一株高耐酸粟酒裂殖酵母及在酱香型白酒酿造中的应用

摘要

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种耐酸性能强、产乙醇能力强的粟酒裂殖酵母及其应用。具体为粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)Sujiu.065，该菌株是从酱香型酒醅中分离筛选获得的，保藏编号CGMCC No.21792。该菌株耐酸性能优良，在非胁迫条件下与工业酿酒酵母产酒能力相当。在模拟酱香型白酒液态发酵以及固态发酵培养基的高酸环境下，具有突出的产酒优势，并且有助于提高四甲基吡嗪的产生。本发明能够为解决酱香型白酒生产中酒醅酸度大、酵母发酵力不足而造成的原料利用率低、生产掉排、生产成本高等问题提供帮助。

权利要求

1.一种粟酒裂殖酵母（ Schizosaccharomyces pombe ） ，其特征在于，具体为粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)Sujiu.065，保藏编号CGMCC No.21792。

2.权利要求1所述粟酒裂殖酵母Sujiu.065在白酒酿造中的应用。

3.权利要求1所述粟酒裂殖酵母Sujiu.065在乙醇生产中的应用。

说明书

一株高耐酸粟酒裂殖酵母及在酱香型白酒酿造中的应用

技术领域：

[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种耐酸性能强、产乙醇能力强的粟酒裂殖酵母及其应用。背景技术：

[0002] 酵母菌是乙醇类饮料发酵过程中的核心微生物，其生长与代谢能力强弱与出酒率高低高度相关。

[0003] 白酒固态发酵是多微共酵的过程，研究发现初始温度是驱动白酒发酵过程中微生物群落演替的关键因素之一。较高的环境温度能够促进乳酸菌的快速繁殖并代谢产生大量乙酸、乳酸，乙酸、乳酸等物质的大量累积显著地增加了酒醅酸度，使得窖池内的生态环境逐渐变成一个相对极端的环境。尤其在酱香型白酒生产中，乙酸含量能达到4‑6g/kg酒醅，乳酸为30 g/kg，酒醅pH最低为2。

[0004] 酸度增加严重影响酵母菌生长与代谢能力，造成生产“掉排”，企业蒙受巨大经济损失。据报道，在发酵过程中，发酵糟醅增加酸度1度，每100kg淀粉损失4.5kg，相当于降低出酒率3.68％(以60％vol酒计)。

[0005] 现有“降温控酸”工艺虽取得了一定效果，但消耗大量人力物力，增加了生产成本。高耐酸、产酒能力强酵母菌株的选育是解决这一问题的有效途径之一。
发明内容：

[0006] 为了解决上述技术问题，本发明是提供一种耐酸性能强、产酒能力好的粟酒裂殖酵母及其应用。

[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 一种耐酸性能强、产酒能力好的粟酒裂殖酵母，具体为粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)Sujiu.065，该菌株是从酱香型酒醅中分离筛选获得的，已于 2021年2月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.21792，分类命名：粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe。

[0009] 所述粟酒裂殖酵母Sujiu.065的26SrDNA具有序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

[0010] SEQ ID NO.1：

[0011] AGCGGAGGAAAAGAAAATAACCATGATTCCCTCARKWACGGCGAGTGAAGCGGGA AAAGCTCAAATTTGAAATCTGTCAACATTTCTTTTGTTGTCCGAGTTGTAATTTCAAGAA GCTGCTTTGAGTGTAGACGATCGGTCTAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCAGAGAGGGTG AGAACCCCGTCTTTGGTCGATTGGATATGCCATATAAAGCGCTTTCGAAGAGTCGAGTTG TTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAG ACCGATAGCGAACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTTA AATAGTACGTGAAATTGCTGAAAGGGAAGCATTGGAAATCAGTCTTACCTGGGTGAGAT CAGTAGTCTCTTCGCGAGACTATGCACTCTGAACCTGTGGTAGGTCAGCATCAGTTTTCG GGGGCGGAAAAAGAATAAGGGAAGGTGGCTTTCCGGGTTCTGCCTGGGGAGTGTTTAT AGCCCTTGTTGTAATACGTCCACTGGGGACTGAGGACTGCGGCTTCGTGCCAAGGA；

[0012] 所述粟酒裂殖酵母Sujiu.065在含有20g/L乙酸YPD培养基中培养34小时，其OD600值在0.7以上；在含有60g/L的乳酸YPD培养基中培养22小时，其OD600值在1.2以上。

[0013] 本发明还提供所述粟酒裂殖酵母Sujiu.065在白酒酿造中的应用。

[0014] 进一步地，采用粟酒裂殖酵母Sujiu.065进行酱香型白酒液态发酵。

[0015] 进一步地，采用粟酒裂殖酵母Sujiu.065进行酱香型白酒固态发酵。

[0016] 所述粟酒裂殖酵母Sujiu.065在6g/L乙酸和30g/L乳酸同时存在的液态高粱汁培养基中发酵中酒度达到7.24±0.23％vol，对照菌株酿酒酵母AY12酒度为1.53±0.13％vol、商业粟酒裂殖酵母ATCC16979为1.59±0.16％vol；

[0017] 所述粟酒裂殖酵母Sujiu.065在模拟酱香型白酒固态发酵中乙醇含量为47.41±2.72g/kg 酒醅，对照菌株酿酒酵母AY12产乙醇含量为41.53±1.24g/kg、商业粟酒裂殖酵母 ATCC16979产乙醇含量为41.8±1.41g/kg，不接菌的对照组产乙醇含量为41.5±0.6g/kg。

[0018] 所述粟酒裂殖酵母Sujiu.065在模拟酱香型白酒固态发酵中有助于提高四甲基吡嗪产量，为31.2±3.19mg/kg酒醅。

[0019] 有益效果：

[0020] 本发明从酱香型酒醅中分离出了一种耐酸性能优良粟酒裂殖酵母，在非胁迫条件下与工业酿酒酵母产酒能力相当。在模拟酱香型白酒液态发酵以及固态发酵培养基的高酸环境下，具有突出的产酒优势，并且有助于提高四甲基吡嗪的产生。本发明能够为解决酱香型白酒生产中酒醅酸度大、酵母发酵力不足而造成的原料利用率低、生产掉排、生产成本高等问题提供帮助。该菌株具有很强的应用价值，有助于改善传统的白酒生产，促进白酒生产的产量与产值的提高，产生较大的经济效益。附图说明：

[0021] 图1是无胁迫下模拟白酒液态发酵菌株CO2及乙醇产量图；

[0022] A‑酒度；B‑CO2产量。

[0023] 图2是6g/L乙酸和30g/L乳酸同时酸胁迫下模拟白酒液态发酵菌株CO2及乙醇产量图；

[0024] A‑酒度；B‑CO2产量。

[0025] 图3是酸胁迫下模拟白酒固态发酵菌株乙醇产量图。

[0026] 图4是酸胁迫下模拟白酒固态发酵菌株淀粉余量图。

[0027] 图5是酸胁迫下模拟白酒固态发酵菌株四甲基吡嗪产量图。

[0028] 图6是粟酒裂殖酵母Sujiu.065系统进化树。

[0029] 图7是本发明提供的粟酒裂殖酵母在无胁迫以及不同浓度乙酸下的生长状况。

[0030] 图8是本发明提供的粟酒裂殖酵母在不同浓度乳酸下的生长状况。

[0031] 上述附图中SP.65即为本发明粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)Sujiu.065。具体实施方式：

[0032] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0033] 实施例1酒醅中耐酸、高产乙醇酵母的筛选

[0034] (1)菌种来源：酱香型白酒第六与第七轮次酒醅。

[0035] (2)培养基：

[0036] 富集培养基：以麦芽汁培养基作为富集培养基，麦芽粉碎过120目筛，按照麦芽：水＝1:4 的比例加入水，于65℃液化、糖化处理1h。过滤去残渣，然后煮沸1h，并于40min时按照0.4‰的比例添加酒花，煮沸结束后离心取上清做灭菌处理，灭菌后加入100mg/L氯霉素；

[0037] WL固态培养基：称取WL固态培养基78.25g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min后加入氯霉素使终浓度达到100mg/L，备用。

[0038] YPD液态培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，115℃灭菌20min后使用。

[0039] (3)筛选方法：

[0040] 菌株富集及涂布：

[0041] 称取10g酒醅加入到100mL富集培养基在30℃条件下静置培养48h，取100μL富集培养液采用梯度稀释法涂布于WL固态培养基，30℃培养4‑5天，挑取长势良好的菌落，采用三区划线对各菌落纯化两次，最终得到纯化后菌株共计158株，甘油管保存，备用。

[0042] 初筛：

[0043] 采用杜氏小管发酵法对以上获得菌株的起酵及产乙醇能力进行初步分析，具体操作如下：将以上获得菌株与工业酿酒酵母AY12分别接种于液体YPD培养基中，180r/min、30℃培养24 h后,将菌液转接入5mL新鲜YPD液体培养基中活化至对数中期。调整各菌株对数期菌液OD 值在1.0‑1.2之间，取各菌液100μL分别接种至装有杜氏小管的YPD培养基中，30℃静置培养，监测产气情况，具体判定标准见表1。并用液相色谱检测各菌株葡萄糖消耗量及乙醇产生量。最终获得能够产气且产乙醇的菌株34株。

[0044] 表1产气能力评价标准

[0045]

[0046] 复筛：

[0047] 在初筛结果的基础上选择产气且能产生乙醇的菌株共34株，在含有60g/L乳酸的YPD液体培养基条件下进行杜氏小管发酵实验，继续观察产气以及产乙醇性能，每个菌株设定3个平行。共筛选获得27株在60g/L乳酸下仍能产乙醇的菌株，其中编码65的菌株乙醇产量相对较高，发酵速度更快，18h就能使杜氏小管充满气体，如表2所示。

[0048] 表2杜氏小管发酵‑60g/L乳酸(观察周期为36h)

[0049]

[0050]

[0051] 实施例2分子生物学鉴定

[0052] 对分离到的编码65的菌株进行26SrDNA鉴定。所选通用引物为：

[0053] NL1(5'‑GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG‑3')；

[0054] NL4(5'‑GGTCCGTGTTTCAAGACGG‑3')。

[0055] 扩增片段长度约为600bp。目的片段送金唯智测序，测序结果与GenBank中所登录的26S rDNA序列(MK749861.1，MK749858.1，MK749856.1，KY296084.1等)进行比对分析，同源性达到99.49％(见图6)。通过形态特征和26S rDNA序列分析，确定菌株编码65的菌株为粟酒裂殖酵母，即为本发明的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)Sujiu.065，保藏编号CGMCC No.21792。

[0056] 实施例3模拟白酒液态发酵

[0057] 分别以粟酒裂殖酵母Sujiu.065、酿酒酵母AY12、商业粟酒裂殖酵母ATCC16979为发酵菌株。

[0058] (1)高粱水解液制备：

[0059] 以优质高粱为原料，要求通过20目孔筛，按照高粱粉与水按1:3(w/v)混合，添加耐高温α‑淀粉酶(10U/g原料)90℃水浴作用1h，然后继续加热煮沸30min，之后补水至原体积，立即降温到60℃。糖化：以250U/g原料的比例添加糖化酶，在60℃糖化作用4h。糖化完成后降温到40℃，添加酸性蛋白酶(30U/g原料)水浴作用4h。冷却至室温并使用4层纱布过滤获得清液，将糖度分别调整至8°Bx、12°Bx、16°Bx，备用。

[0060] (2)种子培养基与液态发酵培养基制备：

[0061] 种子培养基制备：8°Bx和12°Bx水解液中各加入0.5％的酵母浸粉分别作为一级种子培养基和二级种子培养基，121℃高温灭菌20min，备用。

[0062] 无胁迫模拟液态培养基：16°Bx水解液中添加硫酸铵6g/L、硫酸镁1.2g/L、磷酸氢二钾 2.4g/L作为无胁迫模拟培养基，121℃高温灭菌20min，备用。

[0063] 加酸胁迫模拟液态培养基：无胁迫模拟液态培养基中同时加入乙酸和乳酸，终浓度分别为6g/L、30g/L(该浓度根据文献报道的酱香型白酒酒醅中乙酸、乳酸含量设定)。

[0064] (3)发酵方法

[0065] 一级种子培养：从固体培养基上刮一环酵母菌体至装有一级种子培养基的试管中，装液量10mL/30mL，30℃静止培养24h；

[0066] 二级种子培养：将一级种子液按照10％的比例接种至二级种子培养基，装液量100mL/250 mL，30℃静置培养16h，得到酵母二级种子液。

[0067] 发酵接种：酵母二级种子液按照1×107CFU/mL的接种量接种到液态发酵培养基，装液量为150mL/250mL，30℃条件下静置培养1‑6d。每隔12h称重1次，当两次失重小于0.3g，发酵结束。发酵结束后取100mL醪液，加100mL水，蒸出100mL酒样，测定酒精度。

[0068] 无胁迫下，结果如图1所示，两株粟酒裂殖酵母均在48h完成发酵，酿酒酵母AY12发酵速度略显优势，36h即完成发酵，最终产酒度在6.7～7之间，无显著差异。在酸胁迫下，结果如图2，在经过108h发酵后，本发明提供的粟酒裂殖酵母Sujiu.065酒度为7.24±0.23％vol，对照菌株酿酒酵母AY12酒度为1.53±0.13％vol、商业粟酒裂殖酵母ATCC16979为1.59± 0.16％vol，粟酒裂殖酵母Sujiu.065表现出显著优势。

[0069] 实施例4模拟酱香型白酒固态发酵

[0070] 分别以粟酒裂殖酵母Sujiu.065、酿酒酵母AY12、商业粟酒裂殖酵母ATCC16979为发酵菌株，以不接菌为对照。

[0071] (1)物料清蒸：以优质高粱为原料，粉碎度要求通过20目孔筛占70‑75％。高粱粉用相当于原料60％的60‑70℃水拌匀，堆积润料18‑20小时。润好的物料拌入相当于高粱粉量20％的稻壳(已清蒸过的)，拌匀后蒸料，圆汽后蒸1小时。

[0072] (2)配料发酵：

[0073] 基础配料：蒸熟的物料冷却至30℃左右，按照250U/g高粱粉的比例加入糖化酶，备用；

[0074] 按照酒糟7％的比例在酒糟中加入高温大曲，按酒糟2％的比例接入酵母种子液(17
×10 CFU/mL)，备用。

[0075] 按1：5的比例在基础配料中拌入接有酵母种子液的酒糟，装入发酵坛并用水密封，30℃发酵30d。发酵结束后取100g酒醅，加300mL水，蒸出100mL酒样。

[0076] 测定乙醇含量及残淀粉结果如图3和图4所示。本发明提供的粟酒裂殖酵母Sujiu.065在模拟酱香型白酒固态发酵中每kg酒醅中乙醇含量可以达到47.41±2.72g，对照菌株酿酒酵母 AY12发酵酒醅乙醇为41.53±1.24g/kg、商业粟酒裂殖酵母ATCC16979为41.8±1.41g/kg，不接菌为41.5±0.6g/kg，接种Sujiu.065的酒醅比接种工业酿酒酵母AY12、商业粟酒裂殖酵母ATCC16979以及不接种酵母菌的酒醅高出约6个百分点。工业酿酒酵母AY12、商业粟酒裂殖酵母ATCC16979与不接种酵母菌产乙醇量和残淀粉含量相似，说明这两株在模拟酱香型白酒固态发酵中受到抑制，未能起到提升酒度的作用。

[0077] 测定产品中(蒸出的100mL酒样)的四甲基吡嗪含量，测定方法为：气相色谱仪：Agilent 7890C；色谱柱：白酒专用柱，AT.LZP‑930，230℃，50m×320μm×1μm；检测器：FID检测器，检测器温度：200℃；载气：高纯氮，流速5mL/min；检测条件：程序升温，50℃保持8min，
5℃/min升到120℃,保持8min；进样口温度：200℃；进样量：1.0μL；分流方式：分流，分流比为10：1。

[0078] 如图5所示，结果发现，本发明提供的粟酒裂殖酵母中还有助于四甲基吡嗪的产生，含量为31.2±1.24mg/kg酒醅。

[0079] 实施例5耐乙酸性能评价

[0080] YPD液态培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，115℃灭菌20min 后使用。

[0081] 乙酸胁迫培养基:在YPD液体培养基添加乙酸，终浓度分别为4g/L，8g/L，12g/L，16g/L， 18g/L，20g/L。

[0082] 胁迫实验以Sujiu.065为研究对象，粟酒裂殖酵母商业菌株ATCC16979作为对照菌株。胁迫实验前首先考察在无胁迫处理下两菌株的生长情况，即在YPD液体培养基中生长情况。

[0083] 在固体培养基分别取一环粟酒裂殖酵母接种于装有5mLYPD液态培养基中，于30℃， 180r/min摇床培养至稳定期。以10％的接种量接种至新鲜的YPD液体培养基(30℃，180 7
r/min)，培养至对数中后期(活菌数约为1x10CFU/mL)再以3％的接种量转接至无胁迫培养基及乙酸胁迫培养基并使用全自动生长曲线仪(芬兰Bioscreen C)测定菌株的生长趋势(30℃，静置培养)。

[0084] 结果如图7所示，无胁迫培养时两株菌均在12h进入稳定期，生长OD600值在1.6左右，生长状态差异小。乙酸胁迫下，本发明提供的粟酒裂殖酵母在20g/L乙酸存在的YPD培养基中培养34h，生长OD值在0.72以上。对照菌株ATCC16979在4g/L乙酸处理下即停止生长。

[0085] 实施例6耐乳酸性能评价

[0086] 乳酸胁迫培养基:在YPD液体培养基添加乳酸，终浓度分别为20g/L，40g/L，60g/L， 80g/L。

[0087] 以Sujiu.065为研究对象，粟酒裂殖酵母商业菌株ATCC16979作为对照菌株。在固体培养基取一环粟酒裂殖酵母接种于装有5mLYPD液态培养基中，于30℃，180r/min摇床培养至稳定期。以10％的接种量接种至新鲜的YPD液体培养基(30℃，180r/min)，培养至对数7
中后期(活菌数约为1x10CFU/mL)再以3％的接种量转接至乳酸胁迫培养基(30℃，静置培养)并使用全自动生长曲线仪(芬兰Bioscreen C)测定菌株的生长趋势。所述结果如图8 所示，本发明提供的粟酒裂殖酵母在60g/L乳酸存在的YPD培养基中培养24h，生长OD600值在
1.24左右。对照菌株ATCC16979在此浓度下培养24h，生长OD600值为0.65。

[0088] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。