一种石斛菲类组合物及其应用

摘要

本发明提供了一种石斛菲类组合物及其应用，石斛菲类组合物包括4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲、4,7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲和4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲。该石斛菲类组合物应用在制备α‑葡萄糖苷酶抑制剂的药物中，能够有效地抑制α‑葡萄糖苷酶活性；对人体无毒副作用和药物依赖型优于现有的化学药，可以广泛应用于防治糖尿病的药物制备中。

权利要求

1.石斛菲类组合物在制备抑制α‑葡萄糖苷酶活性药物中的应用；

所述石斛菲类组合物由质量比为1：1：1的4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲、4,

7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲和4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲组成。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述石斛菲类组合物通过密花石斛、蜻蜓石斛、黄四角石斛和刀叶石斛中至少一种提取分离得到。

说明书

一种石斛菲类组合物及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种石斛菲类组合物及其应用。

背景技术

[0002] 近年来，随着人们的生活水平的提高，糖尿病的患者也在逐年增加，根据国际糖尿病组织(IDF)发布的数据预测，到2045年，整个世界将有6.29亿人患有不同程度的糖尿病，它即将成为除癌症和心脑血管疾病以外，严重影响人类生命健康和生活质量的慢性病。糖尿病是由于遗传、环境因素、肥胖和免疫系统功能紊乱导致人体内的糖、水、蛋白质和电解质代谢紊乱的综合表现。人体内长期血糖水平过高，会引起各种并发症和伴发病，包括心血管疾病、神经病变和糖尿病足等，并发症往往交替甚至同时产生，不仅会给患者带来极大的痛苦，严重导致患者死亡，而且病程长，治愈率低，这些更会给家庭和社会带来较重的负担。

[0003] 目前市场上常用的降糖药物有四类：（1）α‑葡萄糖苷酶抑制剂，如伏格列波糖、阿卡波糖，主要通过抑制机体α‑葡萄糖苷酶活性，减缓葡萄糖的生成和吸收，防止出现餐后高血糖；（2）双胍类降糖药，通过增加外围组织对葡萄糖的利用，从而减少胃肠道对葡萄糖的吸收；（3）磺脲类药物，主要通过刺激胰岛，促进胰岛素的分泌来降低血糖；（4）格列奈类胰岛素促分泌剂，如瑞格列奈、那格列奈等。这些降糖药物虽然在糖尿病治疗史上发挥了重要作用，但由于其靶点单一和长期使用的毒副作用，寻找新的药物已刻不容缓。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种石斛菲类组合物及其应用，该石斛菲类组合物对α‑葡萄糖苷酶具有显著抑制作用。

[0005] 本发明提供了一种石斛菲类组合物，包括4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲、4,7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲和4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲。

[0006] 该石斛菲类组合物应用在制备α‑葡萄糖苷酶抑制剂的药物中，能够有效地抑制α‑葡萄糖苷酶活性；对人体无毒副作用和药物依赖型优于现有的化学药，可以广泛应用于防治糖尿病的药物制备中。

[0007] 在本发明中，4,7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲：黄色油状，EI‑MS m/z: +302 [M] ，分子式C17H18O5；4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲：白色针状结晶，EI‑MS +
m/z: 272 [M] ，分子式C16H16O4；4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲：白色针状结晶，+
EI‑MS m/z: 272 [M]，分子式C16H16O4。

[0008] 在本发明中，所述石斛菲类组合物中4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲、4,7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲和4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲的质量比优选为1：0.9 1.1：0.9 1.1，更优选为1：0.95 1.05：0.95 1.05。具体实施例中，所述4,~ ~ ~ ~
7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲、4,7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲和4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲的质量比为1：1：1。

[0009] 本发明提供了一种上述技术方案所述石斛菲类组合物在制备抑制α‑葡萄糖苷酶活性药物中的应用。

[0010] 在本发明中，所述石斛菲类组合物通过密花石斛、蜻蜓石斛、黄四角石斛和刀叶石斛中至少一种提取分离得到。

[0011] 在本发明中，所述石斛菲类组合物通过以下方法获得：

[0012] 将密花石斛（学名：Dendrobium densiflorum Lindl.）、蜻蜓石斛（学名：Dendrobium pulchellum）、黄四角石斛（学名：Dendrobium guiberae）和刀叶石斛（学名：
Dendrobium terminale Par. et Rchb. f.）中至少一种晾干粉碎后，用95%乙醇回流提取后过滤浓缩，浓缩膏分散于水中得到悬浊液，用乙酸乙酯萃取，得到的乙酸乙酯相部分依次经正相硅胶和SephadexLH‑20反复柱层析，得到油状混合物；

[0013] 所述油状混合物加入氯仿溶解后，盖上棉球，缓慢挥发溶剂后结晶得混合物，再利用过饱和溶剂法重结晶，常温下，先加入甲醇溶解，再缓慢加入丙醇，直至出现浑浊，再加入2滴甲醇至澄清，然后加入丙醇1‑2滴至刚好未出现浑浊，加盖静置，结晶后，过滤得到4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲，上清液浓缩去掉溶剂后得到4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲；剩余的油状混合物再进行经葡聚糖凝胶柱层析分离纯化，得到4,7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲。

[0014] 在本发明中，95%乙醇回流提取的次数为多次；具体实施例中，回流提取的次数为3次。乙醇加热回流提取后减压浓缩至无醇味得到粗浸膏。悬浊液用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得到乙酸乙酯相部分。乙酸乙酯相部分采用减压柱层析，以氯仿/甲醇(1:0→0:1, v/v)梯度洗脱，再经硅胶柱和葡聚糖凝胶反复柱层析(Sephadex LH‑20)、得到油状混合物。

[0015] 所述油状混合物加入氯仿溶解后，盖上棉球，缓慢挥发溶剂后结晶得2个混合物（4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲和4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲的混合物），再经硅胶柱层析或利用过饱和溶剂法重结晶，常温下，先加入甲醇溶解，再缓慢加入丙醇，直至出现浑浊，再加入2滴甲醇至澄清，然后加入丙醇1‑2滴至刚好未出现浑浊，加盖静置，结晶后，过滤得到4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲，上清液浓缩去掉溶剂后得到化合物4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲。剩余的油状混合物再经葡聚糖凝胶柱层析（甲醇：水=1：1）分离纯化得到化合物4,7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲。

[0016] 本发明提供了一种药物，包括上述技术方案所述石斛菲类组合物和医学上可接受的辅料。

[0017] 在本发明中，所述药物中石斛菲类组合物的含量为0.5 1wt%。~

[0018] 本发明可按照本领域常规制剂方法制备成临床上常规制剂，例如可以向本发明有效量的剂量下加入药学上可接受辅料，例如黏合剂、润滑剂、崩解剂、分散剂等，制备成各种口服药剂，本发明优选制颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。

[0019] 对于本领域技术人员来说，在知晓活性成分的情况下，可根据常规的制剂方法，轻易的制成各种药剂产品，同时在制备中所采用的辅料也为本领域所公知，如麦芽糊精、山梨醇、硬脂酸镁等。

[0020] 本发明提供了一种石斛菲类组合物，包括4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲、4,7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲和4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲。该石斛菲类组合物应用在制备α‑葡萄糖苷酶抑制剂的药物中，能够有效地抑制α‑葡萄糖苷酶活性；对人体无毒副作用和药物依赖型优于现有的化学药，可以广泛应用于防治糖尿病的药物制备中。

附图说明

[0021] 图1为三种石斛菲类化合物的结构示意图；

[0022] 图2为本发明提供的提取三种石斛菲类化合物的流程示意图。

具体实施方式

[0023] 为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种石斛菲类组合物及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0024] 预备实施例

[0025] 将800g密花石斛植物晾干粉碎后，用体积分数为95%的乙醇加热回流提取3次，减压浓缩至无醇味得粗浸膏。将粗浸膏分散于水中成为悬浊液，用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得乙酸乙酯部分。乙酸乙酯部分采用减压柱层析，以氯仿/甲醇(1:0→0:1, v/v)梯度洗脱，再经硅胶柱层析、反复葡聚糖凝胶柱层析(Sephadex LH‑20)、得到油状混合物，其中通过加入氯仿溶解后，盖上棉球，缓慢挥发溶剂后常温下结晶得2个混合物，混合物经利用过饱和溶剂法重结晶，常温下，先加入甲醇溶解，再缓慢加入丙醇，直至出现浑浊，再加入2滴甲醇至澄清，然后加入丙醇1‑2滴至刚好未出现浑浊，加盖静置，结晶后，过滤得到化合物1，上清液浓缩去掉溶剂后得到化合物2。油状混合物的剩余部分，再经葡聚糖凝胶柱层析（甲醇：水=1：1）分离纯化得到化合物3，见流程图2。

[0026] 3个菲类化合物的物理常数和波谱数据：

[0027] 4,7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲 (1):黄色油状 (氯仿), EI‑MS m/z: + 1302 [M]，分子式C17H18O5。  H‑NMR (CDCl3, 500 MHz) d: 7.99 (1H, s, H‑5), 6.78 (1H, s, H‑8), 6.40 (1H, s, H‑1), 3.93 (6H, s, OCH3‑3, 6), 3.89 (3H, s, OCH3‑2), 
13
2.73 (2H, m, H‑10), 2.69 (2H, m, H‑9)。C‑NMR (CDCl3, 125 MHz) d : 103.8 (C‑
1), 150.1 (C‑2), 134.4 (C‑3), 146.5 (C‑4), 114.8 (C‑4a), 124.8 (C‑4b), 110.9 (C‑5), 144.8 (C‑6), 143.9 (C‑7), 113.8 (C‑8), 131.0 (C‑8a), 29.2 (C‑9), 30.8 (C‑10), 134.5 (C‑10a), 55.9 (2‑OCH3), 56.3 (3‑OCH3), 61.2 (6‑OCH3)。

[0028] 4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲 (2): 白色针状结晶 (甲醇)，EI‑MS m/+ 1z: 272 [M] ，分子式C16H16O4。  H‑NMR (DMSO‑d6, 500 MHz ) d: 7.25 (2H, d, J = 7.9 Hz, H‑6, 8), 7.01 (1H, t, J = 7.6 Hz, H‑7), 6.77 (1H, s, H‑1), 3.95 (3H, s, 
13
OCH3‑3), 3.84 (3H, s, OCH3‑2), 2.73 (4H, s, H‑9, 10)。C‑NMR (DMSO‑d6, 125 MHz) d : 104.9 (C‑1), 152.2 (C‑2), 136.7 (C‑3), 145.5 (C‑4), 115.2 (C‑4a), 121.2 (C‑4b), 152.2 (C‑5), 116.5 (C‑6), 128.0 (C‑7), 120.5 (C‑8), 141.1 (C‑8a), 
30.8 (C‑9), 30.9 (C‑10), 136.0 (C‑10a), 60.7 (2‑OCH3), 56.3 (3‑OCH3)。

[0029] 4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲 (3): 白色针状结晶 (甲醇)，EI‑MS m/+ 1z: 272 [M] ，分子式C16H16O4。  H‑NMR (CD3OD, 500 MHz) d: 8.21 (1H, d, J = 8.2 Hz, H‑5), 6.67 (1H, d, J = 10.9 Hz, H‑5), 6.65 (1H, d, J = 10.9 Hz, H‑6), 6.38 (1H, s, H‑8), 3.75 (3H, s, OCH3‑2), 3.66 (3H, s, OCH3‑3), 2.64 (4H, s, H‑9, 
13
10)。C‑NMR (CD3OD, 125 MHz) d : 104.2 (C‑1), 151.8 (C‑2), 135.3 (C‑3), 148.6 (C‑4), 115.1 (C‑4a), 126.3 (C‑4b), 130.0 (C‑5), 113.6 (C‑6), 156.2 (C‑7), 
115.1 (C‑8), 140.3 (C‑8a), 31.2 (C‑9), 31.4 (C‑10), 136.3 (C‑10a), 56.2 (2‑OCH3), 61.2 (3‑OCH3)。

[0030] 实施例1 制备本发明所述化合物的颗粒剂

[0031] 按照重量称取原料（单位：g）: 4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲、4,7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲和4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲各20 g, 丙二醇6 g三份，麦芽糊精10g三份，水150ml。

[0032] 先将三份丙二醇分别溶解4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲、4,7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲和4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲，其次分别加入
150 ml 中加热50‑60℃溶解，然后分别缓慢加入麦芽糊精混合均匀，最后经冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥成粉末，经制粒后既得颗粒剂。

[0033] 实施例2：制备本发明所述化合物的胶囊剂

[0034] 按照重量称取原料（单位：g）: 4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲、4,7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲和4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲各30 g, 丙二醇10 g三份，麦芽糊精15 g三份，水200 ml。

[0035] 先将三份丙二醇分别溶解4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲、4,7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲和4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲，其次分别加入
200 ml 中加热50‑60℃溶解，然后分别缓慢加入麦芽糊精混合均匀，最后经冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥成粉末，装入1号胶囊，即得胶囊剂。

[0036] 实施例3：制备本发明所述化合物的片剂

[0037] 按照重量称取原料（单位：g）: 4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲、4,7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲和4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲各50 g, 丙二醇15 g三份，麦芽糊精25g三份，水300 ml。

[0038] 先将三份丙二醇分别溶解4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲、4,7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲和4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲，其次分别加入
300 ml 中加热50‑60℃溶解，然后分别缓慢加入麦芽糊精混合均匀，最后经冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥成粉末。所得粉末加入硬脂酸镁等辅料进行制粒，然后经压片机制得片剂。

[0039] 实施例4：制备本发明所述化合物的丸剂

[0040] 按照重量称取原料（单位：g）: 4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲、4,7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲和4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲各100 g, 丙二醇30 g三份，糊精或峰蜜30 g三份，羧甲基纤维素钠2g、水100 ml。

[0041] 先将三份丙二醇分别溶解4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲、4,7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲和4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲，其次分别加入
100 ml 中加热50‑60℃溶解，然后分别缓慢加入羧甲基纤维素钠、糊精或峰蜜混合均匀，送至离心造丸机制成丸剂。

[0042] 实施例5：制备本发明所述化合物的口服液

[0043] 按照重量称取原料（单位：g）: 4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲、4,7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲和4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲各10 g, 丙二醇10 g三份，山梨酸钾1.5 g三份，调味剂和香料少量，水1000 ml三份。

[0044] 先将三份丙二醇分别溶解4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲、4,7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲和4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲，其次分别加入
1000 ml 中加热60‑80℃溶解，然后分别加入山梨酸钾混合均匀，加入适量调味剂和香料，过滤灭菌后制得口服液。

[0045] 实施例6：本发明所述化合物的α‑葡萄糖苷酶抑制活性

[0046] α‑葡萄糖苷酶抑制剂，能选择性作用于小肠粘膜刷状缘上的葡萄糖苷酶，抑制多糖及蔗糖分解成葡萄糖，延缓碳水化合物的消化，减少葡萄糖吸收。使用PNPG 法对化合物的α‑糖苷酶抑制活性进行评价，由于PNPG 在α‑葡萄糖苷酶的作用下能水解产生葡萄糖和PNP（对硝基酚），PNP 在405nm 处有最大吸收，可测定其吸光度。根据公式便可计算出各样品α‑葡萄糖苷酶的抑制率及IC50 值。

[0047] 待测样品溶液的配制：取450 μL配置好的2 U/ml的α‑葡萄糖苷酶溶液于EP管中，将待测化合物溶解于DMSO后，取45 μL的该溶液加至EP管中，摇匀，分别取 4 次110 μL混合均匀的待测溶液于96孔板中；（阴性与空白：取450 μL配置好的2 U/ml的α‑葡萄糖苷酶溶液于EP管中，再取45 μL的DMSO溶液加至EP管中，摇匀，分别取 4 次110 μL混合均匀的待测溶液于96孔板中）

[0048] 将 96 孔板于 37 ℃放置 15 分钟后，各组均加入 40 μL（2.5 mmol/L的 4‑硝基苯基‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷）PNPG溶液；（空白：加入40 μL （0.1 mol/L） PBS溶液）[0049] 将 96 孔板于 37 ℃放置 15 分钟后，设置酶标仪于 405 nm波长下测量每孔的OD值吸光度.

[0050] 计算化合物对α‑葡萄糖苷酶的抑制活性，计算公式如下：

[0051] 抑制率 = （ODDMSO‑OD样）/（ODDMSO‑ODPBS）×100%

[0052] 若样品的颜色较深，需除去本底吸收：只需多做2 3组平行，最后将加入的40 μL ~底物（PNPG溶液）换成40 μL PBS溶液即可。

[0053] 计算化合物对α‑葡萄糖苷酶的抑制活性，计算公式如下：

[0054] 抑制率 =（ODDMSO‑（OD样‑OD本底））/（ODDMSO‑ODPBS）×100%

[0055] 表1  化合物α‑葡萄糖苷酶抑制活性

[0056]

[0057] 通过表1 的结果显示，4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲、4,7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲和4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲表现出很强的α‑葡萄糖苷酶抑制活性，与标准品的活性相当，IC50值分别达到1.02、1.13和1.52 mM，这说明化合物具有很好的防治糖尿病作用。

[0058] 实施例7：本发明所述三种化合物制剂的分别进行了临床试验

[0059] 1、试验对象资料

[0060] 100例糖尿病患者：年龄18 63岁；男性55例，女性45例；主要表现是饥饿和多食，手~脚麻痹、发抖，全身乏力、血压高、尿液发白，眼睛疲劳、视力下降，体重下降，精神萎靡等症状，凡具备以上症状，血糖检测偏高，即符合糖尿病的临床诊断。

[0061] 2、治疗方法与疗效评价标准：本发明所述化合物制备的颗粒剂（实施例1），口服，用量为1.0 g/日，早晚各服用一次，共两个疗程。

[0062] 3、 疗效标准：血糖是否降低，临床主要症状体征是否改善。

[0063] 有效： 服用2周后血糖明显降低，主要症状体征在第三周后消失，血糖正常。

[0064] 部分有效：服用2周后血糖明显降低，部分病症在第三周后消失，血糖正常。

[0065] 无效：服用4周后血糖无明显降低，病症不消失。

[0066] 4、临床结果：所选患者在服用药物期间，均未住院治疗，其中66例有效，32例部分有效，2例因年纪较大，病情严重无效，总有效率为98%，而且无毒副作用。

[0067] 上述临床观察结果表明本发明化合物用于治疗糖尿病疗效显著，无毒副作用，无药物依赖性。

[0068] 由以上实施例可知，本发明提供了一种石斛菲类组合物，包括4,7‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲、4,7‑二羟基‑2,3,6‑三甲氧基‑9,10‑二氢菲和4,5‑二羟基‑2,3‑二甲氧基‑9,10‑二氢菲。该石斛菲类组合物应用在制备α‑葡萄糖苷酶抑制剂的药物中，能够有效地抑制α‑葡萄糖苷酶活性；对人体无毒副作用和药物依赖型优于现有的化学药，可以广泛应用于防治糖尿病的药物制备中。

[0069] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。