RNA病毒核酸检测参照标准品及其用途

摘要

本发明涉及用于RNA病毒核酸检测(RT‑PCR，NGS)的参照标准品，其制备方法和用途，其中所述参照标准品为“模拟病毒颗粒”，其中的慢病毒载体中包含有RNA病毒核酸检测靶向的RNA序列片段、用于示踪的荧光蛋白。

权利要求

1.重组慢病毒载体，其特征在于在慢病毒载体中包含RNA病毒核酸检测靶向的RNA序列片段和用于示踪的荧光蛋白，所述RNA病毒为SARS‑CoV‑2病毒，

所述重组慢病毒载体至少包含以下元件：

(1)检测靶向序列1，所述检测靶向序列1源自冠状病毒SARS‑CoV‑2的ORF1ab的编码基因片段，(2)检测靶向序列2，所述检测靶向序列2源自冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白的编码基因片段，所述检测靶向序列2的序列为SEQ ID NO:2所示的S基因检测序列；

(3)检测靶向序列3，所述检测靶向序列3源自冠状病毒SARS‑CoV‑2的E蛋白的编码基因片段，(4)检测靶向序列4，所述检测靶向序列4源自冠状病毒SARS‑CoV‑2的N蛋白片段的编码基因片段，其中所述检测靶向序列1的序列由SEQ ID NO:1序列组成，检测靶向序列3的序列由SEQ ID NO:3序列组成，检测靶向序列4的序列由SEQ ID NO:4序列组成，其中所述重组慢病毒载体不包含完整的冠状病毒SARS‑CoV‑2的完整基因组序列。

2.权利要求1所述的重组慢病毒载体，在检测靶向序列1、检测靶向序列4之间各自通过接头连接。

3.权利要求2所述的重组慢病毒载体，所述接头长度为6‑200bp。

4.权利要求1所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述重组慢病毒载体还包含示踪蛋白的编码基因。

5.权利要求1‑4任一项所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述检测靶向序列1‑4的长度为80bp‑1.5kb，并且所述检测靶向序列1‑4及检测靶向序列1‑4之间的接头序列的总长度不超过7kb。

6.权利要求1‑4任一项所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体为lentivirus病毒载体或FIV病毒载体。

7.权利要求6所述的重组慢病毒载体，其中lentivirus病毒载体为pEZ‑Lv201。

8.权利要求1‑3任一项所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述重组慢病毒载体包括但不限于二代、三代慢病毒载体。

9.权利要求1所述的重组慢病毒载体，其中所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白GFP或红色荧光蛋白RFP。

10.利用权利要求1‑9任何一项所述的重组慢病毒载体制备的重组慢病毒颗粒。

11.权利要求10所述的重组慢病毒颗粒，其是通过将所述重组慢病毒载体转染到人

293T细胞株中来制备。

12.权利要求1‑9任一项所述的重组慢病毒载体或权利要求10或11所述的重组慢病毒颗粒在以下用途中的应用：

1)制备作为检测SARS‑CoV‑2携带者或样品中SARS‑CoV‑2的参照标准品的试剂中的应用；

2)制备检测SARS‑CoV‑2的试剂或试剂盒中的应用；

3)制备用于定量样品中SARS‑CoV‑2的试剂中的应用；或

4)制备作为COVID‑19患者治疗效果评估和恢复出院的SARS‑CoV‑2定量的可掺入待检样本的参照标准品的试剂中的应用。

13.权利要求12所述的应用，其中所述作为检测SARS‑CoV‑2携带者或样品中SARS‑CoV‑

2的参照标准品用于阳性和阴性的判断，或者用于样本采集、样品保存和样品RNA提取过程中的质量分析和质量控制。

14.参照标准品RNA，其是通过提取权利要求10所述重组慢病毒颗粒制备的RNA。

15.权利要求14所述的参照标准品RNA，其在检测SARS‑CoV‑2的过程涉及的从RNA反转录为cDNA的过程中用作参照标准品。

16.权利要求14所述的参照标准品RNA，其用于以RNA为样本的反转录反应体系中的质量分析和质量控制。

17.参照标准品cDNA，其是通过反转录权利要求15所述的参照标准品RNA制备的cDNA。

18.权利要求17所述的参照标准品cDNA，其用于检测SARS‑CoV‑2的过程中涉及的DNA扩增过程中扩增效率和荧光信号的质量分子和质量控制。

19.多核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO:2所示的序列。

20.权利要求19所述的多核苷酸序列在制备检测和定量冠状病毒SARS‑CoV‑2、构建检测冠状病毒SARS‑CoV‑2的参照标准品中的试剂中的应用。

21.制备重组慢病毒载体的方法，包括将检测靶向序列1‑4插入到慢病毒载体中，其中(1)所述检测靶向序列1源自冠状病毒SARS‑CoV‑2的ORF1ab的编码基因片段，(2)所述检测靶向序列2源自冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白的编码基因片段，所述检测靶向序列2的序列为SEQ ID NO:2所示的S基因检测序列；

(3)所述检测靶向序列3源自冠状病毒SARS‑CoV‑2的E蛋白的编码基因片段，(4)所述检测靶向序列4源自冠状病毒SARS‑CoV‑2的N蛋白片段的编码基因片段，其中所述检测靶向序列1的序列由SEQ ID NO:1序列组成，检测靶向序列3的序列由SEQ ID NO:3序列组成，检测靶向序列4的序列由SEQ ID NO:4序列组成，所述慢病毒载体为lentivirus病毒载体或FIV病毒载体。

22.权利要求21所述的方法，其中所述方法还包含将示踪蛋白的编码序列进一步插入到慢病毒载体中。

23.权利要求21所述的方法，其中所述慢病毒载体是pEZ‑Lv201。

24.权利要求1‑9任一项所述的重组慢病毒载体，权利要求10或11所述的重组慢病毒颗粒，权利要求14所述的参照标准品RNA，权利要求17所述的参照标准品cDNA在制备用于优化检测SARS‑CoV‑2RNA核酸检测的试剂盒过程中的应用。

25.权利要求24所述的应用，其中所述优化为优化反应液组分及反应条件各步骤的参考标准品。

说明书

RNA病毒核酸检测参照标准品及其用途

技术领域

[0001] 本发明属于生物学领域。具体涉及检测RNA病毒(例如冠状病毒，优选SARS病毒，MERS病毒和冠状病毒SARS‑CoV‑2)中涉及的参照标准品及其用途。

背景技术

[0002] 冠状病毒感染人体可导致肺炎，如COVID‑19等。对冠状病毒的核酸快速检测已成为控制病毒扩散、病人诊断、治疗及预防的重要技术之一。自2019年12月由新型病毒2019‑nCoV(2020年2月12日国际病毒分类委员会将新型冠状病毒命名为“SARS‑CoV‑2”)，感染人体产生新型冠状病毒肺炎流行(世界卫生组织将新型冠状病毒感染的肺炎命名为“COVID‑19”)，发现2019‑nCoV携带者、易感人群、发病率、治病率和死亡率，已成为国内外政府和人们十分关注和敏感的问题。对2019‑nCoV的核酸快速检测已成为控制病毒扩散、病人诊断、治疗及预防的重要技术之一。目前国内已有80多家(获得国家批准有7家)企业生产2019‑nCoV核酸检测试剂盒，快速推出使用(一般试剂盒的灵敏度都在100～1000拷贝/ml)。但由于缺乏可用于2019‑nCoV核酸检测试剂盒及相关设备的与2019‑nCoV相似的参照标准品，不能对这些已推出使用的核酸检测试剂盒和相关设备获得检测结果的精确性(阳性和阴性)作出很好的判断，更不能计算待测样本的单位体积病毒颗粒数量(如500病毒颗粒/ml)。因此亟需能准确反映检测准确性及定量2019‑nCoV的参照标准品。

[0003] RNA病毒(RNA virus)是指其基因组仅由RNA构成的一类病毒，它们的遗传物质是核糖核酸(RNA ribonucleic acid)。RNA病毒有自我复制和逆转录两种复制方式，与DNA病毒相比，RNA病毒更加容易导致疾病、对宿主更加致命、更容易突变，因此种类更多，更难研制有效疫苗，难以预防。与人类疾病相关的、常见的RNA病毒种类很多(表1)，冠状病毒是其中一种。

[0004] 冠状病毒是线性单链RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒，直径约80‑120nm，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。冠状病毒最先于1937年从鸡身上分离出来。1965年，分离出第一株人的冠状病毒。由于在电子显微镜下可观察到其外膜上有明显的棒状粒子突起，使其形态看上去像中世纪欧洲帝王的皇冠，因此命名为“冠状病毒”。

[0005] 冠状病毒感染人体可导致肺炎，如新型冠状病毒(即SARS‑CoV‑2)感染的肺炎(COVID‑19)等。对SARS‑CoV‑2的核酸进行快速检测已成为控制病毒扩散、进行精准的疾病诊断、精准治疗及预防的重要技术之一。现有的逆转录PCR核酸扩增检测技术(RT‑PCR)、新一代测序技术(NGS)可用于冠状病毒的快速检测。

[0006] 由于冠状病毒具有高传染性和致病性，不可直接作为其核酸检测的参照标准品。此外，冠状病毒的精准检测也受到多种因素的制约。

[0007] 在临床采样中，采样时间、采样位置、采样方式、采样管(及其采集温度)的选择，以及样本储存的方法的不同，导致取样误差，无法精确计算待测样本的单位体积中病毒颗粒拷贝数。

[0008] 实验人员之间的误差，不同实验人员因自身经验和操作习惯上的差异，常常导致结果的差别。

[0009] 在病毒核酸检测过程中，缺乏与冠状病毒结构相似的参照标准品，不能对现有不同厂家生产的冠状病毒检测试剂盒和相关设备获得检测结果的准确性、特异性和灵敏度(阳性和阴性)作出很好的判断；使用不同厂家或同一厂家不同批次试剂盒的检测结果也存在差异，检测结果对临床诊断和治疗的应用受到限制。

[0010] 在实验室环境条件方面，不符合国家GMP标准和规范的操作流程的实验室将不可避免地会出现非样本内含物带来的干扰。

[0011] 本发明采用的含有SARS‑CoV‑2检测靶向序列的慢病毒转染人293T细胞或其他人类细胞株进行制备获得慢病毒颗粒，定义为“模拟病毒”，可作为SARS‑CoV‑2核酸检测试剂盒的参照标准品。其制备材料和方法的生物安全性已被证，“模拟病毒”具有与SARS‑CoV‑2类似的外壳、以及核酸检测所靶向的序列的RNA，为SARS‑CoV‑2核酸检测试剂研发、病毒检测的阳性参照标准品提供了一种安全和高效的方法。三种用于新型冠状病毒核酸检测(RT‑PCR)试剂盒生产和样品检测的质量分析和质量控制的“参考标准品”示意图参见例如图5。发明内容：

[0012] 本发明的目的在于在无法获得纯化的冠状病毒情况下，提供一种安全、简便、高效的冠状病毒相似的参照标准品，用于冠状病毒(例如冠状病毒SARS‑CoV‑2)核酸检测参照标准品、作为2019‑nCoV例如“NGS和RT‑PCR检测设备的质量分析和质量控制的参照标准品。

[0013] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0014] 1.重组慢病毒载体，其特征在于在慢病毒载体中包含RNA病毒核酸检测靶向的RNA序列片段和用于示踪的荧光蛋白，

[0015] 优选地，所述RNA病毒包括冠状病毒，如SARS病毒，MERS病毒和SARS‑CoV‑2病毒，[0016] 更优选地，所述重组慢病毒载体至少包含以下元件：

[0017] (1)检测靶向序列1，所述检测靶向序列1源自冠状病毒SARS‑CoV‑2的ORF1ab的编码基因或其片段，

[0018] (2)检测靶向序列2，所述检测靶向序列2源自冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白的编码基因或其片段，

[0019] (3)检测靶向序列3，所述检测靶向序列3源自冠状病毒SARS‑CoV‑2的E蛋白的编码基因或其片段，

[0020] (4)检测靶向序列4，所述检测靶向序列4源自冠状病毒SARS‑CoV‑2的N蛋白片段的编码基因或其片段，

[0021] 其中所述重组慢病毒载体不包含完整的冠状病毒SARS‑CoV‑2的完整基因组序列，优选地，在检测靶向序列1、检测靶向序列4之间各自通过接头连接，更优选地，所述接头长度为6‑200bp。

[0022] 2.项目1所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述重组慢病毒载体还包含示踪蛋白的编码基因。

[0023] 3.项目1‑2任一项所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述检测靶向序列1‑4的长度为80bp‑1.5kb，并且所述检测靶向序列1‑4及检测靶向序列1‑4之间的接头序列的总长度不超过7kb。

[0024] 4.项目1‑3任一项所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体为lentivirus病毒载体(优选pEZ‑Lv201)或FIV病毒载体，优选地检测靶向序列2的序列至少包括SEQ ID NO:2序列，或由SEQ ID NO:2序列组成。5.项目1‑4任一项所述的重组慢病毒载体，其特征在于，

[0025] 所述检测靶向序列1的序列包含中国CDC检测序列cCDC‑1ab)及Roche 2019‑nCoV(RdRP)的检测序列，或由其组成；

[0026] 所述检测靶向序列2的序列SEQ ID NO:2所示的S基因检测序列，或由其组成；

[0027] 所述检测靶向序列3的序列包含Roche 2019‑nCoV(E)的E基因检测序列，或由其组成；

[0028] 所述检测靶向序列4的序列包含中国CDC的1个N基因片段及美国CDC的3个N基因片段的检测序列，或由其组成；

[0029] 优选地，所述检测靶向序列1的序列包括SEQ ID NO:1序列或由SEQ ID NO:1序列组成；

[0030] 检测靶向序列2的序列包括SEQ ID NO:2序列或由SEQ ID NO:2序列组成；

[0031] 检测靶向序列3的序列包括SEQ ID NO:3序列或由SEQ ID NO:3序列组成；

[0032] 检测靶向序列4的序列包括SEQ ID NO:4序列或由SEQ ID NO:4序列组成。

[0033] 6.项目1‑5任一项所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述示踪蛋白选自荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(RFP)。

[0034] 7.项目1‑6任一项所述重组慢病毒载体，其中所述慢病毒载体为lentivirus病毒载体(优选pEZ‑Lv201)或FIV病毒载体。

[0035] 8.项目1‑7任一项所述重组慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包括但不限于二代、三代慢病毒载体。

[0036] 9.利用项目1‑8任何一种重组慢病毒载体制备的重组慢病毒颗粒，优选将所述重组慢病毒载体转染到人293T细胞株中来制备所述重组慢病毒颗粒。

[0037] 10.项目1‑8任一项所述的重组慢病毒载体或权利要求9所述的重组慢病毒颗粒在以下用途中的应用：

[0038] 1)作为检测COVID‑19患者、SARS‑CoV‑2携带者、COVID‑19疑似患者或样品中SARS‑CoV‑2的参照标准品(定性：如阳性和阴性的判断)的应用，例如用于样本采集、样品保存和样品RNA提取过程中的质量分析和质量控制；

[0039] 2)制备检测SARS‑CoV‑2的试剂或试剂盒中的应用；

[0040] 3)定量样品中SARS‑CoV‑2中的应用；

[0041] 4)作为COVID‑19患者治疗效果评估和恢复出院的SARS‑CoV‑2定量的可掺入待检样本的参照标准品的应用。

[0042] 11.参照标准品RNA，其通过提取项目9所述重组慢病毒颗粒制备的RNA。

[0043] 12.项目11所述的参照标准品RNA，其在检测SARS‑CoV‑2的过程涉及的从RNA反转录为cDNA的过程中用作参照标准品，例如用于以RNA为样本的反转录反应体系中的质量分析和质量控制。

[0044] 13.参照标准品cDNA，其通过反转录项目11所述的慢病毒RNA制备cDNA。

[0045] 14.项目13所述的参照标准品cDNA，其用于检测SARS‑CoV‑2的过程中涉及的DNA扩增过程中扩增效率和荧光信号的质量分子和质量控制。

[0046] 15.多核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO:2。

[0047] 16.项目15所述的多核苷酸序列中检测和定量冠状病毒SARS‑CoV‑2、构建检测冠状病毒SARS‑CoV‑2的参照标准品中的应用。

[0048] 17.检测或定量冠状病毒SARS‑CoV‑2的方法(优选为RT‑PCR、NGS或RT‑PCR与NGS联用的方法)，包括使用项目1‑8任一项所述的重组慢病毒载体或项目9所述的重组慢病毒颗粒作为参照标准品。其中NGS为第二代和第三代测序方法。

[0049] 18.制备重组慢病毒载体的方法，包括将检测靶向序列1‑4插入到慢病毒载体中，优选，将示踪蛋白的编码序列进一步插入到慢病毒载体中，更优选地，所述慢病毒载体为lentivirus病毒载体(优选pEZ‑Lv201)或FIV病毒载体。

[0050] 19.项目1‑8任一项所述的重组慢病毒载体，项目9所述的重组慢病毒颗粒，项目11所述的参照标准品RNA，项目13所述的参照标准品cDNA中用于优化检测SARS‑CoV‑2RNA核酸检测试剂盒过程中的应用，优选包括但不限于优化反应液组分及反应条件各步骤的参考标准品。

[0051] 在一些实施方案中，本发明提供用于制备冠状病毒核酸检测参照标准品的重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体包含慢病毒的5’LTR、3’LTR元件、冠状病毒例如SARS‑CoV‑2核酸检测靶向的RNA序列、荧光蛋白基因；所述核酸检测靶向的RNA序列包含SARS‑CoV‑2基因组中可用于鉴别和检测的特异性序列(例如检测靶向序列1‑4)。在发明的优选实施方案中，所述检测靶向序列2的序列包含广州复能基因有限公司和广州易锦生物技术有限公司设计的SEQ ID NO:2所示的S基因检测序列，或由其组成。

[0052] 提供制备重组慢病毒颗粒的方法，由上述重组慢病毒载体与辅助质粒共转染宿主细胞后(例如人293T细胞)后所获得的慢病毒颗粒，该病毒外壳为慢病毒外壳，其中包裹了带有冠状病毒核酸检测靶向序列的RNA。

[0053] 定义

[0054] 为了促进对本发明的理解，下文给出术语的解释：

[0055] 如本文使用的术语“参照品”也有称“参照标准品(reference standard)”，是指，具有一种或多种足够均匀并很好确定了含量、序列、活性、结构或分型等生物测量特性(量)值，用以校准仪器、评价生物测量方法或给材料赋值的物质。

[0056] 如本文使用的，术语“慢病毒载体”是指可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面，慢病毒载体可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。鉴于此，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒载体已被广泛应用于科学实验和CAR‑T细胞治疗，其生物安全性已被证明，由此制备的“模拟病毒”无传染性和致病性。

[0057] 在本发明中，可以使用的慢病毒载体为本领域中常规使用的慢病毒载体，包括lentivirus病毒载体(Gene delivery by lentivirus vector,Cockrell,Adam S.,et al.,Molecular Biotechnology 36(3),184‑204；Lentiviral Vector System for Gene Transfer,Gilbert,James R.,et al.,2003)或FIV病毒载体(Feline Immunodeficiency Virus(FIV)as a Model for Study of Lentvirus Infections:Parallels with HIV,John,H.Elder et al.,CurrHIV Res 2010,January,8(1):73‑80；Efficient transduction of nondividing human cells by feline immunodeficiency virus lentiviral vectors,Eric M.Poeschla et al.,Nature Medicine,volume 4,No.3,March 
1998；FIV:from lentvirus to lentivector,Dyana T.Saenz et al.,J.Gene Med 2004,
6,S95‑S104)。在具体的实施方案中，所述慢病毒载体为pEZ‑Lv201。

[0058] 本发明的有益效果：

[0059] 本发明所提供的慢病毒核酸检测的参照标准品为在慢病毒载体中构建包含有冠状病毒核酸检测靶向的RNA序列片段、用于示踪的荧光蛋白，随后在培养的细胞中包装为由外壳(糖蛋白和脂质体构成)包裹RNA所形成的冠状病毒的“模拟病毒”，经过纯化和定量，该“模拟病毒”可作为冠状病毒核酸检测参照标准品。本发明的有益效果在于：

[0060] (1)安全制备冠状病毒核酸检测的标准品。冠状病毒感染人体可导致肺炎，由于冠状病毒高传染性和致病性，很难获得和培养正在流行的病毒株，因此也就难以获得纯化的冠状病毒。本发明所采用的慢病毒载体是已被广泛应用于科学实验和CAR‑T细胞治疗中，其生物安全性已被证明，由此制备的“模拟病毒”无传染性和致病性。

[0061] (2)简便高效制备冠状病毒核酸检测的标准品。慢病毒技术经过多年的发展和优化，其病毒包装的效率和纯化技术，因此以慢病毒为基础的冠状病毒的“模拟病毒”制备操作简便高效。

[0062] (3)定量的准确性。作为检测的标准品，本身的定量是要非常准确的，本发明提供的“模拟病毒”其骨架序列清楚稳定，可用数字PCR(ddPCR)技术进行精确测定，通过也可通过其所携带的荧光蛋白进行测定。

附图说明

[0063] 图1.是本发明的重组慢病毒颗粒示意图，其中图a为慢病毒的基因组结构示意图，其中ORF表示慢病毒载体有n个开放阅读框；图b为冠状病毒SARS‑CoV‑2基因组示意图；图c为含有靶向序列片段和示踪蛋白的“模拟病毒”示意图；图d表示插入慢病毒载体中的检测靶向序列结构示意图；在图1a‑1d中，“ORF1ab”或“ORF1abfragments”为包含中国CDC检测序列(Fig 1d中表示为cCDC‑1ab)及Roche 2019‑nCoV(RdRP)的检测序列”，“S”或“Sfragment”为本发明设计的冠状病毒SARS‑CoV‑2的S(spike)蛋白基因检测序列，“E”或“Efragment”为包含Roche 2019‑nCoV的E基因检测序列，“N”或“Nfragments”为包含中国CDC的1个(Fig1d中表示为cCDC‑N)N基因及美国CDC的3个(Fig.1d中表示为CDC‑N1，CDC‑N2和CDC‑N3)N基因的检测序列；“EGFP”为示踪蛋白，即图2中慢病毒载体pEZ‑Lv201骨架中的“eGFP”。

[0064] 图2.是慢病毒载体pEZ‑Lv201骨架示意图。

[0065] 图3.是重组慢病毒载体插入的检测靶向序列的结构及涉及的引物序列。

[0066] 图4.是重组慢病毒颗粒的制备流程示意图。

[0067] 图5.是三种用于新型冠状病毒核酸检测(RT‑PCR)试剂盒生产和样品检测的质量分析和质量控制的“参考标准品”示意图。

[0068] 图6.合成片段电泳图。Lane M：Marker 6000；Lane 1：PCR合成产物L(1362bp)。

[0069] 图7.菌落PCR检测结果电泳图。Lane M：Marker 6000；Lane 1：菌落PCR产物(1602bp)；Lane 2：菌落PCR产物(1602bp)；Lane 3:菌落PCR产物(1602bp)；Lane 4：菌落PCR产物(1602bp)；Lane 5:菌落PCR产物(1602bp)；Lane 6：菌落PCR产物(1602bp)；Lane 7:菌落PCR产物(1602bp)；Lane 8：菌落PCR产物(1602bp)。

[0070] 图8.2019‑nCoV‑TargetSequence与G118842的blast结果图。

[0071] 图9.梯度稀释的参考品log(起始拷贝数)对应Ct值的标准曲线图。图注：将所有梯度稀释的参照标准品进行qPCR反应，获得每一个样品的Ct值(扩增阈值循环数)，以log(起2
始拷贝数)为横坐标X、Ct值为纵坐标Y，获得标准曲线,并获得曲线公式及相关系数R。

[0072] 图10.慢病毒感染H1299细胞后的荧光图。图注：将图中所有绿色荧光亮点计数，图中箭头表示其中一个荧光点。

[0073] 图11.带eGFP荧光的细胞流式细胞仪分析的数据图图注：流式细胞仪测定带eGFP荧光的细胞，获得标记荧光的细胞所占百分比。纵坐标：SSC‑A指相对颗粒度或内部复杂程度；横坐标：FITC‑A指颗粒相对大小；P1‑1，P1‑2，P1‑3：指不是带荧光的目标细胞；P1‑4指分选出来的带荧光的目标细胞，阳性率为2.23％。

[0074] 图12.为梯度稀释cDNA样品中ORF1ab靶标(图a)，N基因靶标(图b)和S基因靶标(图c)的ddPCR一维液滴分布图与拷贝数浓度定量曲线(图d‑f)。

[0075] 图13.使用质控品检测样本采集材料的释放效率时，不同样本的制备及检测流程示意图。

[0076] 图14.使用质控品检测RNA不同提取试剂和方法的效率时，样本的提取、检测流程示意图。

[0077] 图15.CCDC‑N质控品浓度梯度标准曲线。

具体实施方式

[0078] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加浅显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明的保护范围以权利要求书为准，不受下面公开的具体实施的限制。

[0079] 实施例1：重组质粒的构建方法

[0080] 1.实验材料

[0081] 试剂：DNAPolymerase(Gencopoeia,C0103A)；引物Oligo(Invitrogen)；克隆载体TMpEZ‑Lv201(Genecopoeia)；Fast‑Fusion  Cloning Kit(Gencopoeia,FFPC‑C020)；胶回收试剂盒(Omega)；2T1感受态(Genecopoeia,U0104A)；STBL3感受态(Genecopoeia,U0103A)；
限制性内切酶(Fermentas)；DNA Ladder(Genecopoeia)； Gel Extraction Kit
TM
(OMEGA)；UltraPF  DNAPolymerase Kit(Genecopoeia,C0103A)； Plasmid 
Mini KitⅠ(OMEGA)；无内毒素质粒小/中提试剂盒(Omega)。

[0082] 设备：PCR扩增仪(Takara)；天能凝胶成像系统(上海天能)；电热恒温水浴槽(上海合恒仪器设备有限公司)；离心机(Thermo)。

[0083] 2.实验步骤

[0084] 本实施例将冠状病毒核酸检测靶向序列和荧光蛋白基因序列插入慢病毒载体，具体步骤如下：

[0085] A.载体设计

[0086] 1).载体骨架如图2所示

[0087] 2).表达克隆信息

[0088] 利用克隆技术将SARS‑CoV‑2特异靶向序列片段克隆至慢病毒克隆载体。

[0089] 以下靶向为检测序列的列表：

[0090] SARS‑CoV‑2特异靶向序列见SEQ ID NO:5。

[0091] 检测靶向序列1(图1b的orf1ab，1ab‑RdRP)：包含中国CDC检测序列(图1d,cCDC‑1ab)及Roche 2019‑nCoV(RdRP)的检测序列见SEQ ID NO:1。

[0092] 检测靶向序列2(图1b的S Fragment)：包含本公司设计的S(spike)蛋白基因检测序列见SEQ ID NO:2。

[0093] 检测靶向序列3(图1b的E Fragment)：包含Roche 2019‑nCoV(E)的新冠状病毒基因E的检测序列见SEQ ID NO:3。

[0094] 检测靶向序列4(图1b的N Fragment)：包含中国CDC的1个(图1d的cCDC‑N)及美国CDC的3个(图1d的CDC‑N1‑N3)N基因的检测序列见SEQ ID NO:4。

[0095] 重组慢病毒载体插入的检测靶向序列的结构及涉及的引物序列见图3，图中的引物信息见表1。

[0096] 表1引物序列及相关信息

[0097]

[0098]

[0099] 注：“cCDC”为中国CDC缩写。

[0100] 其中Ro‑F/Ro‑E‑R/Ro‑E的组合以及Ro‑F2/Ro‑R2/RO‑TMR‑P2的组合均可以用于扩增nCoV的E片段。

[0101] 3).构建步骤

[0102] (1)SARS‑CoV‑2特异靶向序列片段合成

[0103] 根据插入序列设计并合成表2中片段合成引物。

[0104] 表2插入片段合成引物

[0105]

[0106]

[0107]

[0108] 将表2中引物进行稀释至50pmol/μl，各取1μl混合均匀，备用；

[0109] 插入序列进行合成PCR扩增：以表2中引物混合物为模板，以WHF‑PF1+WHF‑PF40为引物，采用表3的反应体系和表4的反应程序，扩增获得插入片段M，电泳检测结果见图6，得到产物L片段约1362bp，随后用OMEGA的 Cycle Pure Kit纯化PCR产物和合成片段。

[0110] 合成用于例如NGS、RT‑PCR方法检测2019‑nCov参照标准的“模拟病毒”的靶向序列插入片段M，其序列见SEQ ID NO:6。

[0111] 表3 PCR反应体系

[0112]试剂名称 1×体积
TM
5×UltraPF  Buffer 5μl
dNTP(25mM) 0.2μl
2+
Mg (50mM) 0.75μl
TM
UltraPF  DNA Polymerase(5U/μl) 0.2μl
表1引物混合物 1μl
引物(5pmol/L) 2μl
ddH2O 加至25μl

[0113] 表4 PCR反应程序

[0114]

[0115] B.将合成插入片段M克隆至目的载体

[0116] 1).载体的酶切

[0117] 按表5建立酶切体系。用OMEGA的 Gel Extraction Kit回收载体酶切产物。

[0118] 表5酶切体系

[0119] 试剂 用量pEZ‑Lv201 3μg
10×NEB buffer 4μl
EcoRI(NEB) 0.4μl(10μ/μl)
XhoI(NEB) 0.4μl(10μ/μl)
ddH2O 加至40μl

[0120] 2).合成插入片段M和质粒载体的连接

[0121] 用Fast‑Fusion Cloning Kit进行In‑fusion反应，反应结束后取5μl用于转化大肠杆菌感受态细胞2T1。

[0122] 3).PCR法筛选基因重组克隆

[0123] 每个PCR反应体系分装16μl  ddH2O和1μl载体引物(5pmol/μl，T7‑PF:acgactcactatagacctacaacttgtgc；SV40‑PR:ctggaatagctcagaggc)，PCR反应程序如表6；电泳检测PCR产物，检测结果见图7，对照Marker估计DNA片段的大小，选择出含目的DNA片段的阳性克隆。用OMEGA的 Plasmid Mini Kit I提取质粒DNA，质粒送测序，通过图8
中比对结果获知测序质粒G118842为预期正确克隆，其中表达出RNA序列从5’LTR到3’LTR序列(插入2019‑nCov“模拟病毒”RNA序列)为片段N，质粒全序列(“模拟病毒”载体全序列)为片段W。

[0124] 片段N(即插入2019‑nCov“模拟病毒”RNA序列)的序列见SEQ ID NO:7。片段W(即“模拟病毒”载体全序列)的序列见SEQ ID NO:8。

[0125] 表6 PCR反应程序

[0126]

[0127] 实施例2：慢病毒制备

[0128] 获得重组慢病毒载体后，可以制备重组慢病毒颗粒。流程检测见图4。

[0129] 1.实验材料

[0130] 试剂：培养基(CORNING,10‑013‑CV)，胎牛血清(Excell Bio,FSP500)，Lenti‑PacTM HIV慢病毒包装试剂盒(GeneCopoeia,LT003)

[0131] 设备：生物安全柜(苏净安泰)，二氧化碳培养箱(力康)。2.实验步骤

[0132] 慢病毒制备步骤如下：

[0133] 1).293T( CRL‑3216TM)细胞在10％胎牛血清的DMEM培养基中、在含5％CO2、TM37℃下培养，按照Lenti‑Pac  HIV慢病毒包装试剂盒推荐流程使用实施例1制备的重组质粒和含有Gag‑pol和Rev的辅助质粒共转染细胞)；

[0134] 2).转染12h后，更换含有新鲜培养基，继续培养24h；

[0135] 3).收集培养细胞的上清液，上清液中含有慢病毒颗粒(命名为LPP‑WH‑Fragment3‑Lv201)。

[0136] 实施例3：慢病毒浓缩

[0137] 1.实验材料

[0138] 试剂：Lentivirus Concentration Solution(6X)(GeneCopoeia,LT007)，PBS(GeneCopoeia,PE002)。

[0139] 设备：冷冻离心机(Thermo)，生物安全柜(苏净安泰)。

[0140] 2.实验步骤

[0141] 1).从工具细胞培养板或培养瓶收集上清液，上清液即含有慢病毒颗粒。上清液可通过4℃2000g离心10min去除细胞碎片。

[0142] 2).浓缩试剂购买于GeneCopoeia公司(Lenti‑PacTM慢病毒浓缩试剂，LT007)。按慢病毒液体积：浓缩试剂体积＝5:1的比例混合慢病毒上清液和浓缩试剂(直接添加慢病毒浓缩试剂6X原液即可)，在0～4℃温度下孵育2h或以上(也可孵育过夜)。在慢病毒的稳定保存期内，适当延长孵育时间可提高慢病毒的回收率。注意：慢病毒在0～4℃下可稳定保存约3天。

[0143] 3).完成孵育后，混合液在4℃下3500g离心25min。

[0144] 4).离心后，小心吸走、弃去上清液，留下沉淀物为慢病毒颗粒。

[0145] 注意：请避免吸走离心沉淀物，该沉淀物为慢病毒颗粒(部分情况下，沉淀物不一定肉眼可见)。

[0146] 5).根据步骤1收集并用于浓缩的慢病毒上清液体积，量取其1/10‑1/100体积的DMEM或PBS，重新吹打悬起慢病毒沉淀(举例：如步骤1收集的上清液有10mL，则本步骤量取的DMEM或PBS为0.1mL‑1mL)。

[0147] 注意：重新悬浮慢病毒沉淀时，吹打操作要轻柔。

[0148] 6).重悬的慢病毒液已完成浓缩操作，可分装后保存在‑80℃，并同时取少量测定浓缩后的慢病毒检测滴度。

[0149] 实施例4：慢病毒定量

[0150] 1.实验材料

[0151] 试剂：培养基(CORNING,10‑013‑CV)，胎牛血清(Excell Bio,FSP500)，PBSTM(GeneCopoeia,PE002)，Trypsin(CORNING,25‑053‑CI)，Lenti‑Pac 慢病毒滴度检测试剂盒TM
(GeneCopoeia,LT006)，青霉素‑链霉素双抗溶液(HyClone)，RNaseLock RNase抑制剂。

[0152] 设备：实时荧光定量PCR仪(Bio‑rad)，倒置荧光显微镜(尼康Ti‑S),流式细胞仪(BD FACSMelody)，冷冻离心机(Thermo)。

[0153] 2.实验步骤

[0154] 我们可以采用四种方法测定慢病毒滴度：

[0155] 方法一：使用实时荧光定量PCR仪检测慢病毒物理滴度。

[0156] 方法二：使用荧光显微镜细胞计数法测定慢病毒生物拷贝数(滴度)。

[0157] 方法三：使用流式细胞荧光计数法测定慢病毒生物滴度。

[0158] 方法四：ddPCR方法检测慢病毒RNA拷贝数。

[0159] 四种方法测定所得结果见表7。

[0160] 表7四种方法测定慢病毒滴度结果

[0161]

[0162] 具体方法一：实时荧光定量PCR仪检测慢病毒物理滴度

[0163] 1.RNA提取

[0164] 1)向装有50μL或100μL澄清慢病毒溶液(或者向装有10μL纯化浓缩的慢病毒溶液)的1.5mL离心管中加入0.25mL RT RNA抽提试剂，将离心管颠倒10次混匀溶液(裂解病毒颗粒并溶解蛋白)，室温静置至少15min。

[0165] 2)短暂离心后，向装有50μL慢病毒溶液的管中加入50μL纯水(或者向装有10μL纯化浓缩病毒溶液的管中加入90μL纯水)，使慢病毒溶液与纯水体积之和为100μL。

[0166] 3)匀浆液在20℃条件下18,000g离心10min。

[0167] 4)小心地将上清液转移至新的1.5mL离心管中，加入线性聚丙烯酰胺(Linear Polyacrylamide)，使其终浓度约为15μg/mL。例如，在100μL上清液中加入浓度为1.5mg/mL的线性聚丙烯酰胺1.0μL。

[0168] 注意：线性聚丙烯酰胺作为共沉淀剂，可以改善乙醇沉淀过程中RNA的恢复，也有助于RNA沉淀的显现，但不会影响后续的酶消化、反转录和qPCR反应。

[0169] 5)加入上述溶液相同体积的100％异丙醇(或3倍体积100％乙醇)，反复颠倒离心管混匀溶液。混匀的溶液最好在‑20℃下保存4h以上或者过夜。

[0170] 6)溶液在10℃条件下18,000g离心20min，并弃去上清液。

[0171] 7)用0.5mL 75％乙醇洗涤RNA沉淀，溶液在10℃条件下18,000g离心5min，弃去上清液。再重复洗涤过程一次。

[0172] 8)尽可能除去残留乙醇。室温下晾干RNA沉淀3min，切勿过干。最后用50μL的TE缓冲液溶解RNA沉淀(此处TE缓冲液为DEPC处理过的水配制成100μM TE缓冲液，其在本发明中溶解RNA沉淀均使用此TE缓冲液)。

[0173] 2.用DNase I处理(去除游离细胞基因组及质粒)

[0174] DNase I反应。用1.5mL管子，按表8进行以下反应(总体积25μL)。

[0175] 表8 DNase I反应体系

[0176]

[0177]

[0178] 孵育：

[0179] 1)37℃，30‑60min

[0180] 2)75℃，10min(使DNase I失活)

[0181] 注意：如果遗漏了DNase I消化步骤，必须在qPCR反应步骤中加上以未反转录的RNA样品为模板的qPCR反应作为对照，该对照确定(未经过DNase I消化的)样品中所携带的质粒DNA拷贝数，用反转录产物作为模板进行的qPCR反应所确定的拷贝数减去该对照确定的质粒DNA拷贝数，即为样品中RNA拷贝数。

[0182] 3.反转录

[0183] 按表9在0.2mL或0.5mL离心管中制备RNA‑Primer Mix，混匀RNA‑Primer Mix，在70℃温育5min后，将离心管立即置于冰上至冷却。

[0184] 表9 RNA和cDNA Synthesis Primer结合反应体系

[0185]

[0186] 注意：试剂盒里的随机引物(在反转录反应液中的终浓度为10μM)可用于替代HIV cDNA Synthesis Primer。无需同时使用cDNA Synthesis Primer和随机引物。1)按表10准备反转录反应体系，继续加入其它组分(总体积20μL)，短暂离心(混匀反应液并富集于离心管底)，37℃温育60min。

[0187] 表10反转录反应体系

[0188] 试剂 用量Reverse Transcription Buffer(10×) 2.0μL
25mM dNTP 1.0μL
TM
RNaseLock RNase抑制剂 1.0μL
Reverse Transcription Enzyme 1.0μL
总量 20.0μL

[0189] 2)90℃，10min。该产物作为待测样品可直接用于qPCR检测实验，或者保存于‑20℃。

[0190] 4.qPCR反应

[0191] 1)准备制作标准曲线样品

[0192] 稀释阳性参照标准品(来自试剂盒Lenti‑PacTM慢病毒滴度检测试剂盒9
(GeneCopoeia,LT006)，其拷贝数为1x 10copies/μL)。

[0193] 制作标准曲线(后续每个稀释梯度取2μL作为模板进行qPCR反应)。①起始拷贝数：8
1x 10copies/μL(操作方法：5μL qPCR standard(DNA)+45μL ddH2O)

[0194] ②起始拷贝数：1x 107copies/μL(操作方法：5μL①+45μL ddH2O)

[0195] ③起始拷贝数：1x 106copies/μL(操作方法：5μL②+45μL ddH2O)

[0196] ④起始拷贝数：1x 105copies/μL(操作方法：5μL③+45μL ddH2O)

[0197] ⑤起始拷贝数：1x 104copies/μL(操作方法：5μL④+45μL ddH2O)

[0198] ⑥起始拷贝数：1x 103copies/μL(操作方法：5μL⑤+45μL ddH2O)

[0199] 2)按表11准备qPCR反应体系(总体积20μL)：

[0200] 表11 qPCR反应体系

[0201]

[0202] 注意：

[0203] ①将反应体系中的各个组分进行预混(除了阳性参照标准品和样品)后再进行分管。

[0204] ②qPCR反应中要设置无模板(NTC)组。

[0205] ③参考品取样，每个稀释管取2μL：

[0206] 3)qPCR反应程序

[0207] 表12反应程序适用于Bio‑Rad iQ5 real time PCR检测系统。本领域技术人员可以根据所使用的检测系统进行常规微调。表13为溶解曲线程序。

[0208] 表12 qPCR反应程序

[0209]

[0210] 表13溶解曲线程序

[0211]温度 间隔温度 时长
72‑95℃ 0.5℃ 6sec/each

[0212] 4)数据分析

[0213] ①qPCR反应后，读取每一个参考品的Ct值(扩增阈值循环数)，以log(起始拷贝数)为横坐标、Ct值为纵坐标绘制标准曲线，如图9(梯度稀释的参考品log(起始拷贝数)对应Ct值的标准曲线图)，并获得曲线公式。标准曲线的相关系数应高于0.99。

[0214] ②将读取待测样品的Ct值，代入①中(图9中所示)标准曲线的公式(y＝‑3.4363x+35.451)，计算其对应的log(起始拷贝数)及其起始拷贝数。

[0215] ③将上述起始拷贝数乘以稀释系数(以下为稀释倍数的计算公式)，得到原始样本的拷贝数(copies/ml)。

[0216]

[0217] 注意：

[0218] (A)RNA体积：50μL(根据本实验流程)

[0219] (B)原始样品体积：用于RNA抽提的慢病毒颗粒溶液体积10μl

[0220] (C)DNase反应体积：25μL(根据本实验流程)

[0221] (D)DNase反应中的RNA体积：20μL(根据本实验流程)

[0222] (E)RT反应体积：20μL(根据本实验流程)

[0223] (F)RT反应中的RNA体积：10μL(根据本实验流程)

[0224] (G)PCR反应中的cDNA体积：2μL(根据本实验流程)

[0225] ④由于每一个慢病毒颗粒含有2个单股正链的RNA基因组，因此，得到的慢病毒颗粒数应为拷贝数的1/2。故而，慢病毒颗粒数物理滴度(copies/ml)为原始样本拷贝数除以2。表14为慢病毒颗粒物理滴度计算过程数据表。

[0226] 表14慢病毒颗粒物理滴度计算过程数据表

[0227]

[0228] 具体方法二：使用荧光显微镜细胞计数法测定慢病毒生物拷贝数(滴度)

[0229] 第一天：培养H1299细胞( CRL‑5803TM)

[0230] 1.使用24孔培养板，铺板培养细胞，每孔各加入细胞5×104、DMEM全培养基0.5mL(添加10％热灭活胎牛血清、青霉素‑链霉素双抗)，在5％CO2、37℃条件下培养过夜(约24h)。

[0231] 第二天：感染H1299细胞

[0232] 2.细胞培养24h后，去除细胞培养液，先加入250μl的DMEM培养基(添加10％热灭活胎牛血清、青霉素‑链霉素双抗溶液)，再加入以下步骤3所示的稀释慢病毒。每种慢病毒分别对应细胞培养板的3个板孔。

[0233] 3.慢病毒带有荧光标记可使用荧光显微镜细胞计数法测定检测滴度。先梯度接种慢病毒，每孔添加0.03μL、0.3μL、0.3μL慢病毒原液(各三个复孔)。各孔分别加入适当DMEM培养基(添加10％热灭活胎牛血清、青霉素‑链霉素双抗溶液)至终容量为每孔0.5mL。空白对照孔作为参照。

[0234] 第三天：更换培养基

[0235] 4.去除旧培养基，以DMEM培养基(添加5％热灭活胎牛血清、青霉素‑链霉素双抗溶液)培养24小时。

[0236] 5.使用倒置荧光显微镜，以荧光显微镜细胞计数法测定慢病毒滴度

[0237] 选取荧光细胞数量能在显微镜下计算的孔，在显微镜下随机挑选5个视野拍照，计算孔板里荧光数量。

[0238] 在加入0.03μl病毒的孔中，荧光细胞数量适中能计算细胞数，孔里5个视野的荧光细胞平均数是X，按下面的公式计算：

[0239] 慢病毒液滴度(TU/mL)＝X(荧光细胞平均数)×63.3(24孔板的面积/显微镜观察视野的面积)/0.03μl(实际添加的慢病毒液体积)。

[0240] 得到表15使用荧光显微镜细胞计数法测定的慢病毒生物滴度。

[0241] 表15荧光显微镜细胞计数法测定的慢病毒生物滴度

[0242]

[0243] 备注：1TU/ml约等于100copies/ml

[0244] 慢病毒感染H1299细胞后，通过倒置荧光显微镜，得到如图10的荧光图片。(用倒置荧光显微镜，100倍视野，用GFP荧光拍照计数，将图中所有荧光亮点计数，图中箭头表示其中一个荧光点)。图10注：将图中所有荧光亮点计数，图中箭头表示其中一个荧光点。

[0245] 具体方法三：流式细胞荧光计数法测定慢病毒生物滴度

[0246] 步骤1～4，与方法二中1‑4步骤相同。

[0247] 第四天：以流式细胞荧光计数法测定慢病毒滴度

[0248] 5.以流式细胞荧光计数法测定慢病毒滴度(流式细胞仪型号：BD FACSMelody)[0249] 带上eGFP荧光的细胞可用FACS(流式细胞分析技术)进行计数。使用荧光显微镜可进行eGFP荧光观察。观察荧光状态后，细胞以胰酶消化，用DMEM完全培养基终止消化，再离心500g，10min，使用1ml PBS悬浮细胞，用血细胞计数器测定每孔细胞总数。然后上流式细胞仪进行分析，得出荧光细胞百分比，获得图11(带eGFP荧光的细胞流式细胞仪分析的数据图)，按下面的公式计算：

[0250] 慢病毒液滴度(TU/mL)＝荧光细胞百分比×孔的细胞总数÷实际添加的慢病毒液体积(单位：mL)。

[0251] 得到表16，慢病毒的生物滴度。

[0252] 表16慢病毒的生物滴度表

[0253]

[0254] 备注：1TU/ml约等于100copies/ml

[0255] 具体方法四：ddPCR方法检测慢病毒RNA拷贝数

[0256] 1.实验材料

[0257] 试剂：Bio‑Rad ddPCRTM Supermix for Probes(No dUTP)

[0258] 设备：Bio‑Rad QX200 droplet digital PCR System

[0259] 2.实验步骤

[0260] 1)将逆转录慢病毒颗粒RNA得到的cDNA用ddH2O(DNase free)进行10倍梯度稀释，得到4个ddPCR待测样品；

[0261] 2)将ddPCRTM Supermix for Probes(No dUTP)在室温下融解，上下颠倒混匀并进行短暂离心；

[0262] 3)按表17配制ddPCR Reaction Mix(FAM/HEX双通道)

[0263] 表17 ddPCR反应体系

[0264]

[0265]

[0266] 4)配好的体系震荡混匀离心后，小心地将其转移到微滴发生卡中间一排的样品孔内，并在下排的孔中加入70μL微滴发生油，然后在微滴生成仪中生成微滴。

[0267] 5)将生成好微滴的样品(40μL)从微滴发生卡的上排孔中转移到ddPCR专用96孔板中，盖上铝膜后用PX1热封仪对96孔板进行封膜。

[0268] 6)封好膜之后应该在30min内进行PCR反应，或者放于4℃冰箱4h之内进行PCR，按表18进行PCR反应，升降温速度设置为2℃/sec。

[0269] 表18 PCR反应

[0270]

[0271] 7)PCR结束后，将96孔板取出，在微滴读取仪上进行微滴读取。

[0272] 8)微滴读取结束后，在Bio‑radQuantaSoft软件上分析数据结果，按图12计算“模拟病毒”cDNA中ORF1ab和N基因的拷贝数浓度。

[0273] 实施例5：提取RNA

[0274] 1.实验材料

[0275] 试剂：GeneCopoeiaRNAzolTM RT RNA Isolation Reagent，异丙醇，75％乙醇，ddH2O(RNase and DNase free)。

[0276] 设备：漩涡震荡器。

[0277] 2.实验步骤

[0278] 1).样品处理

[0279] 取约400μl病毒悬液加入装有1ml RNAzol RT的1.5～2ml离心管中，振荡混匀后室温静置约5min；

[0280] 2).相分离

[0281] 每1ml RNAzol RT加入400μl ddH2O(RNase and DNase free)，或补充ddH2O(RNase and DNase free)至1.4ml，盖上盖子，振荡混匀约15sec，室温静置5～15min。10000rpm离心15min；

[0282] 3).沉淀

[0283] 转移上清至新的1.5～2ml离心管中，加入等体积的异丙醇，室温静置10min。10000g离心10min。

[0284] 4).洗涤

[0285] 弃上清，余下沉淀加入400μl 75％乙醇，混匀后7500g离心1～3min，此步重复一次。

[0286] 5).溶解

[0287] 弃上清，自然风干沉淀，加入50μlTE(RNase and DNase free)溶解，即为总RNA。

[0288] 实施例6：cDNA制备

[0289] 1.实验材料

[0290] 试剂：GeneCopoeiaSureScriptTM First‑Strand cDNA Synthesis Kit，慢病毒RNA，DEPC水。

[0291] 设备：普通PCR仪。

[0292] 2.实验步骤

[0293] 1).配制逆转录体系

[0294] 按GeneCopoeiaTMSureScriptTM First‑Strand cDNA Synthesis Kit说明书按表19配制逆转录体系：

[0295] 表19 cDNA制备的逆转录体系

[0296]

[0297]

[0298] 2).逆转录反应

[0299] 在普通PCR仪上按表20进行逆转录程序。

[0300] 表20 cDNA制备的逆转录程序

[0301] 反应温度 时长25℃ 5min
50℃ 60min
85℃ 5min

[0302] 逆转录后的cDNA置于‑20℃保存。

[0303] 实施例7：使用RNA质控品筛选反应体系最优的逆转录酶浓度

[0304] 1.实验材料

[0305] 试剂：逆转录酶SW2050TM、拷贝数为50copies/rxn的RNA质控品、核酸检测试剂盒(荧光RT‑qPCR法)。

[0306] 设备：荧光定量PCR仪。

[0307] 2.实验步骤

[0308] 1).配制不同浓度的逆转录酶

[0309] 配制浓度分别为11.5U/rxn、9.2U/rxn、6.9U/rxn、4.6U/rxn、2.3U/rxn和0U/rxn的TM逆转录酶SW2050 。

[0310] 2).引物探针的设计

[0311] 探针及引物的信息见表21、表22。

[0312] 表21探针序列及荧光标记信息

[0313]

[0314] 表22引物序列及相关信息

[0315]

[0316]

[0317] 3).用核酸检测试剂盒，分别采用不同引物探针进行检测和定量。

[0318] 3.实验结果不同浓度的逆转录酶体系采用不同引物探针检测所得的Ct值见表23。

[0319] 表23不同浓度的逆转录酶体系采用不同引物探针检测所得的Ct值

[0320]

[0321] 结果显示：9.2U/rxn是逆转录酶SW2050TM的最佳工作浓度。

[0322] 实施例8：使用质控品检测样本采集材料的释放效率

[0323] 1.实验材料

[0324] 试剂：慢病毒颗粒、样本保存液、QIAGEN试剂盒、咽拭子A、咽拭子B，核酸检测试剂盒(荧光RT‑qPCR法)。

[0325] 设备：荧光定量PCR仪。

[0326] 2.实验步骤

[0327] 1).样本的制备

[0328] 将3×105/ml分子数慢病毒颗粒添加至咽拭子A，然后释放于样本保存液得到RNA样本1。

[0329] 将3×105/ml分子数慢病毒颗粒添加至咽拭子B，然后释放于样本保存液得到RNA样本2。

[0330] 将3×105/ml分子数慢病毒颗粒直接添加至样本保存液得到RNA样本3。

[0331] 2).用QIAGEN试剂盒分别提取上述三个样本中的RNA。

[0332] 3).利用核酸检测试剂盒进行检测。

[0333] 样本的制备、检测流程见图13。

[0334] 3.实验结果

[0335] 不同样本不同荧光通道检测所得Ct值见表24。

[0336] 表24不同样本不同荧光通道检测所得Ct值

[0337]

[0338] 从检测的Ct值显示我们使用的2种咽拭子释放效率基本一致，相较直接将样本释放于样本保存液，Ct值有所延后，但是Ct值延后不明显。

[0339] 实施例9：使用质控品检测RNA不同提取试剂和方法的效率

[0340] 1.实验材料

[0341] 试剂：灭活保存液、QIAGENE试剂盒、康为磁珠，核酸检测试剂盒(荧光RT‑qPCR法)。

[0342] 设备：荧光定量PCR仪。

[0343] 2.实验步骤

[0344] 1).样本的制备

[0345] 将3×105/ml分子数模拟病毒添加至灭活保存液，后用QIAGENE试剂盒进行RNA抽提得到样本1#。

[0346] 将3×105/ml分子数模拟病毒添加至灭活保存液，后用康为磁珠进行RNA抽提得到样本2#。

[0347] 2).用核酸试剂盒检测上述样本1#和样本2#。

[0348] 样本的提取、检测流程见图14。

[0349] 3.实验结果

[0350] 不同提取方法不同荧光通道检测所得Ct值见表25。

[0351] 表25不同提取方法不同荧光通道检测所得Ct值

[0352] 提取方法样本 QIAGEN提取1# 磁珠提取2# NTCFL‑S 21.3 26.5 34.2
N‑Hex 23.5 27.8 35.8

[0353] 获得的RNA荧光定量PCR检测结果显示Ct值提前约6，QIAGENE提取的效果较磁珠要好。

[0354] 实施例10：使用质控品建立核酸检测模型

[0355] 1.实验材料

[0356] 试剂：核酸检测试剂盒(荧光RT‑qPCR法)

[0357] 仪器：荧光定量PCR仪

[0358] 2.实验步骤

[0359] 1).标准曲线样品的制备：

[0360] 固定掺入阳性标准品反应浓度，梯度稀释阳性质控品RNA，制作标准曲线，稀释方法如下：

[0361] 例如：初始RNA的反应浓度为200copies/μL，可二倍梯度稀释，也可三倍梯度稀释，或者其他梯度稀释。三倍梯度稀释阳性质控品RNA所得分子拷贝数见表26。

[0362] 表26三倍梯度稀释阳性质控品RNA分子拷贝数表

[0363]

[0364]

[0365] 2).qPCR反应

[0366] 利用核酸检测试剂盒进行检测。按表27配制qPCR反应体系，按表28程序进行qPCR反应。

[0367] 表27 qPCR反应体系

[0368] 试剂 体积2+
Mix A(Mg ，dNTP，dUTP) 5.0μL
Mix B(RTase，UDG，Taq，RNase inhibitor) 2.5μL
Mix C2(Primers,Probes) 5.0μL
DNase&RNase free H2O 6.5μL
SPRS(建议200copies/rxn) 1.0μL
临床待测样本/质控品 5.0μL
Total 25.0μL

[0369] 表28 qPCR反应程序

[0370]

[0371] 3).标准曲线的制作

[0372] 将所有梯度稀释的参考品进行qPCR反应，获得每一个样品的Ct值(扩增阈值循环数)，以log(起始拷贝数)为横坐标X、Ct值为纵坐标Y，获得标准曲线，结果如图15，并获得曲2
线公式及相关系数R。

[0373] 4).样品分子拷贝数定量

[0374] 读取待测样品的Ct值，将其代入标准曲线公式，计算其对应的log(起始拷贝数)及其起始拷贝数。

[0375] 举例：不同浓度可掺入待测样本的阳性标准品和质控品参数模型qPCR测定结果见表29。

[0376] 表29不同浓度可掺入待测样本的阳性标准品和质控品参数模型qPCR测定结果[0377]

[0378]

[0379] 注：固定标准品N基因检测浓度为50Copies/rxn、25Copies/rxn、12.5Copies/rxn及2.5Copies/rxn；NA表示：未检测到Ct值。

[0380] 3.实验结果分析

[0381] 如果临床样本检测Ct值在掺入标准品/质控品的线性曲线(Ct值)内，则可以根据标准品的分子拷贝数浓度定量标准曲线(以上表梯度稀释结果所得曲线公式为例)Ct＝‑3.2527log(x)+35.575，(R2＝0.9889)计算qPCR反应中待测样本的对应靶标分子拷贝数浓度c(copies/rxn)，再根据待测样本的上样体积V(μL)，可计算临床样本中待测靶标的分子拷贝数浓度C(copies/mL)：C＝c×(1/V)×1000。