一种多重耐药的幽门螺旋杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一种多重耐药的幽门螺旋杆菌及其应用。本发明提供了耐阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑、四环素等五种抗生素的幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori)GZ6B5，保藏号GDMCC No：61571。本发明提供了一种明确携带2种多药耐药基因hp1181及hp1184的多重耐药靶向菌株，该菌对目前临床获批用于治疗幽门螺旋杆菌的5种抗生素全部耐受，可作为筛选新型功能微生物、药物及抗菌材料中的靶向菌株，具有良好的应用前景。

权利要求

1.幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori）GZ6B5，保藏号GDMCC No：61571。

2.一种能够特异性识别如权利要求1所述的幽门螺旋杆菌GZ6B5的核苷酸序列，其特征在于，该序列如SEQ ID NO.6所示。

说明书

一种多重耐药的幽门螺旋杆菌及其应用

技术领域：

[0001] 本发明属于微生物技术和医药技术领域，具体涉及一种同时携带hp1181和hp1184两种耐药基因且对五种临床常用抗生素均耐药的幽门螺旋杆菌及其应用。背景技术：

[0002] 幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，HP)是一种革兰氏阴性、微需氧螺旋状细菌，与人类胃肠道疾病密切相关。研究指出，幽门螺旋杆菌感染可引起慢性胃炎，并促进多种消化道疾病的发生、发展，如消化不良、消化性溃疡和胃癌。其中，幽门螺旋杆菌感染最严重的后果为诱发胃癌，有研究指出，全球90％的胃癌发病与幽门螺旋杆菌感染密切相关。据世界卫生组织统计，胃癌是全球发病率排名第四、致死率第二的癌症，每年导致近75万人死亡。因此，幽门螺旋杆菌感染严重威胁人类的健康、造成庞大的经济与社会损失，预防和治疗幽门螺旋杆菌感染具有巨大的应用研究价值。

[0003] 幽门螺旋杆菌的治疗方案与其他微生物感染完全不同。由于该菌分离培养难度极大，医生主要依赖于临床经验及大型卫生机构(如世界卫生组织)的统计结果制定抗感染方案。目前，世界卫生组织推荐治疗幽门螺旋杆菌感染的方案是以克拉霉素为主的三联疗法：由质子泵抑制剂、克拉霉素联合阿莫西林或甲硝唑或者替硝唑治疗14天。然而，近年来抗幽门螺旋杆菌治疗的有效性一直在下降，国内抗幽门螺旋杆菌治疗的成功率已低于80％。抗幽门螺旋杆菌感染治疗的失效主要与该菌对抗生素耐药性的增加有关。有研究发现，我国江浙地区人群感染的幽门螺旋杆菌对克拉霉素耐药率为21.5％、对甲硝唑耐药率为
95.4％、对左氧氟沙星耐药率为20.6％，且同时对三种临床常用抗生素耐药的比例高达
7.6％。由于我国幽门螺旋杆菌呈现对抗生素广泛耐药，导致现有治疗方案无法有效控制我国幽门螺旋杆菌感染。因此，针对多重耐药幽门螺旋杆菌问题，开展新药物、制剂及材料研发工作，对提升我国国民健康水平具有巨大的意义。

[0004] 研制解决多重耐药幽门螺杆菌问题的药物、制剂及材料均需要具备多重耐药特性的靶向菌株。目前抗幽门螺旋杆菌感染的药物及材料开发主要采用标准菌株ATCC 26695和ATCC43504。其中，ATCC 43504具有抵抗阿莫西林的耐药表型，更多被用于新型抗菌药物及材料的研发。但目前我国流行的幽门螺旋杆菌主要呈现为对甲硝唑、克拉霉素及左氧氟沙星耐药，对阿莫西林耐药率仅为0.1％，而目前国内暂无对该三种抗生素均耐受的相应标准菌株，严重阻碍了我国针对幽门螺旋杆菌耐药情况问题开展的药物及材料研发工作。因此，获得遗传背景清晰、生物学性状稳定且具有多药耐药特性的靶向菌株对促进抗幽门螺旋杆菌感染研发工作具有重要意义。

[0005] hp1181和hp1184是目前已知导致幽门螺旋杆菌多药耐药的基因。这两个基因均为位于幽门螺旋杆菌染色体上的转位酶，其中hp1181属于RND(resistance‑nodulation‑division)外排泵家族，其编码蛋白具有通过质子泵供能外排多种抗生素的作用；而hp1184属于MATE(multidrug and toxic compound extrusion)外排泵家族，其编码蛋白具有主动外排多种有毒化合物及药物至胞外的作用。针对这两个耐药基因设计预防及逆转幽门螺旋杆菌多药耐药的药物及材料，具有较高的应用价值。

[0006] 因此，结合我国幽门螺旋杆菌耐受抗生素的流行情况，开发遗传背景清晰、携带明确的耐药基因及稳定的多药耐药表型的靶向菌株，有利于开发针对我国幽门螺旋杆菌感染问题的新型抗菌药物、制剂及材料，可协助缓解目前公共卫生及临床治疗对于幽门螺旋杆菌防控的技术瓶颈，有助于提高我国国民健康水平。

发明内容

[0007] 本发明的第一个目的是提供耐阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑、四环素等五种抗生素的幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)GZ6B5，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号GDMCC No：61571，保藏日期为2021年3月19日，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物菌种保藏中心。

[0008] 本发明的第二个目的是提供上述幽门螺旋杆菌GZ6B5在筛选抗幽门螺旋杆菌感染的功能微生物、药物、制剂或抗菌材料中的应用。这对促进抗幽门螺旋杆菌感染研发工作具有重要意义。

[0009] 所述的功能微生物、药物或抗菌材料是抑制耐阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑、四环素的幽门螺旋杆菌的功能微生物、药物、制剂或抗菌材料。

[0010] 本发明的第三个目的是提供一种能够特异性识别幽门螺旋杆菌GZ6B5的核苷酸序列，其如SEQ ID NO.6所示。

[0011] 本发明的第四个目的是提供一种能够特异性鉴别幽门螺旋杆菌GZ6B5的引物，其如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

[0012] 本发明的第五个目的是提供一种能够特异性鉴别幽门螺旋杆菌GZ6B5的方法，其是采用上述引物对待测幽门螺旋杆菌进行PCR扩增，如果能够产生条带，待测菌则为幽门螺旋杆菌GZ6B5，如果不能产生条带，待测菌不为幽门螺旋杆菌GZ6B5。

[0013] 所述的PCR扩增，PCR反应体系为：

[0014]

[0015] 所述的PCR扩增，其PCR反应条件为：95℃ 7min；95℃ 30s、65℃ 30s、72℃ 30s；30个循环；72℃ 10min。

[0016] 本发明的幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)GZ6B5是一株同时耐受5种临床常用抗生素的幽门螺旋杆菌，其同时携带2种耐药基因hp1181及hp1184。同时耐受5种抗生素的幽门螺旋杆菌，是在幽门螺旋杆菌耐药机制研究中的重要靶向菌株，可用于筛选新型功能微生物、药物及抗菌材料。

[0017] 本发明与现有技术相比，其有益效果为：本发明提供了一种明确携带2种多药耐药基因hp1181及hp1184的多重耐药靶向菌株，该菌对目前临床获批用于治疗幽门螺旋杆菌的5种抗生素全部耐受，可作为筛选新型功能微生物、药物及抗菌材料中的靶向菌株，具有良好的应用前景。

[0018] Helicobacter pylori GZ6B5于2021年3月19日日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61571，保藏地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070。

附图说明

[0019] 图1是幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)GZ6B5在幽门螺旋杆菌选择性培养基上的菌落形；

[0020] 图2是幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)GZ6B5经革兰氏染色后在显微镜下的形态；

[0021] 图3是幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)GZ6B5基于16S rRNA基因在螺旋杆菌属中的进化关系分析；

[0022] 图4是幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)GZ6B5与数据库中不同亚型幽门螺杆菌在全基因组水平的ANI分析，注：GZ6B5与东亚型、美洲型及Pecan型幽门螺杆菌全基因组ANI比较在95.20～96.79％间，与亚洲型、欧洲型在94.00～94.83％之间，与非洲型及SJM180在92.74～93.87％之间；

[0023] 图5是幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)GZ6B5对五种抗生素的药敏检测情况，注：A.GZ6B5在五种抗生素不同浓度培养基中生长情况。培养基从上至下为：阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑、四环素，药物浓度如图标注所示。最右排上孔为未加入GZ6B5的显色培养基，最右排下孔为未加入抗生素但加入GZ6B5的显色培养基，B.GZ6B5在加入不同浓度的五种抗生素的显色培养基中培养72小时后OD450nm的检测值热图；

[0024] 图6是幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)GZ6B5耐药基因hp1181、hp1184的PCR产物琼脂电泳图；

[0025] 图7是幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)GZ6B5在筛选的抗多重耐药幽门螺旋杆菌的功能微生物的应用；

[0026] 图8是幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)GZ6B5分子靶标的琼脂电泳验证，注：M为DNA marker，从上之下条带大小如图所示。1为GZ6B5经分子靶标扩增后PCR产物电泳情况，2、3分别为幽门螺旋杆菌ATCC 43504、Sydney SS1经分子靶标扩增后PCR产物电泳情况，
4‑23分别为不同幽门螺旋杆菌分离株经分子靶标扩增后PCR产物电泳情况。结果提示仅GZ6B5经分子靶标扩增后能形成359bp的特异PCR产物，其余幽门螺旋杆菌均不能形成类似PCR产物。
具体实施方案：

[0027] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

[0028] 下述实施例中涉及的培养基及试剂如下：

[0029] 抗生素混悬液的制备：万古霉素10mg/mL、两性霉素B 5mg/mL、甲氧苄氨嘧啶20mg/mL、头孢磺啶10mg/mL，将上述抗生素按其含量溶于灭菌水中，混合均匀。

[0030] 幽门螺旋杆菌选择培养基(g/L)：酵母浸粉3.0g/L、酪胨12.0g/L、动物组织消化物5.0g/L、牛肉浸粉3.0g/L、玉米淀粉1.0g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂13.5g/L、无菌绵羊红细胞或胎牛血清70mL/L、抗生素混悬液10mL/L，将上述成分按其含量溶于灭菌水中，混合均匀。

[0031] 幽门螺旋杆菌增殖培养基(g/L)：酵母浸粉2.02g/L、胰蛋白胨10.52g/L、葡萄糖1.56g/L、亚硫酸氢钠0.10g/L、可溶性淀粉10.0g/L、氯化钠5.0g/L、胎牛血清70mL/L、抗生素混悬液10mL/L，将上述成分按其含量溶于灭菌水中，混合均匀。

[0032] 哥伦比亚琼脂血平板(g/L)：酪蛋白胰酶消化物10.0g/L、肉胃酶消化物5.0g/L、心胰酶消化物3.0g/L、酵母浸出粉5.0g/L、玉米淀粉1.0g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂15.0g/L、无菌绵羊红细70mL/L，将上述成分按其含量溶于灭菌水中，混合均匀。

[0033] 幽门螺旋杆菌保存液(g/L)：蛋白胨4.0g/L、酵母浸膏0.8g/L、胰酪蛋白胨4.0g/L、氯化钠2.0g/L、葡萄糖0.4g/L、亚硫酸氢钠0.04g/L、偏重亚硫酸钠0.1g/L、七水合硫酸亚铁0.1g/L、丙酮酸钠0.1g/L、丙三醇200mL/L，将上述成分按其含量溶于灭菌水中，混合均匀。

[0034] 实施例1幽门螺旋杆菌的分离、培养与鉴定

[0035] 1.1.幽门螺旋杆菌的分离及培养

[0036] (1)幽门螺旋杆菌的分离与保藏：幽门螺旋杆菌GZ6B5分离自广州某多次抗生素治疗无效的慢性胃炎患者胃粘膜组织。在无菌环境下，取新鲜胃粘膜样品涂布于幽门螺旋杆菌选择性培养基上，后放置于37℃微需氧环境中(5％O2、10％CO2、85％N2)培养5～7天。挑取平板上形态典型的菌落至幽门螺旋杆菌选择性培养基平板上进行划线纯化，纯化2次后挑取单菌落接种入幽门螺旋杆菌增殖培养基中，37℃微需氧条件培养96小时后。将400μL菌液加入600μL幽门螺旋杆菌保存液中轻轻吹打混匀，保藏于‑80℃超低温冰箱中。由此获得菌株GZ6B5。

[0037] (2)幽门螺旋杆菌的复苏与培养：从保藏管中将蘸取10μL菌株GZ6B5保藏液，涂布于幽门螺旋杆菌选择培养基上，在37℃微需氧环境中培养72‑96小时后，获得复苏的幽门螺旋杆菌GZ6B5，其在平板上呈针尖大小的半透明菌落(图1)。从含复苏的幽门螺旋杆菌GZ6B5的平板上挑取单菌落，接种于幽门螺旋杆菌增殖培养基中，37℃微需氧环境中培养72～96小时，获得增殖的幽门螺旋杆菌GZ6B5菌液。

[0038] 1.2.幽门螺旋杆菌的鉴定

[0039] 纯化的幽门螺旋杆菌GZ6B5可通过形态特征、分子生物学及蛋白质谱等方面进行鉴定。

[0040] (1)染色镜检：将幽门螺旋杆菌GZ6B5涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。本发明的幽门螺旋杆菌GZ6B5显示为革兰氏阴性，显微镜下呈S形或弧形弯曲状(图2)。

[0041] (2)基于16S rRNA基因序列的分子鉴定：采用细菌DNA提取试剂盒(Mabio，CHINA)提取幽门螺旋杆菌DNA，后采用2×PCR mix(Dongshengbio，CHINA)进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增。PCR扩增引物采用16S rRNA基因通用引物，上游引物序列为27F：5’‑AGAGTT TGATCC TGG CTCAG‑3’；下游引物序列为1492R：5’‑CTAC GGC TAC CTT GTTACGA‑3’。PCR反应条件为：预变性95℃ 5min；95℃ 30s，56℃30s，72℃ 1min 30s共35个循环，72℃退火延伸10min。对PCR产物进行切胶回收，后进行一代测序(由苏州金唯智生物科技有限公司完成)。获得的16S rRNA基因序列如SEQ ID No.1所示。将该序列比对NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)，结果提示其与幽门螺旋杆菌同源性最高，命名为幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)GZ6B5。采用Neighbor‑Joining法建立幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)GZ6B5与NCBI数据库其他螺旋杆菌标准株的亲缘进化树，亲缘进化显示GZ6B5与Helicobacter pylori strain ATCC 43504遗传关系最近，相似度为99.56％，如图3所示。

[0042] ③基因组水平的平均核苷酸一致性分析：基于微生物全基因组的平均核苷酸一致性(Average Nucleotide Identity，ANI)分析是在基因组水平上界定原核生物物种的黄金标准，ANI值在95％以上被认作为同一物种。提取幽门螺旋杆菌GZ6B5的全基因组DNA后使用QIAseq FX DNA Library Kit(Qiagen，Germany)进行文库构建，用High Output v2.5 kit(Illumina,USA)在Illumina Nextseq 550平台进行高通量测序。下机数据采用Trimmomatic(v0.39)软件质控、SPAdes(v3.13.1)软件进行组装。采用ANI calculator软件(http://enve‑omics.ce.gatech.edu/ani/index)分析GZ6B5与NCBI数据库29株不同亚型的幽门螺旋杆菌全基因组的平均核苷酸一致性，结果如图4所示，提示幽门螺旋杆菌GZ6B5与东亚型、美洲型幽门螺旋杆菌高度同源，ANI均在95％以上。

[0043] 综合该菌外观、形态、革兰氏染色、16S rRNA基因比对及基因组ANI分析结果，均提示GZ6B5为幽门螺旋杆菌。将其命名为幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)GZ6B5，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号GDMCC No：61571，保藏日期为2021年3月19日，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物菌种保藏中心。

[0044] 实施例2耐受多种抗生素的幽门螺旋杆菌GZ6B5药敏特征分析

[0045] 采用琼脂稀释法对幽门螺旋杆菌GZ6B5进行药敏检测，采用幽门螺旋杆菌ATCC 43504作为质控菌株。检测根据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)和美国临床和实验室标准协会(The Clinical&Laboratory Standards Institute，CLSI)制定的方法和标准进行测定。

[0046] 2.1.琼脂稀释法

[0047] 将阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑及四环素五种抗生素的粉末根据CLSI推荐的方式溶解于相应溶质中，配置成抗生素贮存液，后根据所需检测的药敏浓度，分别加入至幽门螺旋杆菌选择培养基中，制成含相应浓度抗生素的幽门螺旋杆菌药敏检测平板，以检测抗生素对幽门螺旋杆菌GZ6B5的最小抑菌浓度(Minimum  Inhibitory 7
Concentration，MIC)。将待测幽门螺旋杆菌GZ6B5菌悬液浓度调整为1×10cfu/mL，接种10μL菌悬液至含相应浓度抗生素的检测平板上，于37℃微需氧环境中培养72小时，观察含相应浓度抗生素的检测平板上有无幽门螺旋杆菌菌落形成。以不能形成菌落的最低浓度药物平板中的浓度为该种抗生素对幽门螺旋杆菌的MIC。每个药物浓度进行平行操作3次，得出MIC的平均值。

[0048] 经实验，本发明的幽门螺旋杆菌GZ6B5对阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑及四环素的最小抑菌浓度分别为1mg/L、1mg/L、2mg/L、32mg/L、8mg/L，均高于EUCAST标准的耐药标准，因此判定该菌为多重耐药的幽门螺旋杆菌。

[0049] 2.2.肉汤稀释法

[0050] 将阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑及四环素五种抗生素的粉末根据CLSI推荐的方式溶解于相应溶质中，配置成抗生素贮存液，后根据所需检测的药敏浓度，分别加入至幽门螺旋杆菌显色培养基(Yangguangbio，CHINA)中，配成相应检测浓度的含抗生素显色培养基，现配现用。将含不同药物浓度的显色培养基100μL加入96孔板中，然后在每孔加5
入100μL浓度为10cfu/mL幽门螺旋杆菌GZ6B5。将96孔板置于在37℃微需氧环境中培养72小时，观察不同药物孔颜色变化以及通过蛋白酶标仪(BIOTEK，USA)检测各孔OD450nm值。以颜色及OD450nm没有出现变化的最低浓度药物孔中的药物浓度为该种抗生素对GZ6B5的最小抑菌浓度，如图5所示。每个药物浓度进行平行操作3次，得出最小抑菌浓度的平均值。幽门螺旋杆菌GZ6B5对阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑、四环素的药敏情况如表1所示，可知幽门螺旋杆菌GZ6B5对该五种抗生素均耐药。

[0051] 表1幽门螺旋杆GZ6B5对不同抗生素的药敏情况

[0052]

[0053] 实施例3耐受多种抗生素的幽门螺旋杆菌GZ6B5耐药基因检测

[0054] 针对幽门螺旋杆菌GZ6B5的多重耐药表型特征，选取了hp1181、hp1184两种幽门螺旋杆菌常见的多药耐药基因对该菌进行PCR检测。引物序列及PCR扩增条件同参考文献(Falsafi T,2016)。所使用的引物序列、目标基因片段长度、退火温度如表2所示，PCR反应条件为：预变性95℃ 5min；95℃ 30s，退火温度30s，72℃ 1min 30s共35个循环；72℃退火延伸10min。PCR结束后取8μLPCR产物，在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳分离(120V，25min)，比对100bp DNA Ladder(Dongshengbio，CHINA)，观察有无形成目标条带。对于有目标条带的PCR产物，进行切胶回收送一代测序(由苏州金唯智生物科技有限公司完成)。获得的hp1181、hp1184的序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，将该序列比对NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)，结果提示其与基因hp1181、hp1184同源性最高。

[0055] 表2多重耐药基因hp1181、hp1184引物序列、片段长度及退火温度

[0056]

[0057] 经实验验证，多重耐药幽门螺旋杆菌GZ6B5同时携带两种多重耐药基因hp1181、hp1184(图6)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

[0058] 实施例4耐受多种抗生素的幽门螺旋杆菌GZ6B5菌株的应用

[0059] 幽门螺旋杆菌GZ6B5的具体应用主要体现在两个方面：(1)质控品：该菌可作为幽门螺旋杆菌常见抗生素耐药表型及耐药基因表达检测的阳性对照；(2)药物筛选的靶向菌株：该菌可用于筛选功能微生物/药物/抗菌材料。其具体应用方法如下：

[0060] (1)药敏实验的阳性质控品：

[0061] 采用抗生素琼脂稀释法或肉汤稀释法对临床分离幽门螺旋杆菌抗生素药敏检测时，将GZ6B5调整至与待测菌株相同的麦氏浊度或者OD600nm，在检测体系中加入GZ6B5作为阳性对照。药敏实验方法同实施例2。检测结束时同步读取GZ6B5的药敏结果，以判断整个药敏检测体系(包括培养基、培养环境及抗生素浓度)是否正常。

[0062] (2)药物筛选的靶向菌株：

[0063] ①作为筛选具抗菌作用功能微生物的靶向菌株：

[0064] 取待检测具有抑菌潜能的乳酸菌冻存液接种于乳酸菌培养平板(如MRS平板)上，37℃厌氧培养48小时，后挑取单菌落接种入乳酸菌培养肉汤(如MRS肉汤)中，37℃厌氧培养
24小时。以1％(v/v)接种量将待测乳酸菌接种至乳酸菌培养肉汤中，37℃厌氧培养48小时。
培养结束后取菌液在4℃ 10000g×离心15分钟，获取发酵上清，采用0.22μm滤膜进行过滤，获得除菌的益生菌发酵上清，冻存于‑80℃冰箱备用。

[0065] 复苏‑80℃或液氮中冻存保藏的GZ6B5并进行扩大培养，复苏及扩大培养方法同实8
施例1。制备浓度为1×10cfu/mL的GZ6B5菌悬液，取100μL均匀涂布于哥伦比亚琼脂血平板上。将灭菌的牛津杯放置在均匀涂布GZ6B5的血平板上，在牛津杯内加入备用的待检测除菌益生菌发酵上清，取等体积的乳酸菌培养肉汤作为阴性对照。将添加了益生菌发酵液的血平板放入微需氧产气包的密封培养罐中，将密封培养罐放入4℃培养箱中静置12小时。后将处于微需氧状态的培养罐转移至37℃培养箱中培养72小时。培养结束后取走牛津杯，测量益生菌发酵液产生的抑菌环直径大小(图7)。

[0066] ②作为药物筛选的靶向菌株：

[0067] 精密称取待测药物，溶解于合适溶剂中(如双蒸水、乙醇、5％DMSO等)，制成待测药物的贮存液。使用合适溶剂(如无菌双蒸水)稀释制备待测药物的工作液，用于测定该药的最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)和最低杀菌浓度(Minimum Bactericidal Concentration，MBC)，冻存于4℃备用。

[0068] 复苏‑80℃或液氮中冻存保藏的GZ6B5并进行扩大培养，复苏及扩大培养方法同实8
施例1。制备浓度为1×10cfu/mL的GZ6B5菌悬液，取100μL均匀涂布于哥伦比亚琼脂血平板上。将灭菌的牛津杯放置在均匀涂布GZ6B5的血平板上，在牛津杯内加入配好的备用的待检测的药液，取等体积的药物溶剂作为阴性对照。将添加了药物的血平板放入微需氧产气包的密封培养罐中，将培养罐放入4℃培养箱中静置12小时。后将处于微需氧状态的培养罐转移至37℃培养箱中培养72小时。培养结束后取走牛津杯，测量药物产生的抑菌环直径大小。

[0069] 选取对GZ6B5敏感(抑菌圈直径≥10mm)的待测药物，根据CLSI推荐的微量液基稀释法测定GZ6B5对药物的MIC值。在无菌96孔平底微量培养板每行的第1‑10孔中加入100μL幽门螺旋杆菌增殖培养基。在每行的第1孔中加入100μL最高浓度的待测药物溶液，吹打混匀，后在第1孔中取100μL稀释药液加入第2孔中，吹打混匀，后在第2孔中取100μL稀释药液加入第3孔中。以此类推直至第10孔，从第10孔中取100μL稀释药液弃去。参考实施例1方法，8
制备浓度为1×10cfu/mL的GZ6B5菌悬液，在加入不同浓度药物的每个微量培养孔中加入
100μLGZ6B5菌悬液，在第11孔加入100μLGZ6B5菌悬液及100μL不加药物的幽门螺旋杆菌增殖培养基作为阳性对照，在第12孔加入200μL不加药物的幽门螺旋杆菌增殖培养基作为阴性对照，轻轻振荡混匀。将96孔板置于37℃微需氧环境中培养培养72小时。72小时后取出进行肉眼观察及检测OD450nm，以溶液清晰透亮、OD450nm明显低于阳性对照、与阴性对照相似的最低浓度药物孔内的药物浓度作为MIC值。每种药物进行三个生物学重复确定MIC值。

[0070] 确定MIC后，取MIC值前的3～5个孔内的含GZ6B5的混合培养物，分别转种在哥伦比亚琼脂血平板上，在37℃微需氧环境中培养培养72小时，72小时后取出平板观察，以混合物不形成菌落的最低药物浓度为该药物的MBC值。

[0071] ③作为抗菌材料筛选的靶向菌株：

[0072] 依据GB15979附录C——产品杀菌性能、抑菌性能稳定性测试方法，测试待测抗菌材料对多药耐药幽门螺旋杆菌的抗菌效能。具体方法为：参考实施例1方法，制备浓度为1×8
10cfu/mL的GZ6B5菌悬液。取被试样品(2.0cm×3.0cm)或样液5ml及对照样品(与试样同质材料、同等大小，但不含抗菌材料，且经灭菌处理)各4片，粪便4组置于4个灭菌平皿内。取
100μLGZ6B5菌悬液在每个被试样片和对照样片上滴加100μL，均匀涂布，在作用2、5、10、20分钟后用无菌镊子将样片投入含5mL相应中和剂的试管内，充分混匀，作适当稀释，然后取其中2～3个稀释度，在哥伦比亚血平板上进行稀释涂布，将平板置于在37℃微需氧环境中培养培养72小时，72小时取出平板进行菌落计数。

[0073] 试验重复3次，按下述公式计算杀菌率/抑菌率：

[0074]

[0075] 式中χ为杀菌率/抑菌率(％)，Acontrol为对照品的平均菌落数，Atest为被试样品的平均菌落数，A0h为起始时的平均菌落数。

[0076] 根据抗菌材料中抗菌剂的化学组成，参照GB15979附录C，根据待测抗菌材料的杀菌/抑菌率对该材料的抗菌性能进行评价。

[0077] 实施例5多重耐药幽门螺旋杆菌GZ6B5的特异分子靶标识别

[0078] 5.1.多重耐药幽门螺旋杆菌GZ6B5的特异分子靶标挖掘

[0079] 采用Prokka(v1.11)、Roary(v3.11.2)软件对多重耐药幽门螺旋杆菌(Helicobactor pylori)GZ6B5及NCBI数据库内其他1840株幽门螺旋杆菌的全基因组进行泛基因组分析。获得核心基因组后，采用Gubbins(v2.4.1)识别包含碱基取代密度较高的基因。基于泛基因组分析获得的幽门螺旋杆菌(Helicobactor pylori)GZ6B5有别于其他幽门螺旋杆菌的特异序列。采用Oligo(v7)软件针对特异序列进行引物设计，获得识别该菌的特异性分子靶标序列SEQ.ID No.6，设计其扩增引物：SEQ.ID No.4和SEQ.ID No.5。

[0080] 5.2.幽门螺旋杆菌特异分子识别靶标有效性验证

[0081] 采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)及琼脂糖电泳验证幽门螺旋杆菌(Helicobactor pylori)GZ6B5特异分子识别靶标序列的有效性。检测模板为幽门螺旋杆菌的DNA，DNA提取方法同前述。

[0082] PCR反应体系配置如下：

[0083]

[0084]

[0085] 以下为PCR反应条件：

[0086]

[0087] PCR结束后取5‑10μL  PCR产物进行1.5％琼脂糖电泳。幽门螺旋杆菌(Helicobactor pylori)GZ6B5能在359bp处形成单一特异条带，而其他幽门螺旋杆菌不能形成359bp的单一条带，则说明该对靶标具有良好识别幽门螺旋杆菌(Helicobactor pylori)GZ6B5的效能。将PCR产物送一代测序(由苏州金唯智生物科技有限公司完成)，获得SEQ.ID No.6，为幽门螺旋杆菌GZ6B5的特异性识别序列。

[0088] 如附图8所示，除幽门螺旋杆菌(Helicobactor pylori)GZ6B5的DNA经SEQ.ID No.4和SEQ.ID No.5扩增后形成359bp的特异性扩增产物外，其余幽门螺旋杆菌分离株均未见特异扩增产物形成。结果提示分子靶标序列SEQ.ID No.6、和其扩增引物SEQ.ID No.4、SEQ.ID No.5能特异的鉴别幽门螺旋杆菌(Helicobactor pylori)GZ6B5与其它幽门螺旋杆菌。

[0089] 最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。