞成熟后接种到24孔板上。应用脂多糖(LPS)诱导BMDM极化。266‑6细胞处理同实施案例4。将上述两种细胞进行共培养6小时后收取细胞进行后续实验。具体分组如下：

[0067] 对照组：培养6小时；

[0068] IgG组：IgG对照抗体，培养6小时；

[0069] CCK+IgG组：每孔加入5uM胆囊收缩素(CCK)和IgG对照抗体，培养6小时；

[0070] CCK+抗CD47阻断剂组：每孔加入5uM胆囊收缩素(CCK)和5ug/ml抗CD47阻断剂培养6小时。

[0071] 收集各组细胞，进行腺泡细胞示踪染色和免疫细胞染色。如图8(a)‑(b)所示：损伤的腺泡细胞会被巨噬细胞吞噬，应用抗CD47阻断剂干预可显著上调巨噬细胞吞噬比例。

[0072] 实施例6:抗CD47阻断剂上调巨噬细胞吞噬作用,且不影响腺泡细胞死亡的应用(星形孢菌素STS诱导的腺泡细胞损伤模型)

[0073] BMDM细胞和266‑6细胞处理同实施案例5。具体分组如下：

[0074] 对照组：培养6小时；

[0075] IgG组：IgG对照抗体，培养6小时；

[0076] CCK+IgG组：每孔加入500nM星形孢菌素(STS)和IgG对照抗体，培养6小时；

[0077] CCK+抗CD47阻断剂组：每孔加入5uM星形孢菌素(CCK)和5ug/ml抗CD47阻断剂培养6小时。

[0078] 收集各组细胞，进行腺泡细胞示踪染色和免疫细胞染色。如图9(a)‑(b)所示：损伤的腺泡细胞会被巨噬细胞吞噬，应用抗CD47阻断剂干预可显著上调巨噬细胞吞噬比例。

[0079] 以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。