一种靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针及其制备方法

摘要

本发明公开了一种靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针及其制备方法。该方法包括：利用两亲性分子DSPE‑PEG2000‑Mal和DSPE‑PEG2000，将具有聚集诱导发光特性的荧光分子DTPM包裹制成纳米纤维；再通过纳米纤维表面的马来酸酐(‑Mal)和多肽序列中半胱氨酸(Cys)上的巯基(‑SH)反应基团进行加成反应，在纳米纤维上引入有靶向功能的柔性链生物活性多肽链，最终制备出了具有正电荷和亲疏水结构表面的AIE纳米纤维，其靶向性通过多肽的电荷和亲疏水结构实现。该方法实现了AIE纳米纤维对细胞膜染色的靶向性，并且具有分辨率高、免洗脱、染色速度快、性能稳定等优点，有望作为一种新型的细胞膜荧光探针。

权利要求

1.一种靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将DTPM的四氢呋喃溶液、DSPE‑PEG2000‑Mal的四氢呋喃溶液、DSPE‑PEG2000的四氢呋喃溶液混合均匀，得到混合液，旋干，得到混合物；

所述DTPM的结构式为：

所述DSPE‑PEG2000‑Mal的结构式如下所示：

所述DSPE‑PEG2000的结构式如下所示：

所述混合物中，DTPM的浓度为1‑15mg/mL，DSPE‑PEG2000‑Mal的浓度为1‑20mg/mL，DSPE‑PEG2000的浓度为1‑25mg/mL；

(2)将步骤(1)所述混合物加入水中，超声震荡处理，得到分散液，过滤，得到纳米纤维；

(3)将步骤(2)所述纳米纤维重悬在水中，得到纳米纤维分散液；将生物活性多肽加入所述纳米纤维分散液中，得到混合液，搅拌反应，过滤取滤渣，得到所述靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针；

所述生物活性多肽为氨基端连接有巯基的柔性链生物活性多肽；所述柔性链生物活性多肽的氨基端通过聚乙二醇连接半胱氨酸(Cys)，进而连接巯基(‑SH)；所述柔性链生物活性多肽的序列为(Lys)a‑(Arg)b‑(Trp)c‑(Lys)d‑(Arg)e‑(Trp)f‑(Lys)g‑(Arg)h；a的取值范围为0‑2，b的取值范围为0‑2，c的取值范围为0‑3，d的取值范围为0‑2，e的取值范围为0‑2，f的取值范围为0‑3，g的取值范围为0‑2，h的取值范围为0‑2；在所述混合液中，生物活性多肽的浓度为1‑30mg/mL。

2.根据权利要求1所述的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述混合物与水的质量体积比为0.5‑1mg/mL。

3.根据权利要求1所述的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述超声震荡处理的时间为1‑3min；所述纳米纤维的分子量为10000‑5000000，所述纳米纤维的长度分布为0.5‑10μm，所述纳米纤维的宽度分布为10‑100nm。

4.根据权利要求1所述的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针的制备方法，其特征在于，在步骤(3)所述纳米纤维分散液中，纳米纤维的浓度为200‑800μg/mL。

5.根据权利要求1所述的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述搅拌反应的时间为0.5‑48h。

6.一种由权利要求1‑5任一项所述的制备方法制得的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针，其特征在于，长度为0.5‑10μm，宽度为10‑100nm。

说明书

一种靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种能够靶向染色细胞膜的荧光探针，具体涉及一种靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针及其制备方法。

背景技术

[0002] 细胞膜是细胞与周围环境之间信息和物质交换的通道，它们的形状和形态不断地发生着动态变化，是完成胞吞、胞吐和信号传输等细胞正常生理活动的重要结构。细胞膜的形态是细胞状态的直接标志，例如细胞膜破裂或部分吞噬就是细胞凋亡的重要证据。此外，细胞膜作为细胞的第一道防护屏障，一旦受到外界有害物质(如重金属离子)的伤害，就会发生形态和结构的改变。因此，实时跟踪观察细胞膜对细胞生物学、药理学、毒理学等都有重要价值。如今已经有使用明场显微镜对细胞膜进行观察的报道，但是由于该方式分辨率低，颜色区分不明显等原因，这些结果对细胞膜相关观察研究的帮助极其有限。荧光显微术是一种功能强大、可靠的方法，提供了直观、生动的信息。然而，这项技术对荧光探针的性能有很高的依赖性。

[0003] 目前所使用的传统荧光探针大多会发生聚集诱导淬灭(ACQ)效应，在使用过程中存在生物检测的信号量低、灵敏性差以及易于发生光漂白等问题。而聚集诱导发光(AIE)材料的发现很好的解决了这一问题，其在聚集态下可以激发更强的荧光，并且形成的AIE聚集体具有优异的光稳定性和抗光漂白性，可以实现长时间稳定的荧光追踪和监测。尽管如此，由于AIE分子往往分子量较大，结构疏水性强，对其亲水性和功能化修饰比较困难，并且修饰可能对其光物理性质造成不好的影响。因此如何利用一种简单的方式实现AIE分子的修饰和功能化是许多科研工作者正在研究的问题，目前包裹成纳米结构是一种很好的解决这个问题的方式，但是仍存在如何对纳米结构进行修饰实现特定功能的问题，相关荧光探针亟待开发。

[0004] 近些年来，许多研究者致力于靶向性AIE纳米荧光探针的研究，但是这些探针往往存在靶向困难、制备方式复杂、光稳定性差、难以实现长期的标记和追踪、对正常细胞和组织具有毒性等问题，这些问题亟待解决。例如，专利CN 110231316 A公开了一种AIE‑Gd@SiO2纳米复合物荧光探针，其将AIE荧光材料与Gd@SiO2复合物结合，制备了靶向标记干细胞的纳米探针，但其仍存在具有一定的细胞毒性、染色标记所需时间长等问题。

发明内容

[0005] 为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种具有靶向细胞膜功能、制备方式简单、优异光稳定性、可实现长期的荧光标记和具有良好生物相容性的AIE荧光探针。

[0006] 本发明的目的在于制备一种能够靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维荧光探针，实现对细胞膜的长效稳定染色及观察。

[0007] 本发明的另一目的在于提供上述能够靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维的制备方法。

[0008] 本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

[0009] 本发明提供的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针的制备方法，包括如下步骤：

[0010] (1)将DTPM的四氢呋喃(THF)溶液、DSPE‑PEG2000‑Mal的四氢呋喃溶液、DSPE‑PEG2000的四氢呋喃溶液混合均匀，得到混合液，旋转蒸发除去四氢呋喃(置于旋蒸瓶中旋干)，得到混合物；

[0011] (2)将步骤(1)所述混合物加入超纯水中，超声震荡处理，得到分散液，过滤，得到纳米纤维；

[0012] (3)将步骤(2)所述纳米纤维重悬在水中，得到纳米纤维分散液；将生物活性多肽加入所述纳米纤维分散液中，得到混合液，搅拌反应，过滤取滤渣，得到所述靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针。

[0013] 进一步地，步骤(1)所述DTPM的结构式为

[0014]

[0015] 所述DTPM为2‑{3‑[5‑(4‑Diphenylamino‑phenyl)‑thiophen‑2‑yl]‑1‑phenyl‑allylidene}‑Malononitrile的英文缩写。

[0016] 进一步地，步骤(1)所述DSPE‑PEG2000‑Mal的结构式如下所示：

[0017]

[0018] 进一步地，步骤(1)所述DSPE‑PEG2000的结构式如下所示：

[0019]

[0020] 进一步地，在步骤(1)所述混合物中，DTPM的浓度为1‑15mg/mL；

[0021] 进一步地，在步骤(1)所述混合物中，DSPE‑PEG2000‑Mal的浓度为1‑20mg/mL；

[0022] 进一步地，在步骤(1)所述混合物中，DSPE‑PEG2000的浓度为1‑25mg/mL。

[0023] 进一步地，步骤(2)所述混合物与水的质量体积比为0.1‑1mg/mL。

[0024] 优选地，步骤(2)所述混合物与水的质量体积比为0.5‑1mg/mL。

[0025] 进一步优选地，步骤(2)所述混合物与水的质量体积比为1mg/mL。

[0026] 进一步地，步骤(2)所述超声震荡处理的时间为1‑3min；所述纳米纤维的分子量为10000‑5000000；

[0027] 进一步地，步骤(2)所述纳米纤维的长度分布为0.5‑10μm，所述纳米纤维的宽度分布为10‑100nm。

[0028] 优选地，步骤(2)所述超声震荡处理的时间为1min。

[0029] 优选地，步骤(2)所述过滤，包括：先将分散液先过滤头(滤过分子量为0‑5000000)，取滤液，然后将所述滤液过超滤管(滤过分子量为0‑10000)，取滤渣，即所述纳米纤维。

[0030] 进一步地，在步骤(3)所述纳米纤维分散液中，纳米纤维的浓度为200‑800μg/mL。

[0031] 进一步地，步骤(3)所述生物活性多肽为氨基端连接有巯基的柔性链生物活性多肽；所述柔性链生物活性多肽的序列为(Lys)a‑(Arg)b‑(Trp)c‑(Lys)d‑(Arg)e‑(Trp)f‑(Lys)g‑(Arg)h，a的取值范围为0‑2；b的取值范围为0‑2，c的取值范围为0‑3，d的取值范围为0‑2，e的取值范围为0‑2，f的取值范围为0‑3，g的取值范围为0‑2，h的取值范围为0‑2；

[0032] 进一步地，在步骤(3)所述混合液中，生物活性多肽的浓度为1‑30mg/mL，[0033] 进一步地，步骤(3)所述搅拌反应的时间为0.5‑48h。所述柔性链生物活性多肽的分子式可参照图4所示。

[0034] 所述氨基端连接有巯基(‑SH)的柔性链生物活性多肽，是由固相合成法进行合成，并由带正电的精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)，和带疏水基团的色氨酸(Trp)组成，柔性链生物活性多肽的序列为(Lys)a‑(Arg)b‑(Trp)c‑(Lys)d‑(Arg)e‑(Trp)f‑(Lys)g‑(Arg)h。同时，在其氨基端通过聚乙二醇连接半胱氨酸(Cys)，从而引入巯基(‑SH)反应基团。该反应通过马来酸酐基团(‑Mal)和纳米纤维表面巯基(‑SH)的加成反应实现。所述多肽连接的聚乙二醇重复单元个数n数值范围为4‑24。半胱氨酸的个数m数值范围为1。

[0035] 优选地，步骤(3)所述过滤，包括：采用超滤管(滤过分子量为0‑10000)对搅拌反应后的混合液进行离心过滤，离心过滤的转速为3000‑8000rpm，离心过滤的时间为10‑30min，取滤渣(即所述靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维)。所述靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维的分子量为10000‑1000000。

[0036] 本发明提供的一种由上述的制备方法制得的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针，其长度为0.5‑10μm，宽度为10‑100nm。

[0037] 本发明提供的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针，是由具有聚集诱导发光特性的AIE分子DTPM，经DSPE‑PEG2000‑Mal和DSPE‑PEG2000包裹并接枝靶向性柔性链生物活性多肽形成的，其示意图可参照图1所示。

[0038] 本发明提供的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维，其靶向性是由表面多肽的电荷量和亲疏水结构实现的。

[0039] 本发明提供的制备方法，利用两亲性分子DSPE‑PEG2000‑Mal和DSPE‑PEG2000，将具有聚集诱导发光特性的荧光分子DTPM包裹制成纳米纤维；再通过纳米纤维表面的马来酸酐(‑Mal)和多肽序列中半胱氨酸(Cys)上的巯基(‑SH)反应基团进行加成反应，在纳米纤维上引入具有靶向功能的柔性链生物活性多肽链，最终制备出了具有正电荷和亲疏水结构表面的AIE纳米纤维，其靶向性通过多肽的电荷和亲疏水结构实现。该方法实现了AIE纳米纤维对细胞膜染色的靶向性，并且具有分辨率高、免洗脱、染色速度快、性能稳定等优点，有望作为一种新型的细胞膜荧光探针。

[0040] 与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

[0041] (1)本发明制备的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针，能够靶向染色细胞膜，并具有优异的光稳定性和抗光漂白性；

[0042] (2)本发明制备的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针，可以长时间的稳定聚集在细胞的细胞膜上，与细胞共培养24h后仍能观察到明亮的荧光；

[0043] (3)本发明制备的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针，具有快速稳定染色细胞膜的功能，并且荧光背景低，不需要进行额外的洗脱，染色过程简单高效。

[0044] (4)本发明制备的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针，具有优异的生物相容性，在一定浓度范围内(0‑80μg/mL)对细胞的影响可以忽略不计。

附图说明

[0045] 图1是实施例所制备的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维的结构示意图；

[0046] 图2是实施例所用的DTPM分子的结构式；

[0047] 图3a和图3b分别是实施例所用的DSPE‑PEG2000‑Mal和DSPE‑PEG2000的结构式；

[0048] 图4是实施例所用的生物活性多肽的结构式；

[0049] 图5是实施例1所制备的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维的透射电子显微镜(TEM)图片；

[0050] 图6是实施例1所制备的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维在持续光照0，5，10min后的光稳定性；

[0051] 图7是实施例1所制备的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维与HeLa细胞孵育5min后的荧光结果；

[0052] 图8是实施例1所制备的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维与HeLa细胞孵育24h后的荧光结果图；

[0053] 图9是实施例1所制备的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维的生物相容性表征图；

[0054] 图10是实施例2所制备的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维的TEM图片；

[0055] 图11是实施例2所制备的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维与HeLa细胞孵育5min后的荧光结果图；

[0056] 图12是实施例3所制备的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维的TEM图片；

[0057] 图13是实施例3所制备的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维与HeLa细胞孵育5min后的荧光结果图；

[0058] 图14是对比例1所制备的纳米探针的TEM图片；

[0059] 图15是对比例2所制备的AIE纳米纤维的TEM图片；

[0060] 图16是对比例2所制备的AIE纳米纤维与HeLa细胞孵育5min后的荧光结果图；

[0061] 图17是对比例3所制备的AIE纳米纤维的TEM图片；

[0062] 图18是对比例3所制备的AIE纳米纤维与HeLa细胞孵育5min后的荧光结果图。

具体实施方式

[0063] 以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

[0064] 以下实施例所使用的DTPM分子的结构式可参照图2所示，所使用的DSPE‑PEG2000‑Mal的结构式可参照图3a所示，所使用的DSPE‑PEG2000的结构式可参照图3b所示，所使用的生物活性多肽的结构式可参照图4所示。

[0065] 实施例1

[0066] 一种靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针的制备方法，包括如下步骤：

[0067] (1)将DTPM分子、DSPE‑PEG2000‑Mal和DSPE‑PEG2000的THF溶液混合，得到混合液，在混合液中，DTPM、DSPE‑PEG2000‑Mal、DSPE‑PEG2000浓度分别为1mg/mL，1mg/mL和1mg/mL；

[0068] (2)将步骤(1)所述混合液置于旋蒸瓶中旋干(除去THF)，加入超纯水，所述混合物与超纯水的质量体积比为1mg/mL，超声震荡1min，得到分散液；

[0069] (3)利用滤头规格为450nm的滤头过滤技术，对纳米纤维进行过滤，取滤液(标记为第一次滤液)；然后利用超滤管离心(滤过分子量为0‑10000)过滤技术，离心速率为8000rpm，离心时间为30min，对所述第一次滤液进行过滤；所得纳米纤维长度分布为2.53±
1.76μm，宽度范围为22±12nm；将所述纳米纤维重悬在水中，得到纳米纤维分散液(2mg/mL)；

[0070] (4)将生物活性多肽加入上述制备的纳米纤维分散液中，得到混合液，在所述混合液中，生物活性多肽浓度为5mg/mL；生物活性多肽为氨基端连接有巯基的柔性链生物活性多肽；所述柔性链生物活性多肽(标记为多肽1)的序列如SEQ ID NO.1所示，为Lys‑Arg‑Trp‑Trp‑Lys‑Trp‑Trp‑Arg‑Arg，所述柔性链生物活性多肽的氨基端通过聚乙二醇连接半胱氨酸(Cys)，进而连接巯基(‑SH)，氨基端聚乙二醇的重复单元个数为4，半胱氨酸个数为1；

[0071] (5)对步骤(4)所述混合液进行搅拌反应(时间为24h)，之后采用超滤管(滤过分子量为0‑10000)离心过滤技术，对其过滤，离心的速率为8000rpm，离心的时间为30min，取滤渣，得到所述靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针，所述靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针的纳米纤维长度分布为2.53±1.76μm，宽度范围为22±12nm。

[0072] 利用透射电子显微镜对靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针进行形貌观察，结果如图5所示，由图5可知该实施例中所制备的材料为纤维状的纳米结构；利用紫外分光光度计对纳米纤维的光稳定性进行测量，结果如图6所示，由图6可知纳米纤维在10min的持续光照下具有优异的光稳定性；利用所制备的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针，对HeLa细胞进行荧光标记，AIE纳米纤维浓度为10μg/mL，标记的时间为5min，然后利用激光共聚焦显微镜进行观察。结果如图7所示，可以发现，该实例中所制备的纳米纤维具有快速优异的细胞染色效果，在反应5min后即可在共聚焦显微镜下观察到荧光标记的细胞膜，并且在未洗脱的情况下背景荧光微弱，不影响细胞膜的荧光观察；继续将AIE纳米纤维和HeLa细胞进行共培养，24小时后观察荧光成像情况，结果如图8所示，可以发现细胞膜上仍表现出明亮的荧光效果；将80μg/mL浓度范围的AIE纳米纤维与小鼠成纤维细胞NIH3T3共培养，24h后利用CCK‑8染料对细胞活性进行表征，结果如图9所示，可以发现细胞活性良好，在高浓度下对正常细胞没有明显活性影响，有望作为一种新型的细胞膜染色荧光探针进行相关应用。

[0073] 实施例2

[0074] 一种靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针的制备方法，包括如下步骤：

[0075] (1)将DTPM分子、DSPE‑PEG2000‑Mal和DSPE‑PEG2000的THF溶液混合，得到混合液，在混合液中，DTPM、DSPE‑PEG2000‑Mal、DSPE‑PEG2000浓度分别为15mg/mL，20mg/mL和25mg/mL；

[0076] (2)将步骤(1)所述混合液置于旋蒸瓶中旋干(除去THF)，得到混合物，加入超纯水，所述混合物与超纯水的质量体积比为0.5mg/mL，超声震荡3min，得到分散液；

[0077] (3)利用滤头规格为800nm的滤头过滤技术，对纳米纤维进行过滤，取滤液(标记为第一次滤液)；然后利用超滤管(滤过分子量为0‑5000)离心过滤技术，离心速率为3000rpm，离心时间为20min，对所述第一次滤液进行过滤，取滤渣，得到纳米纤维；所得纳米纤维长度分布为5.2±4.32μm，宽度范围为55±43nm；将所述纳米纤维重悬在水中，得到纳米纤维分散液(1mg/mL)；

[0078] (4)将生物活性多肽加入上述制备的纳米纤维分散液中，得到混合液，在所述混合液中，多肽浓度为20mg/mL；其中生物活性多肽为氨基端连接有巯基的柔性链生物活性多肽；所述柔性链生物活性多肽(标记为多肽2)的序列如SEQ ID NO.2所示，为Lys‑Lys‑Trp‑Trp‑Trp‑Arg‑Arg‑Lys‑Lys‑Arg‑Arg，所述柔性链生物活性多肽的氨基端通过聚乙二醇连接半胱氨酸(Cys)，进而连接巯基(‑SH)，聚乙二醇的重复单元个数为10，半胱氨酸个数为1；

[0079] (5)对步骤(4)所述混合液进行搅拌反应(时间为24h)，之后采用超滤管(滤过分子量为0‑5000)离心过滤技术，对其过滤，离心的速率为3000rpm，离心的时间为20min，取滤渣，得到所述靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针，所述靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针的长度分布为5.2±4.32μm，宽度范围为55±43nm。

[0080] 利用透射电子显微镜对靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针进行形貌观察，结果如图10所示，由图10可知该实施例中所制备的材料为纤维状的纳米结构。利用紫外分光光度计测定其光稳定性优异。利用所制备的靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针，对HeLa细胞进行荧光标记，AIE纳米纤维浓度为10μg/mL，标记的时间为5min，然后利用激光共聚焦显微镜进行观察。结果如图11所示，可以发现，该实施例制备的纳米纤维虽然能有效靶向细胞膜，在共聚焦下细胞膜位置可以观测到明显的荧光信号，但是由于该实例中所制备的纳米纤维尺寸较大，DTPM分子大量聚集，造成了很高的背景荧光，严重影响了对细胞膜的荧光观察。

[0081] 实施例3

[0082] 一种靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针的制备方法，包括如下步骤：

[0083] (1)将DTPM分子、DSPE‑PEG2000‑Mal和DSPE‑PEG2000的THF溶液混合，得到混合液，在混合液中，DTPM、DSPE‑PEG2000‑Mal、DSPE‑PEG2000浓度分别为10mg/mL，18mg/mL和22mg/mL；

[0084] (2)将步骤(1)所述混合液置于旋蒸瓶中旋干(除去THF)，加入超纯水，所述混合物与超纯水的质量体积比为1mg/mL，超声震荡3min，得到分散液；

[0085] (3)利用滤头规格为450nm的滤头过滤技术，对纳米纤维进行过滤，取滤液(标记为第一次滤液)；然后利用超滤管(滤过分子量为0‑10000)离心过滤技术，参数设为8000rpm/30min，对所述第一次滤液进行过滤取滤渣，得到纳米纤维；所得纳米纤维长度分布为2.65±1.46μm，宽度范围为25±14nm；将所述纳米纤维重悬在水中，得到纳米纤维分散液(0.5mg/mL)；

[0086] (4)将生物活性多肽加入上述制备的纳米纤维分散液中，得到混合液，在所述混合液中，生物活性多肽浓度为30mg/mL；

[0087] 其中生物活性多肽为氨基端连接有巯基的柔性链生物活性多肽；所述柔性链生物活性多肽(标记为多肽3)的序列如SEQ ID NO.3所示，为Arg‑Arg‑Trp‑Lys‑Lys‑Trp‑Trp‑Trp‑Lys‑Lys；所述柔性链生物活性多肽的氨基端通过聚乙二醇连接半胱氨酸(Cys)，进而连接巯基(‑SH)，聚乙二醇的重复单元个数为24，半胱氨酸个数为1；

[0088] (5)对步骤(4)所述混合液进行搅拌反应(时间为48h)，之后采用超滤管(滤过分子量为0‑10000)离心过滤技术，对其过滤，过滤实验参数为8000rpm/30min；，取滤渣，得到所述靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针，所述靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针的长度分布为2.45±1.42μm，宽度范围为22±12nm。

[0089] 利用透射电子显微镜对靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针进行形貌观察，结果如图12所示，由图12可知该实施例中所制备的材料为纤维状的纳米结构。利用紫外分光光度计测定其光稳定性优异。利用所制备的AIE纳米纤维，对HeLa细胞进行荧光标记，AIE纳米纤维浓度为20μg/mL，反应5min后，利用激光共聚焦显微镜进行观察。结果如图13所示，可以发现，该实例中所制备的纳米纤维虽然可以实现对细胞膜的靶向性染色，但与细胞共孵育5min后在共聚焦下观察到的荧光微弱，只有少量纳米纤维染色细胞膜，这是因为所修饰的生物活性多肽并非是最佳靶向细胞膜序列。

[0090] 对比例1

[0091] 一种纳米探针的制备方法，包括如下步骤：

[0092] (1)将DTPM分子和DSPE‑PEG2000‑Mal加入THF中溶解，得到混合液，在混合液中，DTPM分子和DSPE‑PEG2000‑Mal的浓度分别为7mg/mL和20mg/mL，置于旋蒸瓶中旋干(除去THF)，得到混合物，加入超纯水，所述混合物与超纯水的质量体积比为0.8mg/mL，超声震荡2min，得到分散液；

[0093] (2)利用滤头规格为220nm的滤头过滤技术，对纳米纤维进行过滤，取滤液(标记为第一次滤液)；然后利用超滤管(滤过分子量为0‑10000)离心过滤技术，参数设为5000rpm/10min，对所述第一次滤液进行过滤，取滤渣，得到纳米纤维。

[0094] 利用扫描电子显微镜对该实例所制备的纳米纤维进行形貌表征，结果如图14所示，结果表明该实验操作下未形成聚合物结构，这可能是由于原料中没添加DSPE‑PEG2000的缘故，无法开展下一步实验(分散体系的DTPM分子不能通过DSPE—PEG2000—Mal的马来酸酐基团接枝生物活性多肽，因此不满足细胞膜靶向染色实验的要求)。

[0095] 对比例2

[0096] 一种结合多肽的纳米纤维，制备步骤如下：

[0097] (1)将DTPM分子、DSPE‑PEG2000‑Mal和DSPE‑PEG2000的THF溶液混合，得到混合液，在混合液中，DTPM、DSPE‑PEG2000‑Mal、DSPE‑PEG2000浓度分别为5mg/mL，15mg/mL和20mg/mL；

[0098] (2)将步骤(1)所述混合液置于旋蒸瓶中旋干(除去THF)，所述混合物与超纯水的质量体积比为0.5mg/mL，超声震荡2.5min，得到分散液；

[0099] (3)利用滤头规格为220nm的滤头过滤技术，对纳米纤维进行过滤，取滤液(标记为第一次滤液)；然后利用超滤管(滤过分子量为0‑5000)离心过滤技术，参数设为6000rpm/15min，对所述第一次滤液进行过滤，得到纳米纤维；所得纳米纤维长度分布为1.54±0.86μm，宽度范围为18±5nm；将所述纳米纤维重悬在水中，得到纳米纤维分散液(1mg/mL)；

[0100] (4)将生物活性多肽加入上述制备的纳米纤维分散液中，得到混合液，在所述混合液中，生物活性多肽浓度为30mg/mL；其中生物活性多肽为氨基端连接有巯基的柔性链生物活性多肽；所述柔性链生物活性多肽(标记为多肽1)的序列如SEQ ID NO.1所示，为Lys‑Arg‑Trp‑Trp‑Lys‑Trp‑Trp‑Arg‑Arg，所述柔性链生物活性多肽的氨基端连接有聚乙二醇，聚乙二醇的重复单元个数为20，但聚乙二醇没有连接半胱氨酸(Cys)，半胱氨酸个数为0，也没有连接巯基(‑SH)；

[0101] (5)对步骤(4)所述混合液进行搅拌反应(时间为0.5h)，之后采用超滤管(滤过分子量为0‑5000)离心过滤技术，对其过滤，过滤实验参数为6000rpm/10min；取滤渣，得到所述靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针，所述靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针的长度分布为1.46±1.33μm，宽度范围为18±4nm。

[0102] 利用透射电子显微镜对靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针进行形貌观察，结果如图15所示，由图15可知该对比例中所制备的材料为纤维状的纳米结构。利用紫外分光光度计测定其光稳定性优异。利用所制备的AIE纳米纤维，对HeLa细胞进行荧光标记，AIE纳米纤维浓度为10μg/mL，反应5min后，利用激光共聚焦显微镜进行观察。结果如图16所示，可以发现，该对比例中所制备的纳米纤维未实现对细胞膜的靶向染色，在共聚焦下不能观察到荧光，这是因为多肽链上没有与纳米纤维反应接枝的基团，所以多肽未接枝到纳米纤维上，所以不存在对细胞膜的靶向性。

[0103] 对比例3

[0104] 一种纤维探针的制备方法，包括如下步骤：

[0105] (1)将DTPM分子、DSPE‑PEG2000‑Mal和DSPE‑PEG2000的THF溶液混合，得到混合液，在混合液中，DTPM、DSPE‑PEG2000‑Mal、DSPE‑PEG2000浓度分别为1mg/mL，1mg/mL和1mg/mL；

[0106] (2)将步骤(1)所述混合液置于旋蒸瓶中旋干(除去THF)，所述混合物与超纯水的质量体积比为0.6mg/mL，超声震荡(3min)，得到分散液；

[0107] (3)利用滤头规格为450nm的滤头过滤技术，对纳米纤维进行过滤，取滤液(标记为第一次滤液)；然后利用超滤管(滤过分子量为0‑10000)离心过滤技术，参数设为8000rpm/15min，对所述第一次滤液进行过滤取滤渣，得到纳米纤维；所得纳米纤维长度分布为2.71±1.52μm，宽度范围为27±15nm；将所述纳米纤维重悬在水中，得到纳米纤维分散液(2mg/mL)；

[0108] (4)该实施例不接枝生物活性多肽。

[0109] 利用透射电子显微镜对靶向染色细胞膜的AIE纳米纤维探针进行形貌观察，结果如图17所示，由图17可知该对比例中所制备的材料为纤维状的纳米结构。利用紫外分光光度计测定其光稳定性优异。利用所制备的AIE纳米纤维，对HeLa细胞进行荧光标记，AIE纳米纤维浓度为10μg/mL，反应5min后，利用激光共聚焦显微镜进行观察。结果如图18所示，可以发现，该对比例中所制备的纳米纤维未实现对细胞膜的靶向染色，在共聚焦下不能观察到荧光，这是因为AIE纳米纤维缺少表面的靶向性多肽，所以不能在细胞膜位置发生聚集发光。

[0110] 以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。