油包水型纳米疫苗佐剂、制备方法及其应用

摘要

本发明公开了油包水型纳米疫苗佐剂、制备方法及其应用,所述疫苗佐剂包括以下重量百分比的成分：表面活性剂30～60％，油相30～70％，稳定剂0.5～2%。油相为矿物油和角鲨烷的混合物；其中，矿物油和角鲨烷的质量比为10:1～1:10，优选地，矿物油和角鲨烷的质量比为10:1～5:1。油包水型疫苗纳米乳液澄清透明、粘度低、免疫活性高、低残留与毒副作用小、产品性能稳定，有利于显著提高动物生产效能与产品质量安全。

权利要求

1.油包水型纳米疫苗佐剂，其特征在于：所述疫苗佐剂由以下重量百分比的成分组成：矿物油52%、角鲨烷7.5%、蓖麻油聚氧乙烯醚10％、司盘80 30％、甘油0.5％。

2.一种以权利要求1所述油包水型纳米疫苗佐剂作为疫苗佐剂在制备禽流感H9N2灭活疫苗纳米乳液中的应用。

说明书

油包水型纳米疫苗佐剂、制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及疫苗制备领域，特别是油包水型纳米疫苗佐剂、制备方法及其应用。

背景技术

[0002] 乳油佐剂是在动物用灭活疫苗中使用较广的佐剂。它能增强机体对抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型。乳油佐剂主要是由低粘度的矿物油和乳化剂组成。按照剂型可分为三类：水包油型，油包水型和双向型。

[0003] 油包水型佐剂的形态是水以小液滴的形式分散于油中。水相是内相或分散相，油是外相或分散介质。油包水型佐剂制备出的疫苗可以保护抗原分子免受机体或者外界环境的破坏，具有一定的缓释作用。目前，市场上销售的油包水型佐剂以法国赛比克公司销售的油包水型佐剂为主，其价格较高，很多畜禽养殖户无力承担。但是由现有油包水佐剂制备出的疫苗乳液粘度普遍较高，粒径粗大（1μm以上），导致注射困难，进入动物体内难以吸收代谢，注射部位发生红肿和溃烂，动物应激反应强烈。

[0004] 近年来，纳米技术与材料的发展为兽药剂型加工提供了新思路。特别是制备纳米佐剂兽用疫苗可以克服传统疫苗乳滴粗大，粘度高，有效成分利用率低的缺点。利用纳米佐剂制备出的纳米疫苗，能够使抗原分子能够以100 nm以下的粒径分散于油相中，提高了抗原分子的比表面积，更有利于被动物机体吸收，充分发挥纳米药物递送系统的优点。此外。利用纳米佐剂制备出的疫苗粘度低，流动性好，便于注射，减小动物免疫时的痛苦，大大缓解应激性反应，避免出现注射部位的红肿与溃烂。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供油包水型纳米疫苗佐剂、制备方法及其应用，要解决现阶段疫苗粘度高、注射困难、稳定性差、起效慢、持续时间短、副作用多、进入动物体内难以吸收代谢，注射部位发生红肿和溃烂，动物应激反应强烈等技术问题。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：油包水型纳米疫苗佐剂，所述疫苗佐剂包括以下重量百分比的成分：表面活性剂30～60％，油相30～70％，稳定剂0.5～2%。

[0007] 进一步，油相为矿物油和角鲨烷的混合物；矿物油和角鲨烷的体积比为10:1～1:10，优选地矿物油和角鲨烷的质量比为10:1～5:1。

[0008] 进一步，油包水型纳米疫苗佐剂与抗原提取液经过乳化后形成外观澄清透明，纳米疫苗乳液平均粒径小于50 nm；分散系数小于0.1。

[0009] 进一步，表面活性剂包括蓖麻油聚氧乙烯醚和司盘80；其中，蓖麻油聚氧乙烯醚与司盘80的质量比为10:1～1:10，优选地蓖麻油聚氧乙烯醚与司盘80的质量比为1:2.5～1:5。

[0010] 进一步，稳定剂选自泊洛沙姆、丙二醇和甘油中的一种。

[0011] 本发明还提供上述油包水型纳米疫苗佐剂的制备方法，包括以下步骤：

[0012] 步骤一，在600～1000rpm的转速下，将矿物油和角鲨烷磁力搅拌5min混合均匀制得油相；

[0013] 步骤二，在600～1000rpm的转速下，将蓖麻油聚氧乙烯醚、司盘80快速加入到步骤一得到的油相中，搅拌5min，静置后制得油包水型纳米疫苗佐剂。

[0014] 本发明还提供一种以上述油包水型纳米疫苗佐剂作为疫苗佐剂在疫苗的应用。

[0015] 本发明还提供一种以上述油包水型纳米疫苗佐剂作为疫苗佐剂在禽流感H9N2灭活疫苗纳米乳液中的应用。

[0016] 本发明的有益效果体现在：

[0017] 1，本发明提供的油包水型纳米疫苗佐剂、制备方法及其应用，可以用于生产由内水相、外层油相组成的透明纳米乳液体系，内水相液滴平均粒径小于50 nm，分散系数小于0.1的疫苗纳米乳液，可以达到纳米药物靶向递送系统的细乳尺度。

[0018] 2，本发明提供的油包水型纳米疫苗佐剂、制备方法及其应用，油包水型疫苗纳米乳液澄清透明、粘度低、免疫活性高、低残留与毒副作用小、产品性能稳定，有利于显著提高动物生产效能与产品质量安全。

[0019] 本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的主要目的和其它优点可通过在说明书、权利要求书中所特别指出的方案来实现和获得。

[0020] 附图标记：

[0021] 图1是禽流感H9N2灭活疫苗纳米乳液1‑3和禽流感H9N2灭活疫苗普通乳液的产品照片。

[0022] 图2‑1、图2‑2、图2‑3分别是禽流感H9N2灭活疫苗纳米乳液1‑3的粒径分布图。

[0023] 图3是：4℃条件下，禽流感H9N2灭活疫苗纳米乳液1‑3保存时的照片。

[0024] 图4是4℃条件下，图3中的禽流感H9N2灭活疫苗纳米乳液1‑3保存一年后的照片。

[0025] 图5是接种禽流感H9N2灭活疫苗纳米乳液1后的鸡的解剖图。

[0026] 图6是接种禽流感H9N2灭活疫苗纳米乳液2后的鸡的解剖图。

[0027] 图7是接种禽流感H9N2灭活疫苗纳米乳液3后的鸡的解剖图。

具体实施方式

[0028] 以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为对本发明技术方案的限制。

[0029] 油包水型纳米疫苗佐剂，包括以下重量百分比的成分：

[0030] 表面活性剂30～60％，表面活性剂包括蓖麻油聚氧乙烯醚和司盘80；其中，蓖麻油聚氧乙烯醚与司盘80的质量比为10:1～1:10，优选地，蓖麻油聚氧乙烯醚与司盘80的质量比为1:2.5～1:5。

[0031] 油相30～70％，其中,油相为矿物油和角鲨烷的混合物；

[0032] 稳定剂0.5～2%。稳定剂选自泊洛沙姆、丙二醇和甘油中的一种。

[0033] 其中，矿物油和角鲨烷的质量比为10:1～1:10，优选地，矿物油和角鲨烷的质量比为10:1～5:1。油包水型纳米疫苗佐剂与抗原溶液经过乳化后形成外观澄清透明，纳米疫苗乳液平均粒径小于50 nm；分散系数小于0.1。

[0034] 上述,油包水型纳米疫苗佐剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

[0035] 步骤一，在600～1000rpm的转速下，将矿物油和角鲨烷磁力搅拌5min混合均匀制得油相；

[0036] 步骤二，在600～1000rpm的转速下，将蓖麻油聚氧乙烯醚、司盘80快速加入到步骤一得到的油相中，搅拌5min，静置后制得油包水型纳米疫苗佐剂。

[0037] 本发明还提供一种以油包水型纳米疫苗佐剂作为疫苗佐剂的疫苗的应用。

[0038] 使用本发明提供的方法进行实施例和对比例的制备,具体的,实施例1‑3成分明细见下表1所示：

[0039] 表1为实施例1‑3成分明细

[0040]

[0041] 对实施例1‑3制备的油包水型纳米疫苗佐剂和市售法国赛比克MONTANI DETM ISA 71VG油包水佐剂进行了乳化，以禽流感H9N2灭活抗原进行乳化对比实验，如下：

[0042] 1，材料：实施例1‑3制备的纳米佐剂、法国赛比克油包水佐剂(MONTANI DETM ISA 71VG)、禽流感H9N2抗原溶液；

[0043] 2，仪器：德国IKA T15型乳化机；

[0044] 3，方法：

[0045] 1)按照5:5的比例，将实施例1‑3制备的佐剂和禽流感H9N2抗原混合，剪切机调至5000 rpm/min，计时乳化5 min，静置10 min，放置4℃冰箱保存，制得禽流感H9N2灭活疫苗纳米乳液1‑3。

[0046] 2)按照7:3的比例，将法国赛比克油包水佐剂和禽流感H9N2抗原混合，剪切机调至1000 rpm/min，计时乳化10分钟，静置10 min，放置4℃冰箱保存，制得禽流感H9N2灭活疫苗普通乳液。

[0047] 3)将上述疫苗乳液分别检测其外观、粒度、粘度、离心稳定性，4℃保存稳定性、动物安全性和免疫活性。

[0048] 4，灭活疫苗纳米乳液和普通乳液比较

[0049] 1)外观：由油包水型纳米佐剂制备的疫苗乳液均为透明乳液，由法国赛比克油包水佐剂制备的疫苗乳液为乳白色乳液，进一步，参见图1是禽流感H9N2灭活疫苗纳米乳液实施例1‑3和禽流感H9N2灭活疫苗普通乳液的产品照片；

[0050] 2)粒度：经马尔文粒度仪测试，禽流感H9N2灭活疫苗纳米乳液1‑3的平均粒径为42 nm、 31nm、 37nm，参见图2‑1、图2‑2、图2‑3所示。禽流感H9N2灭活疫苗普通乳液的平均粒径为4.5 μm。

[0051] 3)粘度：在室温25℃条件下，用1mL玻璃吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2 .7mm)吸取乳液1mL，垂直自然流出，记录流出0.4mL所需时间，测定三次，取平均值。结果显示，禽流感H9N2灭活疫苗纳米乳液1‑3所需平均时间为3.9 s、3.4 s、3.7s，禽流感H9N2灭活疫苗普通乳液所需的平均时间为4.0 s。

[0052] 4)稳定性：取适量乳液经离心机6000rpm/min离心30min后，观察乳液是否发生分层和破乳。结果表明禽流感H9N2灭活疫苗纳米乳液1‑3和普通乳液均未发生分层现象。另取每种乳液5瓶（图3），放置于4℃条件下一年，观察乳液是否发生分层和破乳。结果表明禽流感H9N2灭活疫苗纳米乳液1‑3均为发生分层或者破乳（图4），禽流感H9N2灭活疫苗普通乳液在存放第8个月时有1瓶出现分层现象。

[0053] 5) 动物安全性：取21只28日龄SPF鸡分为3组，每组7只。1‑3组每只鸡注射1 mL禽流感H9N2灭活疫苗纳米乳液1‑3观察是否出现注射部位或者全身不良反应。结果表明，三组鸡均未出现注射部位或者全身不良反应。另外，28天后对这3组鸡进行解剖，观察是否存在疫苗残留情况。结果表明，纳米疫苗乳液被动物机体吸收，并未出现残留（图5‑7）。

[0054] 6)免疫活性：取35只28日龄SPF鸡分为5组，每组7只。第1‑3组每只鸡注射1 mL禽流感H9N2油包水纳米疫苗乳液1‑3，第4组每只鸡注射1.33 mL油包水普通疫苗乳液，第5组每只鸡注射1 mL生理盐水。接种后7\14\21\28\35\42日，将5组SPF鸡分别进行翅静脉采血，每只鸡采1ml，分离血清，用标准抗原测定HI抗体。结果如下表2所示：

[0055] 表2免疫活性检测结果

[0056]

[0057] 从以上结果可以看出，与法国赛比克油包水佐剂(MONTANI DETM ISA 71VG)相比，本发明的油包水型纳米疫苗佐剂具有以下优势：

[0058] 1)乳滴平均粒径小于50 nm，分布均匀，达到了纳米药物靶向递送系统的细乳尺度。抗原分子能够充分分散于流动相中，增大抗原接触面积，更易于被机体吸收，提高生物利用度。

[0059] 2)稳定性好，普通乳液（粒径在1μm以上）属于热力学不稳定体系，纳米乳液（粒径在100 nm以下）属于热力学稳定体系，由本发明制备的纳米乳液的粒径小于50 nm，相比于普通乳，在4℃存放一年未发生分层破乳现象。

[0060] 3)粘度低，纳米乳液的粒径小，使其流动性更好，动物免疫时更容易注射。

[0061] 4)免疫起效快，持效期长。

[0062] 综上所述，本发明提供的油包水型纳米疫苗佐剂、制备方法及其应用，克服了现阶段的水包油型纳米疫苗佐剂的不足，提供了实用性强、粘度低，稳定性好，起效快，持效期长、毒副作用低的新组分，制备出的兽用纳米乳容易被动物机体吸收与代谢，大大降低佐剂的毒副作用，具有很好的推广作用。

[0063] 以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。