一种砖红链霉菌A001及其应用

摘要

本发明涉及一种砖红链霉菌A001及其应用。本发明从土壤中分离得到的砖红链霉菌A001，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21851。该菌株发酵上清液和菌体的萃取物对秀丽隐杆线虫具有较好抗衰老方面作用，可用于辅助制备抗衰老的产品，从而应用于缓解衰老、延长寿命，具备良好的实际应用价值，为微生物源抗衰老产品的进一步研制和开发提供了优良的基础菌株。

权利要求

1.一种砖红链霉菌，其为Streptomyces lateritius，编号A001, 其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21851。

2.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的砖红链霉菌，其为Streptomyces lateritius，编号A001，保藏编号为CGMCC No.21851。

3.权利要求1所述的砖红链霉菌或权利要求2所述的菌剂在制备抗衰老的药物中的应用。

4.一种衰老抑制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的砖红链霉菌的发酵物。

5.根据权利要求4所述的衰老抑制剂，其特征在于，所述发酵物为将所述砖红链霉菌经发酵后得到的发酵液上清和/或菌体。

6.一种衰老抑制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的砖红链霉菌的发酵萃取物，所述发酵萃取物为将所述砖红链霉菌经发酵后得到的发酵液上清和/或菌体的有机溶剂萃取物。

7.根据权利要求6所述的衰老抑制剂，其特征在于，采用乙酸乙酯对所述发酵液上清进行萃取、经干燥和复溶后得到所述发酵萃取物，采取丙酮对所述菌体进行萃取，经干燥和复溶后得到所述发酵萃取物。

8.一种模式生物衰老抑制剂的制备方法，其特征在于，利用权利要求1所述的砖红链霉菌或权利要求4‑7任一项所述的衰老抑制剂进行制备。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，砖红链霉菌的培养条件为YIM38培养基， 

22‑34 ℃条件下震荡培养；所述YIM38培养基为葡萄糖 4 g /L，酵母浸粉 4 g/L，麦芽浸粉 

5 g/L， 维生素B 1 g/L，氯化钠 1 g/L，琼脂粉 20.0 g，pH 7.2。

说明书

一种砖红链霉菌A001及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体的涉及一种转红链霉菌在延长寿命和抗衰老中的应用。

背景技术

[0002] 衰老是所有活生物体共有的，由多因素引发的生物过程，其特征是宿主对应激反应的逐渐损害和关键代谢途径的普遍细胞退化。衰老与许多相关的有害生理效应，影响着
生物体的健康和整体功能。在人类和其他哺乳动物中，衰老能引发免疫功能的下降，对疾病
(癌症，糖尿病，心血管疾病和神经变性疾病)的易感性增加，慢性炎症增加，肌肉质量减少，
增加阿尔茨海默病和亨廷顿氏病等与年龄相关的退行性疾病发病率。

[0003] 微生物是重要的药物或保健品的来源，微生物可以直接产生微生物次级代谢产物，也可通过对其进行半合成、基因工程乃至合成生物学获得的有机小分子。抗生素作为重
要的微生物药物代表,开创了细菌感染的新世纪，在过去的一个世纪，微生物药物逐渐 形
成并得到发展，微生物药物已经涵盖了抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫、 抗肿瘤、免疫调
节、调节血脂与抗代谢综合征、抗衰老等疾病防治药物，对于 人类健康必不可少，并越来越
发挥更大的作用。微生物来源物质药物正处于孕育新的更大发展的培育期。

[0004] 本发明使用的寿命研究模式动物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)N2，是一种常见的小型土壤线虫，因其生命周期短，繁殖时间快，与人类的生化和基因通路上有很
大的同源性，而且其调控寿命的遗传及药理学机制均已明确，研究衰老及抗衰老机制，实质
上衰老机制的几大理论都是在线虫中被证明。因此，对线虫有抗衰老作用的药物通常也被
认为对人类也具有同样功效，因而被作为一种研究衰老常见的模式生物。

[0005] 放线菌是重要的活性成分产生源，而链霉菌属是其中主要的先导化合物产生类群。已有研究表明，砖红链霉菌的次级代谢产物丰富，在抗肿瘤、抗衰老等方面具有积极作
用，是一种重要的菌种资源。查阅相关资料可知，目前未见砖红链霉菌及代谢产物在抗衰老
方面的相关报道，将砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001作为抗衰老成分产生菌
进行应用具有重大的现实意义。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001及其应用。

[0007] 本发明提供一种砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001，该菌株于2021年3月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址:北京市朝
阳区北辰西 路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为砖红链霉菌
（Streptomyces lateritius），保藏编号为CGMCC No.21851。

[0008] 砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001的16SrDNA的核苷酸序列入SEQ ID NO.1所示。砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001的16SrRNA基因序列与砖红链霉菌 
（Streptomyces lateritius）的序列的相似性为99.6%。

[0009] 砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001为从土壤中分离得到的菌株。该菌株为革兰氏阳性菌，在YIM38固体培养基上生长良好，最适生长温度为29°C，最适生长pH 为
7.2。

[0010] 本发明提供一种菌剂，其含有砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001。

[0011] 以上含有砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001的菌剂可以作为液体菌剂或固体菌剂。

[0012] 以上含有的砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001菌剂可以采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。

[0013] 本发明还提供砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001或含有该菌株的菌剂在抗衰老中的应用。所述应用包括模式生物的应用，如秀丽线虫，也可能用于其他模式生
物，如鼠、兔、猴等模型生物。

[0014] 本发明还提供一种衰老抑制剂，其含有砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001的发酵物或发酵萃取物。

[0015] 所述发酵物为将所述砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001经发酵后得到的发酵上清和/或菌体。

[0016] 所述发酵萃取物为将所述砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001经发酵后得到的发酵上清和/或菌体的有机溶剂萃取物。

[0017] 以上所述的砖红链霉菌的发酵可在YIM38培养基中，pH7.2，29 ℃条件下震荡培养。

[0018] 作为本发明的一种实施方式，采用乙酸乙酯对发酵液上清进行萃取、经干燥和复溶后得到所述发酵萃取物，采用丙酮对菌体进行萃取，经干燥和复溶后得到所述发酵萃取
物。

[0019] 具体地，所述抑制剂可采用如下方法制备得到：

[0020] （1）挑选砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001的单菌接种到YIM38液体培养基（pH为7.2），在200rpm、29 ℃条件下振荡培养120h；

[0021] （2）将培养液在低温下离心后分别收集发酵上清液和菌体，发酵液用等体积的乙酸乙酯进行萃取，菌体用等体积的丙酮进行萃取，在35‑40℃条件下对萃取物进行旋转蒸发
浓缩，浓缩物复溶于二氯甲烷，得到发酵上清乙酸乙酯萃取物和菌体丙酮萃取物。

[0022] 本发明提供一种抗衰老的方法，其为所利用所述砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001萃取物。

[0023] 所述方法具体为：对秀丽隐杆线虫施用萃取物。

[0024] 本发明的有益效果在于：本发明从土壤中分离获得一株砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001，该菌株发酵上清液和菌体的萃取物对秀丽隐杆线虫具
有延缓衰老的作用，可用于辅助制备抗衰老的产品，从而应用于缓解衰老、延长寿命，具备
良好的实际应用价值，为抗衰老产品的进一步研制和开发提供了优良的基础菌株。

附图说明

[0025] 图1为本发明实施例1中砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001的菌落形态图。

[0026] 图2为本发明实施例1中砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001的菌丝形态。

[0027] 图3为本发明实施例4中砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001上清萃取物对秀丽隐杆线虫的毒理作用图。

[0028] 图4为本发明实施例4中砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001的菌丝提取物对秀丽隐杆线虫的毒理作用图。

[0029] 图5为本发明实施例4中砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001上清萃取物对秀丽隐杆线虫的抗衰老效果图。

[0030] 图6为本发明实施例4中砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001的菌丝提取物对秀丽隐杆线虫的抗衰老效果图。

具体实施方式

[0031] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0032] 以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0033] 以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业

[0034] 途径得到。

[0035] 以下实施例中使用的YIM38培养基的配方如下:葡萄糖(Glucose)4 g /L，酵母浸粉(Yeast extract)4 g/L，麦芽浸粉(Malt extract)5 g/L， 维生素B(B‑Vitamins)1 g/L，
氯化钠(Trace salt)1 g/L，琼脂粉(Agar) 20.0 g，pH 7.2。

[0036] 实施例1 砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001的分离与筛选

[0037] 1. 材料采集：沙土样品，采自中国北京密云区，混合装入灭菌自封袋，当日在常温条件下将样品送至实验室，4 ℃保存备用.

[0038] 2. 样品预处理：室温条件下风干土样20 d，过筛备用. 称取风干样品1g，研钵研磨后100 ℃处理1 h，在无菌条件下将处理土样放入 含1% Na4PO3 100 mL无菌蒸馏水中，摇
床振荡培养30 min后，再用超声波清洗仪处理40 s，土壤悬液用于分离菌种。

[0039] 3. 菌种的分离及纯化：取已处理土壤悬液梯度稀释，吸取原液以及10‑1稀释液至固体培养基表面(设立3个重复以及1个空白对照)，用无菌刮铲将悬液涂布均匀，待液体被
吸干，27 ℃倒置培养. 划线法纯化菌种。

[0040] 利用上述方法，通过筛选获得菌株编号为A001的砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）。

[0041] 实施例2 砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001的鉴定

[0042] 1. 形态与生理生化鉴定

[0043] 对实施例1筛选得到的菌株砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001在YIM38琼脂培养基上生长7天后，基内菌丝发育良好，无横隔，不断裂；气生菌丝生长良好、多分枝；
孢子丝直、柔曲，孢子圆形或卵圆形、光滑（图1），菌落形态见图2，这些特征与链霉菌一致。

[0044] 参照《放线菌快速鉴定与分离》和《Bergey’Manual  of  Systematic Bacteriology》Vol. II 的相关内容进行生理生化的鉴定，结果如表1所示。

[0045] 表1 菌株砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001的生理生化特征

[0046]

[0047] 2. 分子鉴定

[0048] 菌株砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001总DNA的提取采用 Chelex‑100法(周双清等， Chelex‑100 快速提取放线菌 DNA 作为 PCR 扩增模板，生物技术通 报，
2010，2:123‑125)。用无菌接种环从固体培养基上挑取适量菌体 于 1.5 mL 无菌的离心管
中，加入 5%的 Chelex100 溶液 50 μL，沸水 浴 15 min，冷却至室温后，12000 rpm 离心
5 min，取上清液作为 DNA 模版，‑20℃保存备用。16S rDNA 基因 PCR 扩增中所使用的引
物由 上海生工生物工程技术有限公司合成，其序列为：27f (SEQ ID NO.2): 5′‑
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3′;1492R(SEQ ID NO.3):5′‑ TACGGCTACCTTG TTACGACTT‑3′。PCR
反应体系共50 μL，包括 2 μL DNA 模板，25 μL 的 1×EasyTap PCR SuperMix 酶，27f 和
1492r 引 物各 1.5 μL，20 μL 灭菌水。反应程序见表 2。PCR 产物经 1.2%的琼脂糖凝胶
电泳检测后，送由上海生工生物工程技术有限公司进行序列测定，如SEQ ID NO.1所示。将
测得的基因序列登陆 EZBioCloud 数据库 (http:// http://www.ezbiocloud.net/)进行
16S rRNA 序列比对，得到序列相似性比对结果。

[0049] 表2 PCR 反应程序

[0050]

[0051] 分子鉴定结果表明，菌株 A001 鉴定为砖红链霉菌（Streptomyces lateritius），与砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）的同源性为99.6%。

[0052] 该菌株于2021年3月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西 路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编
100101)，分类命名为砖红链霉菌（Streptomyces lateritius），保藏编号为CGMCC 
No.21851。

[0053] 实施例3 砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001对秀丽隐杆线虫抗衰老制剂的制备

[0054] 挑选砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001的单菌落接种到 150 mL 的 YIM38 液体培养基中，在 200 rpm、28℃条 件下振荡培养 48 h。将培养液在 4 ℃、9500 
rpm 条件下离心 20 min 后分别收集发酵上清液和菌体。发酵上清液用等体积的乙酸乙酯
进行 萃取，菌体用等体积的丙酮进行萃取，接着用旋转蒸发仪(RE‑52AA， YARONG，中国)在 
38℃条件下对萃取物进行旋转蒸发浓缩，浓缩 物复溶于 1 mL 甲醇，分别得到菌株A001 
发酵上清乙酸乙酯萃取物以及菌体丙酮萃取物，‑20 ℃保存备用。

[0055] 实施例4 砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001上清和菌体萃取物对秀丽隐杆线虫安全性检测

[0056] 对线虫毒性的检测：用M9缓冲液调整大肠杆菌OP50、上清乙酸乙酯萃取物（图3）和菌体丙酮萃取物（图4）为不同浓度(0.08，0.4，2mg/mL)涂布在NGM平板培养基上。

[0057] 在20℃条件下，将线虫野生型N2同步化（方法是将20条成虫转移到包含大肠杆菌op50的6cm NGM培养板上，产卵2小时后，将成虫移走，留下同步化的卵）后培养3天，发育为
成虫后，挑入每孔包含200µL S medium液体培养基的48孔板中，培养基中含有适当浓度药
品，10天后统计线虫存活率。培养基中加入FUDR（400uM）, 用于抑制线虫产生后代。结果图3
和图4所示，对比相同浓度条件下的喂有大肠杆菌OP50和砖红链霉菌（Streptomyces 
lateritius）A001上清萃取物（图3）和菌体萃取物（图4）的线虫存活率保持在同一水平，可
认为砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001的两种萃取物的对线虫是安全的，并不
影响其正常的生命活动。

[0058] 表3 上清萃取物培养后秀丽隐杆线虫存活率统计

[0059]

[0060] 表4 菌体萃取物培养后秀丽隐杆线虫存活率统计

[0061]

[0062] 实施例5 对秀丽隐杆线虫寿命的延长作用

[0063] 1. 受试药物：

[0064] 上清及菌体萃取物，溶解于DMSO，配制成40mg/ml的储备液。

[0065] 阳性对照(雷帕霉素)，溶解于DMSO，配制成50mM的储备液。

[0066] 2. 实验方法：

[0067] 线虫培养在有OP50生长的NGM（nematode growth medium）固体培养基上，培养温度为20℃，湿度40‑60%在20℃条件下，将线虫野生型N2同步化(将20条成虫转移到包含大肠
杆菌op50的6cm NGM培养板上，产卵2小时后，将成虫移走，留下同步化的卵)后培养3天，发
育为成虫后，挑入每孔含80uL液体NGM 培养基的96孔板中，培养基中含有适当浓度的药物，
每孔2‑3条虫，每1‑2天统计线虫存活率。培养基中加入FUDR, 用于抑制线虫后代。溶剂对照
组给予1％DMSO、阳性对照组给予50μM雷帕霉素、实验组分别给予0.08、0.4mg/ml的上清或
菌液萃取物。给药至线虫死亡，每日记录其存活、死亡及丢失数目、得到各组平均寿命、并对
数据进行生存分析。

[0068] 3. 实验结果：

[0069] 各组间生存时间差异可见表5和6。

[0070] 表5 上清萃取物作用下秀丽隐杆线虫的寿命

[0071]

[0072] 表6 菌体萃取物作用下秀丽隐杆线虫的寿命

[0073]

[0074] 注：a)延长百分比计算公式为(处理组平均寿命‑溶剂对照组平均寿命)/溶剂对照组平均寿命×100％。

[0075] b)P值应用Kaplan‑Meier对数秩检验计算得出，*表示与溶剂对照组比较P＜0.05；**表示与溶剂对照组比较P＜0.01；

[0076] 表5、6的数据结合图5，图6示出，砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001上清和菌体萃取物使秀丽隐杆线虫衰老减缓，随着药物作用剂量的升高，线虫自然寿命显著
延长。

[0077] 本实施例的结果说明砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001上清和菌体萃取物可以延长秀丽隐杆线虫的自然寿命，且呈剂量依赖关系，提示砖红链霉菌
（Streptomyces lateritius）A001上清和菌体萃取物能够延缓衰老进程。

[0078] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因
此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范
围。