水稻粒长基因OsGF14b的基因工程应用转让专利
申请号 : CN202110685990.7
文献号 : CN113215174B
文献日 : 2022-04-22
发明人 : 黄骥 , 高秀莹 , 华子怡 , 袁凤至 , 李子昂 , 李见博 , 张红生
申请人 : 南京农业大学
摘要 :
本发明属于植物基因工程技术领域，公开了一个参与油菜素甾醇信号通路并调控水稻粒长的基因OsGF14b的克隆与应用。该基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1，OsGF14b参与水稻油菜素甾醇信号通路的调控，功能缺失突变体籽粒粒长变长，株高变矮，分蘖数增加，对外源BL激素的施加呈敏感表型，可用于水稻产量性状的遗传改良。
权利要求 :
1.cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示的水稻粒长基因OsGF14b在调控水稻粒型中的基因工程应用，其特征在于，抑制该基因的表达，能够增加水稻的粒长，和降低株高，和增加分蘖数。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的粒长基因OsGF14b编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制该基因的表达的方法为构建基因OsGF14b缺失型水稻。
说明书 :
水稻粒长基因OsGF14b的基因工程应用
技术领域
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及水稻粒长基因OsGF14b的粒型及油菜素内酯信号通路的基因工程应用。
背景技术
[0002] 水稻是我国重要的粮食作物，水稻产量和稻米品质一直是水稻育种的核心问题。水稻产量的决定因素包括单株有效穗数、每穗实粒数和粒重，粒重主要取决于粒型和充实
度。根据籽粒的三维结构将粒型构成划分为粒长、粒宽和粒厚(Gao Z Q et al,2011)。细长
粒稻米通常表现较好的外观品质，因此粒型也是影响稻米品质的重要因素。一般说来，水稻
粒型相关性状大多数是数量遗传性状，遗传机理复杂(Xing Y et al,2010)。加速水稻粒型
相关基因的克隆并解析水稻粒型的分子调控网络，可为水稻高产的实现、优质分子育种的
进行提供重要的理论基础和基因资源，从而提高粒型分子育种的效率。
度。根据籽粒的三维结构将粒型构成划分为粒长、粒宽和粒厚(Gao Z Q et al,2011)。细长
粒稻米通常表现较好的外观品质，因此粒型也是影响稻米品质的重要因素。一般说来，水稻
粒型相关性状大多数是数量遗传性状，遗传机理复杂(Xing Y et al,2010)。加速水稻粒型
相关基因的克隆并解析水稻粒型的分子调控网络，可为水稻高产的实现、优质分子育种的
进行提供重要的理论基础和基因资源，从而提高粒型分子育种的效率。
[0003] 目前认为，调控小穗颖壳细胞增殖、伸长和参与胚乳发育的基因是控制水稻籽粒粒长的主效基因，且通过G蛋白信号途径、MAPK(mitogen‑activated protein kinase)信号
途径、泛素‑蛋白酶体途径、转录因子途径、激素信号途径等多种途径对水稻粒长进行调控
(Azizi P et al,2019)。由α、β和γ3个亚基组成的异源三聚体G蛋白是真核生物中一类重
要的信号转导分子，在生长发育中起重要的调控作用(Gilman A G,1987)。GS3是第一个被
鉴定出来的水稻粒型QTL，通过与G蛋白β亚基的竞争性相互作用来减小粒长，是水稻粒长的
负调控因子(Mao H et al,2010)。RGA1(rice heterotrimeric G proteinαsubunit1，水稻
异源三聚体G蛋白α亚基)参与GA信号转导，由RGA1无效突变引起的水稻矮化突变体d1表现
为植株变矮，粒长变短，且对BR敏感性下降。此外，RGA1转录水平受BR调控，且表达量随外源
BR呈剂量依赖性的方式下降(Wang L et al,2006)。植物中的MAPK级联途径包括MAPKKK、
MAPKK和MAPK3种蛋白激酶，这些蛋白及其相关磷酸酶在蛋白磷酸化和去磷酸化的信号转导
中发挥核心作用(Claudia J et al,2002)。水稻小粒突变体smg1编码一种有丝裂原活化蛋
白激酶OsMKK4，smg1表现出和BR突变体植株类似的短粒表型，且与野生型相比，smg1突变体
中BR相关基因的表达水平显著降低，这表明MAPK信号途径与BR信号途径在功能上存在交叉
(Duan P et al,2014)。OsMAPK6是水稻粒长的正调控因子，能够与OsMKK4互作，通过调控细
胞增殖、参与BR信号转导和稳态调节在水稻的粒型中发挥着关键作用(Liu S,2015)。植物
生长发育的很多方面受泛素蛋白酶体介导的蛋白降解途径的调控(Attaix D et al,
2002)。GW2编码一个环型E3泛素连接酶，其缺失1‑bp的突变位点因提前出现终止密码子导
致基因功能缺失，促进了小穗颖壳细胞增殖，提高了粒宽、粒重和产量(Song X J et al,
2007)。TUD1编码一个功能性E3泛素连接酶，与D1直接互作且对D1具有上位性，共同介导BR
信号通路(Hu X et al,2017)。植物体内有许多不同的转录因子，与其它调控途径互相交叉
形成复杂的调控网络。OsGRF4与转录共激活因子OsGIF1/2/3相互作用(Li S et al,2016)。
过表达OsGIF1增加了水稻籽粒的大小和重量(He Z et al,2017)。此外，OsGRF4能够与在BR
信号中发挥作用的GSK2相互作用，GSK2可抑制OsGRF4的转录激活活性，进而抑制OsGRF4调
控水稻籽粒大小的功能(Che R et al,2015)。这说明不同的粒型调控通路之间是有关联
的。
途径、泛素‑蛋白酶体途径、转录因子途径、激素信号途径等多种途径对水稻粒长进行调控
(Azizi P et al,2019)。由α、β和γ3个亚基组成的异源三聚体G蛋白是真核生物中一类重
要的信号转导分子，在生长发育中起重要的调控作用(Gilman A G,1987)。GS3是第一个被
鉴定出来的水稻粒型QTL，通过与G蛋白β亚基的竞争性相互作用来减小粒长，是水稻粒长的
负调控因子(Mao H et al,2010)。RGA1(rice heterotrimeric G proteinαsubunit1，水稻
异源三聚体G蛋白α亚基)参与GA信号转导，由RGA1无效突变引起的水稻矮化突变体d1表现
为植株变矮，粒长变短，且对BR敏感性下降。此外，RGA1转录水平受BR调控，且表达量随外源
BR呈剂量依赖性的方式下降(Wang L et al,2006)。植物中的MAPK级联途径包括MAPKKK、
MAPKK和MAPK3种蛋白激酶，这些蛋白及其相关磷酸酶在蛋白磷酸化和去磷酸化的信号转导
中发挥核心作用(Claudia J et al,2002)。水稻小粒突变体smg1编码一种有丝裂原活化蛋
白激酶OsMKK4，smg1表现出和BR突变体植株类似的短粒表型，且与野生型相比，smg1突变体
中BR相关基因的表达水平显著降低，这表明MAPK信号途径与BR信号途径在功能上存在交叉
(Duan P et al,2014)。OsMAPK6是水稻粒长的正调控因子，能够与OsMKK4互作，通过调控细
胞增殖、参与BR信号转导和稳态调节在水稻的粒型中发挥着关键作用(Liu S,2015)。植物
生长发育的很多方面受泛素蛋白酶体介导的蛋白降解途径的调控(Attaix D et al,
2002)。GW2编码一个环型E3泛素连接酶，其缺失1‑bp的突变位点因提前出现终止密码子导
致基因功能缺失，促进了小穗颖壳细胞增殖，提高了粒宽、粒重和产量(Song X J et al,
2007)。TUD1编码一个功能性E3泛素连接酶，与D1直接互作且对D1具有上位性，共同介导BR
信号通路(Hu X et al,2017)。植物体内有许多不同的转录因子，与其它调控途径互相交叉
形成复杂的调控网络。OsGRF4与转录共激活因子OsGIF1/2/3相互作用(Li S et al,2016)。
过表达OsGIF1增加了水稻籽粒的大小和重量(He Z et al,2017)。此外，OsGRF4能够与在BR
信号中发挥作用的GSK2相互作用，GSK2可抑制OsGRF4的转录激活活性，进而抑制OsGRF4调
控水稻籽粒大小的功能(Che R et al,2015)。这说明不同的粒型调控通路之间是有关联
的。
[0004] 植物激素在植物生长发育的许多方面发挥着协调作用，如细胞分裂和伸长、器官的形成和发育、营养生长和生殖生长以及对胁迫反应等。在植物激素参与的水稻粒型调控
网络中，发挥主要作用的激素有油菜素内酯、生长素、细胞分裂素、赤霉素等。油菜素内酯
(brassinosteroids,BRs)是一种多羟基甾类植物激素，在植物生长发育过程中起着重要的
调节作用(Clouse SD,2011)。研究表明，BR通过促进有丝分裂相关基因CDC48和缩短细胞周
期的基因CYCD2的表达而调控水稻细胞的分裂(Zhang H L et al,2015)。BR缺失突变体
dwarf11和dwarf2粒型变小，说明BR促进籽粒的生长(Fang N et al,2016；Zhi et al,
2005；Tanabe S et al,2005；Wu Y et al,2015)。在BR信号通路中，BRs首先被膜定位受体
激酶BRI1和BRI1相关受体激酶BAK1感知，然后引发一连串级联反应，包括BRI1磷酸化BSK1，
促进BSK1与BSU1磷酸酶结合，而BSU1则通过去磷酸化一个保守的磷酸化酪氨酸残基来最终
导致BIN2失活，并激活两个转录因子BZR1和BZR2转录下游基因(Clouse SD,2011)。在水稻
中，OsBRI1或OsBAK1功能的缺失导致BR钝感表型和籽粒变小(Morinaka et al,2006；Yuan
et al,2017)，而过表达OsBZR1增加了粒长(Zhu et al,2015)。qGL3编码一个包含两个
Kelch结构域的蛋白磷酸酶(OsPPKL1)，其在拟南芥中的两个同源基因BSU1和BSL1可促进油
菜素内酯信号转导，它们通过去磷酸化和去激活BR信号下游的BIN2激酶来传递信号。因此，
qGL3可能通过去磷酸化OsGSK3直接参与油菜素内酯信号通路来负调控水稻粒长，而OsGSK3
通过将BR信号关键正调控因子磷酸化影响OsBZR1的核质分布(Gao X et al,2019)。在水稻
中有两个OsPPKL1同源基因，OsPPKL2和OsPPKL3，OsPPKL1和OsPPKL3抑制籽粒伸长，而
OsPPKL2促进籽粒生长(Zhang X et al,2012)。
网络中，发挥主要作用的激素有油菜素内酯、生长素、细胞分裂素、赤霉素等。油菜素内酯
(brassinosteroids,BRs)是一种多羟基甾类植物激素，在植物生长发育过程中起着重要的
调节作用(Clouse SD,2011)。研究表明，BR通过促进有丝分裂相关基因CDC48和缩短细胞周
期的基因CYCD2的表达而调控水稻细胞的分裂(Zhang H L et al,2015)。BR缺失突变体
dwarf11和dwarf2粒型变小，说明BR促进籽粒的生长(Fang N et al,2016；Zhi et al,
2005；Tanabe S et al,2005；Wu Y et al,2015)。在BR信号通路中，BRs首先被膜定位受体
激酶BRI1和BRI1相关受体激酶BAK1感知，然后引发一连串级联反应，包括BRI1磷酸化BSK1，
促进BSK1与BSU1磷酸酶结合，而BSU1则通过去磷酸化一个保守的磷酸化酪氨酸残基来最终
导致BIN2失活，并激活两个转录因子BZR1和BZR2转录下游基因(Clouse SD,2011)。在水稻
中，OsBRI1或OsBAK1功能的缺失导致BR钝感表型和籽粒变小(Morinaka et al,2006；Yuan
et al,2017)，而过表达OsBZR1增加了粒长(Zhu et al,2015)。qGL3编码一个包含两个
Kelch结构域的蛋白磷酸酶(OsPPKL1)，其在拟南芥中的两个同源基因BSU1和BSL1可促进油
菜素内酯信号转导，它们通过去磷酸化和去激活BR信号下游的BIN2激酶来传递信号。因此，
qGL3可能通过去磷酸化OsGSK3直接参与油菜素内酯信号通路来负调控水稻粒长，而OsGSK3
通过将BR信号关键正调控因子磷酸化影响OsBZR1的核质分布(Gao X et al,2019)。在水稻
中有两个OsPPKL1同源基因，OsPPKL2和OsPPKL3，OsPPKL1和OsPPKL3抑制籽粒伸长，而
OsPPKL2促进籽粒生长(Zhang X et al,2012)。
[0005] 实验室前期通过图位克隆的方法，克隆出调控水稻粒长的基因qGL3/OsPPKL1，其能通过BR信号途径负向调控水稻的粒型。为了深层次解析qGL3如何通过BR信号途径调控水
qgl3
稻籽粒大小，本实验室对m‑qgl3突变体和其野生型DJ以及NIL 和其背景9311的磷酸化蛋
白进行质谱分析，得到1477个磷酸化蛋白，其中OsGF14b是一个14‑3‑3蛋白，在m‑qgl3突变
qgl3
体和NIL 中相较于野生型都表现为下调表达，本实验室克隆了基因OsGF14b，并对
OsGF14b的功能和作用机制进行了进一步研究。
qgl3
稻籽粒大小，本实验室对m‑qgl3突变体和其野生型DJ以及NIL 和其背景9311的磷酸化蛋
白进行质谱分析，得到1477个磷酸化蛋白，其中OsGF14b是一个14‑3‑3蛋白，在m‑qgl3突变
qgl3
体和NIL 中相较于野生型都表现为下调表达，本实验室克隆了基因OsGF14b，并对
OsGF14b的功能和作用机制进行了进一步研究。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于公开一个参与油菜素内酯信号通路并且控制水稻籽粒粒长的基因OsGF14b的克隆与水稻产量性状的基因工程应用。OsGF14b参与水稻油菜素内酯信号通
路的调控，功能缺失突变体籽粒粒长变长，株高变矮，分蘖数增加，对外源BL激素的施加呈
敏感表型，可用于水稻产量性状的遗传改良。
路的调控，功能缺失突变体籽粒粒长变长，株高变矮，分蘖数增加，对外源BL激素的施加呈
敏感表型，可用于水稻产量性状的遗传改良。
[0007] cDNA序列如SEQ ID NO.1所示的水稻粒长基因OsGF14b在调控水稻粒型中的基因工程应用，抑制该基因的表达，能够增加水稻的粒长，和/或降低水稻的株高，和/或增加水
稻的分蘖数。
稻的分蘖数。
[0008] 进一步的，所述的粒长基因OsGF14b编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009] 进一步的，所述抑制该基因的表达的方法为构建基因OsGF14b缺失型水稻。
[0010] cDNA序列如SEQ ID NO.1所示的水稻粒长基因OsGF14b在调控油菜素内酯(BR)信号通路中的应用。
[0011] 本发明技术方案相对于现有技术具有以下有益效果：
[0012] 1、本发明公开了OsGF14b在调控水稻粒长，株高，分蘖数中的应用，并提供一种osgf14b突变体的粒型基因工程应用。该基因来自水稻(Oryza sativa L.)，在水稻细胞核
中与OsBZR1相互作用，缺失该基因可以增加水稻粒长，利于水稻粒型的遗传改良。
中与OsBZR1相互作用，缺失该基因可以增加水稻粒长，利于水稻粒型的遗传改良。
[0013] 2、本发明提供的OsGF14b基因参与水稻油菜素内酯信号通路的调控，BR敏感性分析表明，osgf14b转基因材料对外源BL激素敏感性增强。酵母双杂交实验、BiFC实验和co‑IP
实验表明OsGF14b与OsBZR1可以发生相互作用。
实验表明OsGF14b与OsBZR1可以发生相互作用。
[0014] 3、本发明中克隆出来的OsGF14b基因为水稻的高产优质育种提供了新资源，为丰富、完善水稻油菜素内酯信号网络提供了新思路。
附图说明
[0015] 图1.OsGF14b T‑DNA插入突变体osgf14b的表型
[0016] 图1A.osgf14b突变体与野生型株系的株型及粒型对比图；
[0017] 图1B.osgf14b突变体的株高统计图；
[0018] 图1C.osgf14b突变体的分蘖数统计图；
[0019] 图1D.osgf14b突变体的粒长统计图。
[0020] 图2.对osgf14b突变体进行验证
[0021] 图2A.osgf14b突变体的T‑DNA插入位点示意图；
[0022] 图2B.PCR技术检测osgf14b突变体示意图；
[0023] 图2C.osgf14b突变体内OsGF14b蛋白表达量示意图；
[0024] 图3.osgf14b突变体在BL处理下呈现敏感的表型
[0025] 图3A.BL处理前后osgf14b与野生型(DJ)叶夹角张开的表型图；
[0026] 图3B.BL处理前后osgf14b与野生型(DJ)胚芽鞘伸长的表型图；
[0027] 图3C.BL处理前后osgf14b与野生型(DJ)叶夹角张开角度的统计图；
[0028] 图3D.BL处理前后osgf14b与野生型(DJ)胚芽鞘伸长长度的统计图。
[0029] 图4.OsGF14b与OsBZR1在酵母细胞内可以相互作用。
[0030] 图5.OsGF14b与OsBZR1在烟草表皮细胞的细胞核内互作。
[0031] 图6.利用co‑IP技术检测OsGF14b与OsBZR1的互作示意图。
具体实施方式
[0032] 实施例1培育osgf14b基因敲除株系
[0033] 选用从韩国水稻突变体库购买东津(DJ)背景的T‑DNA插入型突变体osgf14b。实验前，所用种子在10％的次氯酸钠溶液中消毒5分钟，然后用纯水冲洗5次，每次30秒，尽量洗
净表面消毒液。将消毒好的种子浸泡在纯水中并放置于30℃条件下萌发两天，每天更换一
次纯水，在第二天后取出种子，冲洗干净，然后用保鲜膜密封进行催芽，催芽一晚上后可用
于播种。对于催芽后的种子，选择长势相同的种子，播种于96孔PCR板中或者播种于盆钵中
生长。在96孔PCR板中，幼苗在生长一周后加入Yoshida营养液；在盆钵中，加入营养土和蛭
石混合物，按照1：1混合。播种后，将种子放入人工气候培养箱中，培养箱温度设置为白天28
℃/夜晚24℃，光照时长设置为光照14h/黑暗10h。
净表面消毒液。将消毒好的种子浸泡在纯水中并放置于30℃条件下萌发两天，每天更换一
次纯水，在第二天后取出种子，冲洗干净，然后用保鲜膜密封进行催芽，催芽一晚上后可用
于播种。对于催芽后的种子，选择长势相同的种子，播种于96孔PCR板中或者播种于盆钵中
生长。在96孔PCR板中，幼苗在生长一周后加入Yoshida营养液；在盆钵中，加入营养土和蛭
石混合物，按照1：1混合。播种后，将种子放入人工气候培养箱中，培养箱温度设置为白天28
℃/夜晚24℃，光照时长设置为光照14h/黑暗10h。
[0034] 实施例2
[0035] 将分别经过阳性验证的实施例1培育的osgf14b基因敲除株系转基因植株和野生型DJ种植于南京农业大学牌楼基地，每个株系种两行，每行8株，常规土肥管理，用于成株期
农艺性状考察。待水稻黄熟后调查株高、分蘖数等性状。单株收种后45℃烘干3‑5d。对
osgf14b突变体和野生型DJ农艺性状进行调查和统计，结果表明(图1)，相比于DJ野生型，
osgf14b突变体的株高显著增加，分蘖数显著增加，粒长显著增加，说明OsGF14b参与水稻粒
长发育的正调控。
农艺性状考察。待水稻黄熟后调查株高、分蘖数等性状。单株收种后45℃烘干3‑5d。对
osgf14b突变体和野生型DJ农艺性状进行调查和统计，结果表明(图1)，相比于DJ野生型，
osgf14b突变体的株高显著增加，分蘖数显著增加，粒长显著增加，说明OsGF14b参与水稻粒
长发育的正调控。
[0036] 实施例3
[0037] 从韩国突变体库购买的DJ背景的T‑DNA插入型突变体osgf14b(图2)和野生型种子选取催芽后露白并长势一样的种子播种于96孔PCR平板中，待生长8天后，加入1μM的BL激素
并且对照中加入等量的乙醇溶剂，处理2‑3天后，统计各种材料的表型。选取催芽后露白并
长势一样的种子播种于3％的琼脂中，并向培养基中加入1μM的BL激素而对照中加入等量的
乙醇溶剂，黑暗条件下培养3天，统计材料的表型。
并且对照中加入等量的乙醇溶剂，处理2‑3天后，统计各种材料的表型。选取催芽后露白并
长势一样的种子播种于3％的琼脂中，并向培养基中加入1μM的BL激素而对照中加入等量的
乙醇溶剂，黑暗条件下培养3天，统计材料的表型。
[0038] 结果显示，osgf14b突变体在BL处理后，相较于DJ野生型，osgf14b突变体叶夹角增加的更加大(图3A，C)，这说明osgf14b突变体对外源BL激素更加敏感，且OsGF14b在BR信号
途径中起负调控作用；在外源BL激素处理后，osgf14b突变体的胚芽鞘相较于DJ野生型增长
的更加长(图3B，D)，这进一步说明osgf14b突变体对外源BL激素更加敏感，且OsGF14b在BR
信号途径中发挥负调控作用。
途径中起负调控作用；在外源BL激素处理后，osgf14b突变体的胚芽鞘相较于DJ野生型增长
的更加长(图3B，D)，这进一步说明osgf14b突变体对外源BL激素更加敏感，且OsGF14b在BR
信号途径中发挥负调控作用。
[0039] 实施例4
[0040] 将cDNA序列如SEQ ID NO.1所示的水稻粒长基因OsGF14b构建到pGADT7载体，并将OsBZR1(LOC_Os07g39220)构建到pGBKT7载体。
[0041] 根据SEQ ID NO.1所示水稻OsGF14b基因的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，上游引物OsGF14b‑AD‑F：5'‑GAGGCCAGTGAATTCATGTCGGCACAGGCG‑3′(SEQ ID NO.3)
包含入E coR1限 制性内 切酶位点 ，下游 引物OsG F14 b‑AD‑ R：5 '‑
GAGCTCGATGGATCCTTACTGCCCCTCGCT‑3′(SEQ ID NO.4)包含BamH1限制性内切酶位点。以SEQ
ID NO.1序列为模板，进行PCR扩增，所得产物使用Vazyme公司的CloneExpress试剂盒，进一
步克隆到pGADT7载体上，获得pGADT7‑OsGF14b。
包含入E coR1限 制性内 切酶位点 ，下游 引物OsG F14 b‑AD‑ R：5 '‑
GAGCTCGATGGATCCTTACTGCCCCTCGCT‑3′(SEQ ID NO.4)包含BamH1限制性内切酶位点。以SEQ
ID NO.1序列为模板，进行PCR扩增，所得产物使用Vazyme公司的CloneExpress试剂盒，进一
步克隆到pGADT7载体上，获得pGADT7‑OsGF14b。
[0042] 根据水稻OsBZR1基因的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，上游引物OsBZR1‑BD‑F：5'‑GGCCATGGAGGCCGAATTCATGACGTCCGGGGCGG‑3′(SEQ ID NO.5)包含入EcoR1
限制性内切酶位点，下游引物OsBZR1‑BD‑R：5'‑CCGCTGCAGGTCGACGGATCCTCATTTCGCGCCGA
CG‑3′(SEQ ID NO.6)包含BamH1限制性内切酶位点。以OsBZR1的序列为模板，进行PCR扩增，
所得产物使用Vazyme公司的CloneExpress试剂盒，进一步克隆到pGBKT7载体上，获得
pGBKT7‑OsBZR1。
限制性内切酶位点，下游引物OsBZR1‑BD‑R：5'‑CCGCTGCAGGTCGACGGATCCTCATTTCGCGCCGA
CG‑3′(SEQ ID NO.6)包含BamH1限制性内切酶位点。以OsBZR1的序列为模板，进行PCR扩增，
所得产物使用Vazyme公司的CloneExpress试剂盒，进一步克隆到pGBKT7载体上，获得
pGBKT7‑OsBZR1。
[0043] 将pGADT7空载、pGADT7‑OsGF14b和pGBKT7空载、pGBKT7‑OsBZR1两两组合，共转到酵母感受态中并涂板到缺少色氨酸和亮氨酸的培养基上，然后将生长的酵母在液体培养基
培养，分别在缺少色氨酸、亮氨酸的培养基和缺少色氨酸、亮氨酸、组氨酸和腺嘌呤的培养
基上生长。结果说明(图4)，OsGF14b和OsBZR1在酵母细胞内可以相互作用。
培养，分别在缺少色氨酸、亮氨酸的培养基和缺少色氨酸、亮氨酸、组氨酸和腺嘌呤的培养
基上生长。结果说明(图4)，OsGF14b和OsBZR1在酵母细胞内可以相互作用。
[0044] 使用双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)实验方法，将OsGF14b和OsBZR1分别连接到P2YC和P2YN载体上，根据SEQ ID NO.1所示水稻
OsGF14b基因的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，上游引物OsGF14b‑YC‑F：5'‑
GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGTCGGCACAGGCG‑3′(SEQ ID NO.7)包含入Xba1限制性内切酶位
点，下游引物OsGF14b‑YC‑R：5'‑GTACATCCCGGGAGCGGTACCCTGCCCCTCGCTGGA‑3′(SEQ ID
NO.8)包含Kpn1限制性内切酶位点。以SEQ ID NO.1序列为模板，进行PCR扩增，所得产物使
用Vazyme公司的CloneExpress试剂盒，进一步克隆到P2YC载体上，获得OsGF14b‑YC。
OsGF14b基因的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，上游引物OsGF14b‑YC‑F：5'‑
GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGTCGGCACAGGCG‑3′(SEQ ID NO.7)包含入Xba1限制性内切酶位
点，下游引物OsGF14b‑YC‑R：5'‑GTACATCCCGGGAGCGGTACCCTGCCCCTCGCTGGA‑3′(SEQ ID
NO.8)包含Kpn1限制性内切酶位点。以SEQ ID NO.1序列为模板，进行PCR扩增，所得产物使
用Vazyme公司的CloneExpress试剂盒，进一步克隆到P2YC载体上，获得OsGF14b‑YC。
[0045] 根据水稻OsBZR1基因的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，上游引物OsBZR1‑YN‑F：5'‑GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGACGTCCGGGGCGG‑3′(SEQ ID NO.9)包含入
Xba1限制性内切酶位点，下游引物OsBZR1‑YN‑R：5'‑GTACATCCCGGGAGCGGTACCTTTCGCGCCGA
CGCCG‑3′(SEQ ID NO.10)包含Kpn1限制性内切酶位点。以OsBZR1的序列为模板，进行PCR扩
增，所得产物使用Vazyme公司的CloneExpress试剂盒，进一步克隆到P2YN载体上，获得
OsBZR1‑YN。得到质粒OsGF14b‑YC和OsBZR1‑YN，并将载体同过热激转化到农杆菌EHA105中，
让其菌液侵染烟草表皮细胞，通过3天瞬时表达后，利用激光共聚焦显微镜观察烟草表皮细
胞的荧光，进一步研究OsGF14b与OsBZR1的相互作用关系。
Xba1限制性内切酶位点，下游引物OsBZR1‑YN‑R：5'‑GTACATCCCGGGAGCGGTACCTTTCGCGCCGA
CGCCG‑3′(SEQ ID NO.10)包含Kpn1限制性内切酶位点。以OsBZR1的序列为模板，进行PCR扩
增，所得产物使用Vazyme公司的CloneExpress试剂盒，进一步克隆到P2YN载体上，获得
OsBZR1‑YN。得到质粒OsGF14b‑YC和OsBZR1‑YN，并将载体同过热激转化到农杆菌EHA105中，
让其菌液侵染烟草表皮细胞，通过3天瞬时表达后，利用激光共聚焦显微镜观察烟草表皮细
胞的荧光，进一步研究OsGF14b与OsBZR1的相互作用关系。
[0046] 结果表明(图5)，OsGF14b与OsBZR1在烟草叶片表皮细胞的细胞核中可以相互作用。使用co‑IP实验方法，将OsGF14b和OsBZR1分别连接到pCAMBIA1300‑221‑Myc和
pCAMBIA1300s‑GFP载体上，根据水稻OsGF14b基因的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框
的引物，上游引物OsGF14b‑Myc‑F：5'‑AGGACTTGAATTCGGTACCCATGTCGGCACAGGCG‑3′(SEQ ID
NO .11)包含入Kpn1限制性内切酶位点，下游引物OsGF14b‑Myc‑R：5'‑
AGGCTACGTAGGATCCTTACTGCCCCTCGCT‑3′(SEQ ID NO.12)包含Kpn1限制性内切酶位点。以
SEQ ID NO.1序列为模板，进行PCR扩增，所得产物使用Vazyme公司的CloneExpress试剂盒，
进一步克隆到pCAMBIA1300‑221‑Myc载体上，获得Myc‑OsGF14b。
pCAMBIA1300s‑GFP载体上，根据水稻OsGF14b基因的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框
的引物，上游引物OsGF14b‑Myc‑F：5'‑AGGACTTGAATTCGGTACCCATGTCGGCACAGGCG‑3′(SEQ ID
NO .11)包含入Kpn1限制性内切酶位点，下游引物OsGF14b‑Myc‑R：5'‑
AGGCTACGTAGGATCCTTACTGCCCCTCGCT‑3′(SEQ ID NO.12)包含Kpn1限制性内切酶位点。以
SEQ ID NO.1序列为模板，进行PCR扩增，所得产物使用Vazyme公司的CloneExpress试剂盒，
进一步克隆到pCAMBIA1300‑221‑Myc载体上，获得Myc‑OsGF14b。
[0047] 根据水稻OsBZR1基因的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，上游引物OsBZR1‑GFP‑F：5'‑GCTTTCGCGAGCTCGGTACCATGACGTCCGGGGCGG‑3′(SEQ ID NO.13)包含入
Kpn1限制性内切酶位点，下游引物OsBZR1‑GFP‑R：5'‑CCCTTGCTCACCATGGTACCTTTCGCGCCGA
CGCCG‑3′(SEQ ID NO.14)包含Kpn1限制性内切酶位点。以OsBZR1的序列为模板，进行PCR扩
增，所得产物使用Vazyme公司的CloneExpress试剂盒，进一步克隆到pCAMBIA1300s‑GFP载
体上，获得OsBZR1‑GFP。得到质粒Myc‑OsGF14b和OsBZR1‑GFP，使用上述相同的方法，将转化
完成的农杆菌侵染烟草，3天黑暗培养后，提取烟草叶片的蛋白。使用琼脂糖凝胶交联的Myc
标签抗体珠子与提取的Myc‑OsGF14b蛋白在4℃条件下温和振荡孵育3小时，蛋白提取液配
方为：10mM Tris‑HCl,pH7.5,150mM NaCl,0.5mM EDTA,2mM DTT,0.5％NP‑40,protease
inhibitor cocktail(P9599；Sigma)。用Washing Buffer(10mM Tris‑HCl,pH 7.5,150mM
NaCl,0.5mM EDTA,2mM DTT,0.1％NP‑40)去除未结合的蛋白，加入1ⅹSDS loading buffer
制备样品。利用western blot技术，使用Myc和GFP抗体，检测免疫沉淀下来的蛋白，进一步
研究OsGF14b与OsBZR1的相互作用关系。结果说明(图6)，GFP‑OsBZR1可以被myc‑OsGF14b免
疫共沉淀，从而进一步说明OsGF14b与OsBZR1可以发生相互作用，从而证实OsGF14b通过与
OsBZR1相互作用，能够影响水稻的粒长。
Kpn1限制性内切酶位点，下游引物OsBZR1‑GFP‑R：5'‑CCCTTGCTCACCATGGTACCTTTCGCGCCGA
CGCCG‑3′(SEQ ID NO.14)包含Kpn1限制性内切酶位点。以OsBZR1的序列为模板，进行PCR扩
增，所得产物使用Vazyme公司的CloneExpress试剂盒，进一步克隆到pCAMBIA1300s‑GFP载
体上，获得OsBZR1‑GFP。得到质粒Myc‑OsGF14b和OsBZR1‑GFP，使用上述相同的方法，将转化
完成的农杆菌侵染烟草，3天黑暗培养后，提取烟草叶片的蛋白。使用琼脂糖凝胶交联的Myc
标签抗体珠子与提取的Myc‑OsGF14b蛋白在4℃条件下温和振荡孵育3小时，蛋白提取液配
方为：10mM Tris‑HCl,pH7.5,150mM NaCl,0.5mM EDTA,2mM DTT,0.5％NP‑40,protease
inhibitor cocktail(P9599；Sigma)。用Washing Buffer(10mM Tris‑HCl,pH 7.5,150mM
NaCl,0.5mM EDTA,2mM DTT,0.1％NP‑40)去除未结合的蛋白，加入1ⅹSDS loading buffer
制备样品。利用western blot技术，使用Myc和GFP抗体，检测免疫沉淀下来的蛋白，进一步
研究OsGF14b与OsBZR1的相互作用关系。结果说明(图6)，GFP‑OsBZR1可以被myc‑OsGF14b免
疫共沉淀，从而进一步说明OsGF14b与OsBZR1可以发生相互作用，从而证实OsGF14b通过与
OsBZR1相互作用，能够影响水稻的粒长。
[0048] Western Blot操作方式如下：
[0049] 1)电泳结束后，轻轻取下玻璃板，揭开上层玻璃板，切除多余凝胶，用直尺测量凝胶的长度及宽度，然后将其浸没于Transbuffer中平衡5min。
[0050] 2)根据凝胶的大小裁剪NC膜，使其略大于凝胶大小，然后将NC膜浸没于Transbuffer中平衡5min。
[0051] 3)取两张滤纸(Extra thick blot paper，Bio‑Rad)，置于转移缓冲液中，使其浸润。
[0052] 4)将润湿的滤纸置于Trans‑Blot SD Semi‑dry electrophoretic transfer cell(Bio‑Rad)阳极面板上，用玻璃棒按照一定方向赶走气泡；在滤纸上均匀加入少量转移
缓冲液，将NC膜平铺于滤纸上，确认NC膜与滤纸紧贴没有气泡；在NC膜上均匀加少量转移缓
冲液，将凝胶平铺于NC膜上，保证凝胶全部位于NC膜之内且NC膜与凝胶之间没有气泡；在凝
胶上均匀加入少量转移缓冲液，然后将湿润的滤纸平铺于凝胶上，均匀加入转移缓冲液并
用玻棒按一定方向赶走气泡，最后盖上阴极面板及Trans‑Blot SD Semi‑dry
electrophoretic transfer cell安全盖。
缓冲液，将NC膜平铺于滤纸上，确认NC膜与滤纸紧贴没有气泡；在NC膜上均匀加少量转移缓
冲液，将凝胶平铺于NC膜上，保证凝胶全部位于NC膜之内且NC膜与凝胶之间没有气泡；在凝
胶上均匀加入少量转移缓冲液，然后将湿润的滤纸平铺于凝胶上，均匀加入转移缓冲液并
用玻棒按一定方向赶走气泡，最后盖上阴极面板及Trans‑Blot SD Semi‑dry
electrophoretic transfer cell安全盖。
[0053] 5)正确连接转移电泳连线，设置稳压100V，转膜时间75min。
[0054] 6)转膜完成后，关闭电源，轻轻取出NC膜，将NC膜与凝胶的接触面朝上置于1×PBS中，振荡漂洗2次，每次5min。
[0055] 7)封闭：将膜置于封闭液中，室温温和振荡1h。
[0056] 8)封闭完成后，将膜转入一抗工作液中，室温温和振荡2h。
[0057] 9)将膜置于1×PBST中，振荡漂洗3次，每次10min。
[0058] 10)将膜置于二抗工作液中，室温温和振荡1h。二抗孵育完成后，将膜置于1×PBST中，振荡漂洗3次，每次10min。
[0059] 11)显影：使用Bio‑Rad ECL试剂盒中的A液与B液按1:1的比例混合，然后将混合液均匀加在NC膜表面，室温反应1～2分钟。
[0060] 12)反应完成后，除去NC膜上液体，利用天能成像仪进行曝光拍照。
[0061] 上述实施例表明本发明中克隆的水稻粒长基因OsGF14b，在调控水稻粒长、株高、分蘖数中的应用为首次公开。实施例2表明该基因与水稻的粒长发育密切相关，缺失该基因
能增加水稻粒长。实施例3表明该基因参与BR信号通路的调控，并起到负调控的作用。实施
例4表明OsGF14b可以和BR信号关键调控因子OsBZR1相互作用，进一步证明该基因与BR信号
调控有关。研究该基因可以进一步丰富BR信号网络，利用该基因可以在水稻粒长及BR调控
水稻发育中进行遗传改良。
能增加水稻粒长。实施例3表明该基因参与BR信号通路的调控，并起到负调控的作用。实施
例4表明OsGF14b可以和BR信号关键调控因子OsBZR1相互作用，进一步证明该基因与BR信号
调控有关。研究该基因可以进一步丰富BR信号网络，利用该基因可以在水稻粒长及BR调控
水稻发育中进行遗传改良。