一种用于检测水稻细菌性条斑病菌的引物对及检测方法转让专利
申请号 : CN202110553869.9
文献号 : CN113186315B
文献日 : 2022-04-08
发明人 : 罗金燕 , 张健男 , 陈磊 , 张洁净 , 安千里 , 李斌
申请人 : 上海市农业技术推广服务中心
摘要 :
权利要求 :
1.一种用于检测水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)的引物对,其特征在于,包括上游引物和下游引物,其核苷酸序列分别为:上游引物:5'‑ATCGAACGATGTCACCAGGG‑3';
下游引物:5'‑AGAAACGTGCGGCCAGATAA‑3'。
2.如权利要求1所述的引物对在检测水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)中的应用。
3.如权利要求1所述的引物对在制备用于检测水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)的试剂盒中的应用。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述试剂盒还包括SYBR Green I染料。
5.一种检测水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)以待测样品的DNA作为扩增模板,采用如权利要求1所述的引物对,建立SYBR Green荧光定量PCR反应体系,进行荧光定量PCR扩增;
(2)根据Ct值和Tm值判定检测结果,若反应曲线呈“S”型,且Ct值≤36、Tm值介于87.5℃‑88℃之间,则判定待测样品中含有水稻细菌性条斑病菌;若扩增曲线为一条直线,则判定待测样品中不含有水稻细菌性条斑病菌。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,待测样品为细菌、提取的细菌DNA或含有细菌/细菌DNA的粗提液。
7.如权利要求5所述的方法,其特征在于,以每20μL计,荧光定量PCR反应体系组成为:2×ChamQ SYBR Master Mix 10μL,10μM的上、下游引物各0.4μL,基因组DNA1μL,无菌超纯水
8.2μL。
8.如权利要求5所述的方法,其特征在于,荧光定量PCR扩增程序为:1)95℃预变性30s;
2)95℃10s、60℃30s,进行40个循环。
说明书 :
一种用于检测水稻细菌性条斑病菌的引物对及检测方法
技术领域
背景技术
许多国家也将其列为检疫性细菌,并限制从疫区调运种子。该病害最早发现于1918年的菲
律宾,目前主要分布在热带和亚热带气候的水稻产区,我国水稻细菌性条斑病主要分布在
南方的大部分省区,如云南、广东、广西、贵州、四川、福建、浙江、安徽等。该病害主要危害水
稻的叶片,可以导致水稻大幅度减产,一般发病轻的减产10%‑20%,严重时减产可达
40.16%,给我国水稻产业的健康发展带来严重的威胁。
遍采用和认可的检测技术,但是传统检测方法费时费力,需要对病原进行分离纯化,往往因
为样品带菌少和分离纯化过程复杂等而失败,从而造成漏检及病菌的扩散。血清学检测法
主要是依靠ELISA,但由于不同菌株的抗体较难获得,且特异性低,容易发生免疫交叉反应。
细菌性条斑病和水稻细菌性白叶枯病这两种处于亚种水平关系的病原,而且普通PCR过程
复杂,需要PCR后处理及电泳鉴定,易引起污染和假阳性的发生。
探针价格昂贵。SYBR Green I染料是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料,其与双链DNA
结合后荧光信号显著增强,不需要设计探针,通用性较好,并且价格相对较低,国内外在科
研、检测中使用比较普遍。
的水稻细菌性条斑病和水稻细菌性白叶枯病。韩阳等(2012)基于SYBR Green I建立的检测
水稻细菌性条斑病菌的荧光PCR方法所用引物Xoc2071F/Xoc2071R对Xanthomonas oryzae
pv.oryzicola的检测特异性低,容易造成检测结果的假阳性。
发明内容
性的缺点。
Subsystem Technology)原核生物基因组注释网站(http://rast.nmpdr.org/)进行注释,
以消除不同注释工具识别编码基因的差异。从运行PGAP得到的Orthologs_Cluster结果中
找到Xanthomonas oryzae pv.oryzicola种所有菌株都有但其他菌株没有的特异性标志蛋
白,将它们的氨基酸序列在NCBI非冗余蛋白数据库中用默认设置进行在线BLASTP检索,排
除在其他科属菌株有同源序列的蛋白,最后将特有蛋白的编码基因的核苷酸序列在
Xanthomonas oryzae pv.oryzicola种所有菌株全基因组序列组成的数据库中进行本地
BLASTN,以再次确定序列仅在种内有高度同源性,确定GenBanK登录号为AEQ97713.1的蛋白
作为Xanthomonas oryzae pv.oryzicola特有蛋白。
用性和特异性强的引物,对Xanthomonas oryzae pv.oryzicola种各菌株和近缘种进行PCR
检测,检验引物的通用性和特异性,确定Xanthomonas oryzae pv.oryzicola的特异引物。
当然也可以是其他由本引物参与的衍生的方法。检测的结果说明待测样品中是否含有特定
的DNA片段,检测的对象可以是提取纯化的DNA、细菌菌体、含有细菌或细菌DNA的样品(如植
物组织、种子等)。
判定待测样品中不含有水稻细菌性条斑病菌。
段的特异性引物对,本发明的引物与水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)、
柑橘溃疡病菌(Xanthomonas campestris pv.citri)、水稻细菌性褐条病菌(Acidovorax
oryzae)、水稻细菌性基腐病菌(Dickeya zeae)、水稻细菌性穗枯病菌(Burkholderia
glumae)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)均无交叉反应,具有良好的特异性,灵敏度可达
0.25pg/μL。
该方法检测灵敏度高,检测时间短,可以提高检测效率,无需病原菌培养、性状分析等复杂
操作,具有重要的应用价值。
附图说明
μL、25×10 ng/μL、25×10 ng/μL、25×10 ng/μL、25×10 ng/μL和25×10 ng/μL的
Xanthomonas oryzae pv.oryzicola RS105的基因组DNA。
的带菌量分别为10个/mL,10个/mL,10个/mL和10个/mL。
oryzae pv.oryzae)、十字花科蔬菜黑腐病菌(Xanthomonas campestris)、柑橘溃疡病菌
(Xanthomonas campestris pv.citri)、甘蔗白条病菌(Xanthomonas albilineans)以及水
稻上的一些常发性细菌病害水稻细菌性褐条病菌(Acidovorax oryzae)、水稻细菌性基腐
病菌(Dickeya zeae)、水稻细菌性穗枯病菌(Burkholderia glumae)、成团泛菌(Pantoea
agglomerans)和无菌去离子水。
具体实施方式
市售商品。
campestris pv.citri、甘蔗白条病菌Xanthomonas albilineans、水稻细菌性基腐病菌
Dickeya zeae由上海出入境检验检疫局赠送;十字花科蔬菜黑腐病菌Xanthomonas
campestris购自中国普通微生物菌种保藏管理中心;水稻上的一些常发性细菌病害如水稻
细菌性褐条病菌Acidovorax oryzae购自中国普通微生物菌种保藏管理中心;水稻细菌性
穗枯病菌Burkholderia glumae由本实验自水稻上分离保存;成团泛菌Pantoea
agglomerans由舟山海关综合技术服务中心赠送。
到Xanthomonas oryzae pv.oryzicola致病变种所有菌株都有但其他近缘种没有的特异性
标志蛋白,之后将特有蛋白的编码基因的核苷酸序列在Xanthomonas oryzae
pv.oryzicola致病变种所有菌株全基因组序列组成的数据库中进行本地BLASTN,以再次确
定序列仅在种内有高度同源性,确定GenBanK登录号为AEQ97713.1的蛋白作为Xanthomonas
oryzae pv.oryzicola特有蛋白。
到了一对针对水稻细菌性条斑病菌特异的引物对,具体如下:
Master Mix购自诺唯赞生物科技(南京)股份有限公司。
养12h,至浓度为10CFU·mL ,离心收集菌体,利用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取
细菌基因组DNA,紫外分光光度计Nanodrop 2000检测提取DNA质量和浓度。‑20℃备用。
待测样品中含有水稻细菌性条斑病菌;若反应曲线为一条直线,则判定样品中不含有水稻
细菌性条斑病菌。
标准品,取每个稀释度的DNA作模板进行荧光定量PCR扩增。扩增结束后以起始模板浓度的
对数为X轴,Ct值为Y轴绘制回归曲线,建立水稻细菌性条斑病检测的标准曲线。
2
菌检测的标准曲线为y=‑3.924x+45.665,斜率为‑3.924,R=0.991(图1)。
倍系列稀释成10 、10 、10 、10 、10 、10 ,各取1μL DNA溶液为模板,以灭菌蒸馏水为阴
性对照,进行荧光定量PCR扩增。扩增结束后,分析扩增曲线和溶解曲线,以Ct值=36为检测
底限,确定本方法能检测出的最低模板浓度作为水稻细菌性条斑病菌荧光定量PCR检测的
灵敏度。
0.25pg/μL(25×10 ng/μL)时都能顺利检测出水稻细菌性条斑病,扩增曲线呈典型S型(图
2),溶解曲线为单峰,无杂峰出现,Tm值为87.5℃‑88℃(图3)。模板浓度<0.25pg/μL以及阴
性对照的扩增曲线为一条直线,均未检测到荧光信号。
8
光光度计测定菌液OD600=0.8时,菌悬液的浓度为10 cfu/mL(连续平板稀释法测定),用
RS105菌悬液浸泡10粒健康水稻种子2h,倒掉菌悬液后,将带菌种子室温风干,用无菌水浸
泡研磨,最后将10粒带菌水稻种子研磨液稀释成不同浓度,以无菌水和健康水稻种子的研
磨液为对照进行定量PCR检测。
可以用于水稻细菌性条斑病菌带菌量低的水稻种子的检测,特异性好,灵敏度高,可以加以
推广应用。
柑橘溃疡病菌(Xanthomonas campestris pv.citri)、甘蔗白条病菌(Xanthomonas
albilineans)以及水稻上的一些常发性细菌病害水稻细菌性褐条病菌(Acidovorax
oryzae)、水稻细菌性基腐病菌(Dickeya zeae)、水稻细菌性穗枯病菌(Burkholderia
glumae)和成团泛菌(Pantoea agglomerans)的DNA进行SYBR Green荧光定量PCR。
(图5),表明SYBR Green荧光定量PCR的特异性强。