一种根际奇顿杆菌及其分离方法和应用

摘要

本发明提供了一种根际奇顿杆菌(Chthonobacter rhizosphaerae)及其分离方法和应用，该细菌的微生物学分类命名为根际奇顿杆菌yh7‑1，拉丁文学名：Chthonobacter sp.yh7‑1，已于2020年5月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.1.17236。本发明从土壤中分离得到的根际奇顿杆菌yh7‑1菌株，可用于发酵制备生物香料。所述生物香料，加入到卷烟烟丝中能使卷烟具有特殊香气，可降低刺激性，增加细腻感，使烟气柔和圆润，适合卷烟加香。

权利要求

1.一种根际奇顿杆菌(Chthonobactersp.)yh7‑1，其特征在于，所述菌株yh7‑1的保藏编号为CGMCC No.1.17236。

2.一种权利要求1所述的根际奇顿杆菌yh7‑1的应用，其特征在于，利用所述的根际奇顿杆菌yh7‑1发酵制备生物香料，具体方法包括如下步骤：将根际奇顿杆菌yh7‑1扩大培养后接种于发酵培养基中，28℃下摇瓶培养6天，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，浓缩后所得澄清红棕色液体，即为生物香料。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将根际奇顿杆菌yh7‑1经过试管斜面培养和种子培养后接种于发酵培养基中。

说明书

一种根际奇顿杆菌及其分离方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有产香功能的微生物根际奇顿杆菌及其分离方法和应用。

背景技术

[0002] 烟用香精香料是卷烟产品的"灵魂"，是卷烟制品形成风格特色的奥秘所在。合理的加香加料可以完善产品风格、改善烟气口感和余味、减轻刺激、柔和细腻烟气、增加香味、
掩盖杂气。烟用香精香料是卷烟生产不可缺少的原料，其配方也是烟草工业企业的核心技
术之一，香精香料及添加剂的应用同卷烟品牌的树立与发展密切相关。

[0003] 目前，烟用香精香料主要是通过各种分离手段直接从烟草和其它植物中提取或采用化学方法合成。然而，这两种方法都有其自身局限性，天然植物香料受原料来源的限制，
化学合成香料香气单一，与烟气协调性较差，且受合成方法及条件的制约。微生物在发酵过
程中可以产生很多如酯类、酸类和羧基化合物等香味物质，利用微生物发酵得到风格独特
的香料受到越来越多研究人员的关注。

[0004] 为了解决以上问题，提出本发明。

发明内容

[0005] 本专利利用从土壤中分离得到的根际奇顿杆菌yh7‑1菌株，发酵制备生物香料，并应用于卷烟烟丝中，提升香气丰富性，效果显著优于传统提取香原料。

[0006] *除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

[0007] 本发明第一方面涉及一种具有产香功能的微生物根际奇顿杆菌yh7‑1，其是从云南哀牢山柑橘园采集柑橘根际土壤样品中分离得到的，对其进行了形态学、生理生化性质
和16S rDNA分析，鉴定结果表明其属于根际奇顿杆菌，微生物学分类命名为根际奇顿杆菌
yh7‑1，拉丁文学名：Chthonobacter sp.yh7‑1，已于2020年5月27日在中国微生物菌种保藏
管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No.1.17236，地址：北京
市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。

[0008] 本发明分离得到的根际奇顿杆菌yh7‑1菌株的主要形态特征和生理生化性质特征为：在大多数培养基上生长良好，在R2A琼脂培养基上，菌落边缘不规则，中间凸起，呈黄色。
纤维素酶、氧化酶、过氧化氢酶呈阳性；吐温20，40，60和80、淀粉水解、酪蛋白水解呈阴性。
能利用乙酸、D‑阿拉伯醇、D‑纤维二糖、D‑果糖、L‑果糖、D‑半乳糖、α‑D‑葡萄糖、D‑葡萄糖‑
6‑磷酸、D‑甘露醇、果胶、L‑丙氨酸、L‑精氨酸、D‑天冬氨酸、L‑天冬氨酸。细胞膜的极性脂成
分主要包括磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺，细胞的呼吸醌为泛醌‑10(Q‑10)。本
发明所分离得到的根际奇顿杆菌yh7‑1的16S rDNA基因核苷酸序列如序列表所示，该序列
已递交国际核苷酸序列数据库(GenBank)，序列检索号：MG209703。

[0009] 本发明第二方面涉及一种分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的根际奇顿杆菌yh7‑1的方法，包括以下步骤：

[0010] a、从自然环境中取土壤样品，加无菌水，摇床振荡，加无菌水继续稀释并涂布于R2A平板培养基上进行培养，挑选单菌落，纯化，得到分离的微生物菌液，加入甘油、置于冰
箱中备用；

[0011] b、将步骤a分离的微生物菌液接种到R2A液体培养基中，摇床振荡，培养至菌液浓度为光密度OD＝2.0，制得种子液；

[0012] c、将步骤b制得的种子液接种在R2A液体培养基中，摇床振荡，筛选产生香气的微生物，构建系统发育树进行分子鉴别。

[0013] 上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的根际奇顿杆菌yh7‑1的方法，步骤a中的土壤样品取自云南哀牢山柑橘园柑橘根际土壤样品。

[0014] 上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的根际奇顿杆菌yh7‑1的方法，步骤a中R2A平板培养基的组成如下：每1000mL双蒸水(ddH2O)中葡萄糖0.5g,酵母膏0.5g,蛋白
胨0.5g,酸水解酪蛋白0.5g,可溶性淀粉0.5g,丙酮酸钠0.3g,磷酸氢二钾0.3g,硫酸镁
0.05g,R2A平板培养基的pH值为7.2。在温度为121℃下高压灭菌20min，待冷却至50‑60℃
时，倒制平板。

[0015] 上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的根际奇顿杆菌yh7‑1的方法，步骤‑1 ‑2
a中摇床振荡温度为30℃，振荡速度180rpm，振荡时间30min，用无菌水稀释至10 、10 、10
‑3 ‑4 ‑5
、10 、10 倍，在R2A平板培养基上的培养温度为28℃，培养时间为72h，甘油的加入量为分
离的微生物菌液体积的20％，冰箱温度为‑80℃。

[0016] 上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的根际奇顿杆菌yh7‑1的方法，步骤b和c中R2A液体培养基的组成如下：每950ml双蒸水(ddH2O)中加入葡萄糖0.5g,酵母膏
0.5g,蛋白胨0.5g,酸水解酪蛋白0.5g,可溶性淀粉0.5g,丙酮酸钠0.3g,磷酸氢二钾0.3g,
硫酸镁0.05g,再定容至1000mL，在温度为121℃下高压灭菌20min。R2A液体培养基的pH值为
7.2。

[0017] 上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的根际奇顿杆菌yh7‑1的方法，步骤b中摇床振荡温度为30℃，振荡速度160rpm；步骤c中摇床振荡温度为28℃，振荡速度
160rpm，振荡时间3‑5天。

[0018] 本发明第三方面涉及一种权利要求1所述的根际奇顿杆菌yh7‑1的应用，利用所述的根际奇顿杆菌yh7‑1发酵制备生物香料，具体方法包括如下步骤：

[0019] 将根际奇顿杆菌yh7‑1扩大培养后接种于发酵培养基中，28℃下摇瓶培养6天，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，浓缩后所得澄清红棕色液体，即为生物香料。

[0020] 优选地，将根际奇顿杆菌yh7‑1经过试管斜面培养和种子培养后接种于发酵培养基中。

[0021] (1)试管斜面培养

[0022] 采用斜面保藏培养基，培养基为R2A琼脂培养基，培养基的配方为：葡萄糖0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾
0.3g，硫酸镁0.05g，琼脂15g，蒸馏水定容到500mL，pH7.0。

[0023] (2)种子培养

[0024] 采用种子培养基，种子培养基的配方为：糊精120g，大豆粉40g，酵母膏2g，色氨酸0.5g，β‑丙氨酸5g，硫酸镁0.5g，磷酸铵0.2g，蒸馏水定容到500mL，pH7.0。

[0025] (3)发酵培养

[0026] 取5L发酵培养基，培养基的配方为：大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化钠2.5g；碳酸钙2g；蒸馏水500mL，pH7.0。

[0027] 本发明具有以下有益效果：

[0028] (1)本发明首次从从云南哀牢山柑橘园采集柑橘根际土壤样品中分离得到新的具有产香功能的试验菌种yh7‑1，经形态学、生理生化性质和16S rRNA测序分析表明该菌株是
一种新的细菌，微生物学分类命名为根际奇顿杆菌Chthonobacter sp.yh7‑1；

[0029] (2)本发明从土壤中分离得到的根际奇顿杆菌yh7‑1，其发酵提取物可以制备成生物香料，加入到卷烟烟丝中能使卷烟具有特殊香气，进行卷烟抽吸时，能使烟香丰富性增
加，降低刺激性，增加细腻感，使烟气柔和圆润，适合卷烟加香。

附图说明

[0030] 图1为本发明根际奇顿杆菌yh7‑1在R2A琼脂培养基上的电镜照片；

[0031] 图2为本发明根际奇顿杆菌yh7‑1及部分相关菌株依据16S rDNA基因序列构建的系统发育树。

具体实施方式

[0032] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不
用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼
此之间未构成冲突就可以相互组合。

[0033] 实施例1

[0034] 1.根际奇顿杆菌yh7‑1的分离、培养与鉴定

[0035] 1.1根际奇顿杆菌yh7‑1的分离

[0036] 从云南哀牢山柑橘园采集柑橘根际土壤样品，塑料袋密封带回，4℃保存待用。准确称取20g土样，加入100mL无菌水，30℃、240rpm摇床震荡40min；用无菌水将浓度稀释至
‑1 ‑2 ‑3 ‑4
10 、10 、10 、10 倍，将4个浓度的菌液分别取0.2mL涂布于R2A平板培养基上，每个浓度的
菌液设置3个平行试验，28℃下培养72h，从每份土样的平板上挑取不同单菌落，在R2A平板
培养基上纯化后按菌液体积20％加入甘油、置于‑80℃冰箱保存备用。

[0037] 将分离得到的微生物分别接种于R2A液体培养基中，30℃、180rpm摇床振荡培养，培养至菌液浓度为OD＝2.0，作为种子液备用。将每一个待测菌株的种子液按1％接种在筛
选培养基(R2A液体培养基)中，于30℃、180rpm摇床振荡培养3‑5天，每天观察发酵液外观和
香气变化情况，筛选得到能够产生香气的微生物，编号yh7‑1。

[0038] 1.2根际奇顿杆菌yh7‑1的鉴定

[0039] 对分离纯化的菌株yh7‑1进行形态学、生理生化性质和16S rDNA分析，鉴定结果表明属于根际奇顿杆菌，其微生物学分类命名为根际奇顿杆菌(拉丁文学名：Chthonobacter 
sp.yh7‑1)。

[0040] 根际奇顿杆菌yh7‑1在R2A培养基上的电镜照片如附图1所示。

[0041] 根际奇顿杆菌yh7‑1在大多数培养基上生长良好，在R2A琼脂培养基上，菌落边缘不规则，中间凸起，呈黄色。纤维素酶、氧化酶、过氧化氢酶呈阳性；吐温20，40，60和80、淀粉
水解、酪蛋白水解呈阴性。能利用乙酸、D‑阿拉伯醇、D‑纤维二糖、D‑果糖、L‑果糖、D‑半乳
糖、α‑D‑葡萄糖、D‑葡萄糖‑6‑磷酸、D‑甘露醇、果胶、L‑丙氨酸、L‑精氨酸、D‑天冬氨酸、L‑天
冬氨酸。细胞膜的极性脂成分主要包括磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺，细胞的呼
吸醌为泛醌‑10(Q‑10)。

[0042] 根际奇顿杆菌yh7‑1的生理生化特征如表1所示：

[0043] 表1根际奇顿杆菌yh7‑1的生理生化特征

[0044]实验 生长反应 实验 生长反应
Voges–Proskauert反应 +      + 吐温20,40,60,和80 ‑      ‑
淀粉水解 ‑      ‑ 纤维素上生长 +      +
纤维素水解 +      + 碱性磷酸酶 +      +
酪蛋白水解 ‑      ‑ 半胱氨酸芳胺酶 +      +

[0045] 注：“+”表示结果为阳性，“‑”表示结果为阴性

[0046] 根际奇顿杆菌yh7‑1的碳氮利用情况如表2所示：

[0047] 表2根际奇顿杆菌yh7‑1的碳氮源利用情况

[0048]

[0049]

[0050] 注：“+”表示结果为阳性，“‑”表示结果为阴性

[0051] 根际奇顿杆菌yh7‑1的16S rDNA部分序列如附图说明所示，该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的16S rDNA基因序列，构建
系统发育树，见附图2。经比较分析发现，本发明的根际奇顿杆菌yh7‑1与菌株
T
(Chthonobacter albigriseus KCTC 42450)亲缘关系最近，在系统进化树上形成独立的
分枝，综合形态、生理生化、细胞化学和系统进化分析等特征，两者又有明显差距，表明本发
明的根际奇顿杆菌yh7‑1是一个新物种，命名为Chthonobacter sp.。

[0052] 根际奇顿杆菌yh7‑1在GenBank数据库的16S rDNA基因核苷酸序列登录号为MG209703，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC 
No.1.17236。根际奇顿杆菌yh7‑1及相关种属的16S rDNA基因序列构建的系统发育树如附
图2所示。

[0053] 实施例2

[0054] 根际奇顿杆菌yh7‑1发酵液生物香料的制备

[0055] 1.根际奇顿杆菌yh7‑1(C.rhizosphaerae yh7‑1)的培养

[0056] (1)试管斜面培养

[0057] 采用斜面保藏培养基，培养基为R2A琼脂培养基，培养基的配方为：葡萄糖0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾
0.3g，硫酸镁0.05g，琼脂15g，蒸馏水定容到500mL，pH7.0。将培养基在130℃下灭菌30min，
摆成斜面，接种根际奇顿杆菌yh7‑1菌株，28℃下培养1周，获得试管菌种。

[0058] (2)种子培养

[0059] 采用种子培养基，种子培养基的配方为：糊精120g，大豆粉40g，酵母膏2g，色氨酸0.5g，β‑丙氨酸5g，硫酸镁0.5g，磷酸铵0.2g，蒸馏水定容到500mL，pH7.0。将培养基在130℃
下灭菌30min，从步骤(1)的试管斜面上挑取部分菌丝体接入种子液中，28℃摇瓶培养36h，
获得液体菌种。

[0060] (3)发酵培养

[0061] 取5L发酵培养基，培养基的配方为：大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化钠2.5g；碳酸钙2g；蒸馏水500mL，pH7.0。将培养基在130℃下灭菌30min，将步骤(2)中的液体
菌种按15％的接种量接到发酵培养基中，摇瓶培养6天，培养温度为28℃，得到发酵液。

[0062] 2.发酵液生物香料的制备和评价

[0063] (1)发酵提取液生物香料的制备

[0064] 将发酵液用3L乙酸乙酯进行萃取，连续萃取3次，合并萃取液，并于50℃、0.06MPa条件下进行减压浓缩，最后得到一种带香味的澄清红棕色液体，即为所需生物香料，其理化
指标如表3所示。

[0065] (2)发酵液生物香料的评价

[0066] 将发酵液生物香料用微量喷雾器按0.5‰的量均匀地喷加在烟丝上。对照组加入等量蒸馏水，将加香烟丝和对照烟丝卷制成烟支，放入恒温恒湿箱内，在湿度(60±2)％，温
度(22±2)℃条件下平衡24h后，由评吸专家组成的评吸小组进行感官评吸。如表4所示，与
对照卷烟相比，加香烟丝具有较为特殊的香气，说明该发酵液生物香料具有增加烟香、柔和
烟气，增加细腻性，降低刺激性，明显改善烟气质的作用，效果稳定而持久。

[0067] 表3根际奇顿杆菌yh7‑1发酵生物香料的理化指标

[0068]序号 检测项目 根际奇顿杆菌yh7‑1发酵生物香料
1 相对密度 1.4256
2 折光指数 1.3578
3 澄清度 澄清
4 挥发性成分总量(％) 37.6
5 乙醇中的溶混度(25℃) 不溶于水，可溶于60％‑95％乙醇溶液

[0069] 表4根际奇顿杆菌yh7‑1发酵生物香料的感官评吸表

[0070]

[0071]

[0072] 本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含
在本发明的保护范围之内。

[0073] 附序列表：

[0074] 根际奇顿杆菌yh7‑1的16S rDNA部分序列如下：

[0075] AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGCCCCGCAAGGGGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACCTACCTATTGCTGCGGAATAACTCAGGGAAACTTGAGCTAAT
ACCGCATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGCAATAGATGGGCCCGCGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAT
GGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTC
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CTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCA
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