一种真菌来源漆酶、其重组毕赤酵母工程菌及应用

摘要

本发明公开真菌来源的漆酶基因，涉及生物技术领域，漆酶基因为lac1，所述lac1的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示，或者lac1具有编码如SEQ.ID.NO.3所示氨基酸序列的碱基序列。本发明还提供携带上述漆酶基因表达载体的重组毕赤酵母工程菌株及其应用。本发明的有益效果在于：本发明异源表达了Trametes sp.中新鉴定的漆酶Lac1。本发明所获得的重组漆酶具有很好的热稳定性且具有良好的金属离子、有机溶剂及抑制剂耐受性，可催化靛蓝等染料脱色，在工业上具有很好的应用前景。

权利要求

1.真菌来源的漆酶基因，其特征在于：所述漆酶基因为lac1，所述lac1的cDNA序列如SEQ ID NO .2所示，或者所述lac1编码如SEQ.ID.NO .3所示氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的真菌来源的漆酶基因，其特征在于：所述lac1的全长序列如SEQ ID NO .1所示。

3.真菌来源的漆酶，其特征在于：所述漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO .3所示。

4.重组巴斯德毕赤酵母工程菌株，其特征在于：所述菌株携带如权利要求1所述真菌来源的漆酶基因的表达载体，所述菌株命名为Pichia pastoris‑lac1，保藏编号：CGMCC No .21875，保藏日期：2021年3月8日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国 .北京市朝阳区北辰西路。

5.一种构建重组巴斯德毕赤酵母工程菌株的方法，其特征在于：包括以下步骤：以pPIC9K质粒为载体，构建lac1‑pPIC9K表达载体，通过电转化将表达载体转入宿主毕赤酵母中，得到重组巴斯德毕赤酵母工程菌株；所述lcal为权利要求1真菌来源的漆酶基因。

6.采用权利要求4所述的重组巴斯德毕赤酵母工程菌株发酵获取重组漆酶的方法，其特征在于：将重组巴斯德毕赤酵母工程菌株培养后，收集菌体，用BMM培养基重悬菌体，然后加入0.5％‑1％甲醇、在20‑28℃诱导，200rpm振荡培养3‑10天，收集发酵上清液，获得重组漆酶。

7.根据权利要求6所述的重组巴斯德毕赤酵母工程菌株发酵获取重组漆酶的方法，其特征在于：加入1％甲醇、20℃诱导，200rpm振荡培养6天。

8.一种采用权利要求6或7所述的方法获得的重组漆酶。

9.一种采用权利要求6或7所述的方法获得的重组漆酶在降解靛蓝和活性蓝中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤：将染料溶液用去离子水溶解，加入重组漆酶酶液，室温放置。

说明书

一种真菌来源漆酶、其重组毕赤酵母工程菌及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种真菌来源漆酶、重组毕赤酵母工程菌及其应用。

背景技术

[0002] 漆酶(Laccase，苯二醇：氧氧化还原酶，EC 1.10.3.2)属于多铜氧化酶家族(MCO)，能够氧化酚类和非酚类化合物，以水作为唯一的产物。由于具有宽底物谱、催化氧化过程中不产生任何有毒有害的物质、“绿色环保”等优势，近年来真菌漆酶的研究受到各国科研工作者的广泛关注。

[0003] 真菌漆酶的作用底物超过200种，包括单体、二聚体、多酚类、氨基酚类、甲氧基苯酚类和金属复合物等。因此，真菌漆酶在工业上应用广泛，可用于染料脱色、造纸工业的生物漂白、检测酚类污染物生物传感器的研发、工业废水的处理等。

[0004] 研究表明，真菌漆酶的底物范围受到其氧化还原电势的影响。至今，筛选获得的真菌漆酶氧化还原电势主要在0.49‑0.70V。它们属于具有中/低氧化还原电势的真菌漆酶，其在催化具有高氧化还原电势的底物如染料脱色时，需要介体如ABTS、HBT等的参与。如公开号为CN109294936A的专利申请公开的漆酶需要在染料脱色过程中加入ABTS介体，而ABTS等价格昂贵，使用中会造成新的污染。因此，筛选具有高氧化还原电势(>0.7V)的真菌漆酶，对于降低真菌漆酶的应用成本异常关键。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种真菌来源的新漆酶、并将新漆酶的基因转入毕赤酵母中，构建毕赤酵母工程菌株，获得具有较高氧化还原电势、可在无介体条件下直接氧化染料脱色的重组漆酶，降低漆酶用于染料等脱色的成本。

[0006] 本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：

[0007] 真菌来源的漆酶基因，所述漆酶基因为lac1，所述lac1的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示，或者所述lac1具有编码如SEQ.ID.NO.3所示氨基酸序列的碱基序列。

[0008] 优选地，所述lac1的全长序列如SEQ ID NO.1所示。

[0009] 真菌来源的漆酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0010] SEQ ID NO.1中的DNA序列由2199个碱基组成，SEQ ID NO.2中的DNA序列由1551个碱基组成，SEQ ID NO.3由516个氨基酸组成，自N端第1‑21位为信号肽序列，成熟氨基酸为495个氨基酸。

[0011] 重组巴斯德毕赤酵母工程菌株，其携带真菌来源的漆酶基因表达载体，所述菌株的分类命名为Pichia pastoris‑lac1，保藏编号：CGMCC No.21875，保藏日期：2021年3月8日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国.北京市朝阳区北辰西路。

[0012] 有益效果：通过该重组毕赤酵母工程菌株发酵获得的重组漆酶，具有较高的比酶活、耐热性、氧化还原电势。对部分金属离子、有机溶剂、抑制剂具有一定的耐受性，在不加任何中间介体时能够有效降解靛蓝和活性蓝，与添加介体时的效果相近。本漆酶添加介质ABTS、HBT时能有效提高孔雀石绿的脱色率，为工业上提供了新的酶源。

[0013] 同时氧化还原电势高的漆酶氧化能力强，能氧化更多的底物，包括木制素单体等。

[0014] 重组毕赤酵母工程菌株的构建方法，包括以下步骤：以pPIC9K质粒为载体，构建lac1‑pPIC9K表达载体，通过电转化将表达载体转入宿主毕赤酵母中，得到重组毕赤酵母工程菌株。

[0015] 采用重组毕赤酵母工程菌株发酵获取重组漆酶的方法，包括以下步骤：将重组毕赤酵母工程菌株培养后，收集菌体，用BMM培养基重悬菌体，然后加入0.5％‑1％甲醇、在20‑28℃诱导，200rpm振荡培养5‑10天，收集发酵上清液，获得重组漆酶。

[0016] 有益效果：本发明实现了漆酶Lac1在毕赤酵母中异源表达，提高重组毕赤酵母菌在甲醇诱导发酵过程中的产酶效率，提高了重组毕赤酵母菌的工业应用能力。

[0017] 优选地，加入1％甲醇、20℃诱导，200rpm振荡培养6天。

[0018] 有益效果：对诱导条件进行优化，通过温度及甲醇浓度的优化，该诱导条件下，酶活力达到2061U/L，使诱导效果最佳，提高了重组菌株的产酶效率。

[0019] 优选地，将发酵液经过超滤、透析和Sepharose‑DEAE柱纯化，得到纯化后的重组漆酶。

[0020] 采用上述方法获得的重组漆酶。

[0021] 有益效果：重组漆酶以愈创木酚为底物，pH 4.0‑4.5范围内，重组漆酶rLac1较稳定。重组漆酶rLac1在40℃时较稳定，其半衰期达到82h，酶液在70℃水浴锅中孵育2h仍有酶2+ 2+ 2+ 2+
活。Mn 、Cu 和Zn 在5mM的浓度下对rLac1酶活力的抑制程度不超过10％；而Mg 在25mM的浓度下对rLac1的酶活力几乎没什么抑制。5％的乙醇对rLac1酶活的抑制程度仅为11.9％；
5％的DMSO对rLac1酶活的抑制程度为20.5％。在不加任何中间介体时能够有效降解靛蓝和活性蓝，在这两种染料的降解中具有很大的潜力。

[0022] 采用上述方法获得的重组漆酶在降解靛蓝和活性蓝中的应用。

[0023] 有益效果：在不加任何中间介体时能够有效降解靛蓝和活性蓝，在这两种染料的降解中具有很大的潜力并且与添加介体时效果相近。在添加中间介体时，能提高对孔雀石绿的脱色效果。

[0024] 优选地，所述降解方法包括以下步骤：将染料溶液用去离子水溶解，加入重组漆酶酶液，室温放置。

[0025] 本发明的优点在于：通过该重组毕赤酵母工程菌株发酵获得的重组漆酶，具有较高的耐热性。对部分金属离子、有机溶剂、抑制剂具有一定的耐受性，同时在不加任何中间介体时能够有效降解靛蓝和活性蓝，为工业上提供了新的酶源。

[0026] 本发明实现了漆酶Lac1在毕赤酵母中异源表达，提高重组毕赤酵母菌在甲醇诱导发酵过程中的产酶效率，提高了重组毕赤酵母菌的工业应用能力。

[0027] 本发明中的重组酶，具有较高的耐热性。对部分金属离子、有机溶剂、抑制剂具有一定的耐受性，同时在不加任何中间介体时能够有效降解靛蓝和活性蓝，为工业上提供了新的酶源。

[0028] 同时氧化还原电势高的漆酶氧化能力强，能氧化更多的底物，包括木制素单体等。

[0029] 本发明诱导毕赤酵母重组表达菌株时，对诱导条件进行了优化，通过温度及甲醇浓度的优化，使诱导效果最佳，提高了重组菌株的产酶效率。

附图说明

[0030] 图1为本发明实施例1中lac1的PCR扩增图；

[0031] 图2为本发明实施例2中lac1‑pPIC9K的双酶切验证图；

[0032] 图3为本发明实施例2中lac1‑pPIC9K的表达质粒图谱；

[0033] 图4为本发明实施例3中线性化lac1‑pPIC9K核酸电泳图；

[0034] 图5为本发明实施例3中含愈创木酚功能板BMM筛选His+转化子；

[0035] 图6为本发明实施例5中重组漆酶rLac1的SDS‑PAGE图；

[0036] 图7为本发明实施例5中重组漆酶rLac1的活性电泳图，愈创木酚染色；

[0037] 图8为本发明实施例6中重组漆酶pH稳定性测定结果图；

[0038] 图9为本发明实施例6中重组漆酶温度稳定性测定结果图；

[0039] 重组毕赤酵母工程菌株Pichia pastoris‑lac1，保藏编号：CGMCC No.21875，保藏日期：2021年3月8日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国.北京市朝阳区北辰西路。

具体实施方式

[0040] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0041] 下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

[0042] 实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

[0043] 1、菌株和载体

[0044] Trametes sp.AH28‑2在Wang J,Zhang Y,Xu Y,et al.Genome sequence of a laccase producing fungus Trametes sp.AH28‑2[J].Journal of Biotechnology,2015,216:167‑168.中公开，为公知公用材料；大肠杆菌Trans‑T1感受态购买自Transgen公司；巴斯德毕赤酵母(P.pastoris，GS115)菌株和pPIC9K载体为公知公用材料，均由本实验室保存。

[0045] 实施例1

[0046] 目的基因的克隆

[0047] 菌株Trametes sp.AH28‑2经过PDA平板活化，接种于100mL/250mL纤维二糖‑天冬酰胺液体培养基中28℃，120rpm培养4d，匀浆处理后接种于100mL/250mL纤维二糖‑天冬酰胺液体培养基中。培养3天后添加香草酸诱导，每隔12h取样，分离上清和菌体分别保存于4℃和‑80℃冰箱中备用。用液氮冷冻仪处理后，RNA的提取按照TaKaRa公司的RNAiso Plus试TM剂盒说明书来进行提取，cDNA的制备按照TaKaRa公司PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒的说明书要求来进行，得到漆酶基因模板。

[0048] 以制备的漆酶的cDNA第一链为模板，通过PCR扩增出漆酶lac1，扩增PCR图如图1。lac1的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示，lac1的全长序列如SEQ ID NO.1所示，漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。SEQ ID NO.1中的DNA序列由2199个碱基组成，SEQ ID NO.2中的DNA序列由1551个碱基组成，SEQ ID NO.3由516个氨基酸组成，自N端第1‑21位为信号肽序列，成熟氨基酸为495个氨基酸。

[0049] 引物：lac1‑F

[0050] GACCTACGTAGCGATCGGCCCAGTCACTGAGCT

[0051] lac1‑B

[0052] AAATATGCGGCCGCTTAAGGGTTGATGTGCATCGACTG

[0053] 表1 PCR扩增体系

[0054]

[0055] 实施例2

[0056] lac1‑pPIC9K表达载体的构建

[0057] 用限制性内切酶SnaB I和Not I对lac1以及载体pPIC9K进行双酶切。酶切体系如表2所示，水浴锅37℃反应30min，酶切产物使用纯化试剂盒回收。

[0058] 表2双酶切体系

[0059]

[0060] 将pPIC9K以及lac1双酶切产物按比例添加，16℃过夜连接。连接体系如表3所示。转化至Trans T1大肠杆菌感受态细胞中，以5’端酶切位点SnaB I，3’端酶切位点Not I，插入pPIC9K质粒载体启动子AOX1下游，构建lac1‑pPIC9K表达载体，表达载体图谱见图3，双酶切验证如图2，表达载体构建成功。

[0061] 表3连接体系

[0062]

[0063] 实施例3

[0064] 重组毕赤酵母的构建

[0065] 1、以限制性内切酶Stu I将重组表达质粒lac1‑pPIC9K单酶切线性化，线性化体系如表4所示，水浴锅37℃反应30min。核酸电泳检测线性化的质粒，见图4。通过电转化将线性化的质粒转入毕赤酵母GS115中，涂于MD板上获得转化子。

[0066] 表4 Stu I酶切体系

[0067]

[0068] 2、抽提酵母基因组，参照上海生工生物工程股份有限公司的产品酵母基因组DNA快速抽提试剂盒使用说明手册，编号B518227，基因组PCR图见图5。挑取MD板上克隆(共50个克隆)至BMGY平板上，28℃培养2d。再将BMGY上的克隆复制到含1mM愈创木酚的BMM平板上，28℃进行培养直至有显色圈出现，结果如图5所示。

[0069] 实施例4

[0070] 毕赤酵母重组菌的表达

[0071] 挑取单克隆，接种于5mL BMGY试管中，28℃、200rpm过夜培养。将BMGY中过夜培养物转接至50mL/250mL三角瓶BMGY液体培养基中，28℃、200rpm培养OD600＝2～6。4℃、3000rpm离心20min，收集菌体，去除上清，用BMM重悬菌体至OD600＝1.0，进行诱导表达。在
200mL/500mL三角瓶中BMM液体培养基中加入上述培养物，于28℃、200rpm摇床中进行培养。
2+
每24h，在含有1mM的Cu 的BMM培养基中加入终浓度为0.5％的甲醇来继续诱导。混匀，同时取出与加入甲醇的量相同体积的菌液，用于生长状态OD600以及漆酶酶活的测定。

[0072] 诱导表达条件的优化：1％甲醇诱导20℃，200rpm培养6天，酶活力达到2061U/L。

[0073] 实施例5

[0074] 重组漆酶的分离纯化

[0075] 重组漆酶的分离纯化步骤如下：发酵液在4℃、6,000r/min离心30min；收集上清液；上清液用浓缩仪浓缩至体积为40mL；浓缩液离心后将上清加入透析袋，并将透析袋放在浓度为20mM，pH为6.5的柠檬酸‑Na2HPO4缓冲液中，置于冷库过夜透析，每8h更换一次透析液，更换2次；高速离心透析后的粗酶液用0.22μm的滤膜去除上清的杂质和气泡，上样于Sepharose‑DEAE交换柱中，用2个柱体积的buffer A(pH 6.5，20mM柠檬酸‑Na2HPO4)缓冲液平衡；用buffer B(buffer A+0.3mol/L(NH4)2SO4)进行梯度洗脱，速率1.5mL/min，收集酶液。

[0076] 重组蛋白活性检测：利用ABTS为底物，30℃恒温水浴中反应3min，冰浴30s，在λ＝420nm波长下测反应液的光吸收值。

[0077] 纯化后的重组漆酶的SDS‑PAGE及Native‑PAGE比对见图6和图7。

[0078] 实施例6

[0079] 重组漆酶pH稳定性及温度稳定性的测定

[0080] 用不同pH酒石酸钠缓冲溶液(pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0)的缓冲液对酶液进行稀释，将其放在以愈创木酚为底物时最适温度下进行孵育，每隔一段时间取样，以愈创木酚为底物进行酶活的测定。以初始酶活为100％计算各个pH下不同时间点的剩余酶活。测酶体系同表5。结果如图8所示，在pH 4.0‑4.5范围内，重组漆酶rLac1较稳定，70℃放置1h仍有70％的酶活；而pH为3.0时，70℃放置1h就基本失活。

[0081] 用以愈创木酚为底物时最适pH的缓冲液对酶液进行稀释，将其放在不同温度(40℃、50℃、60℃、70℃)的水浴锅中孵育，每隔一段时间取样，以愈创木酚为底物进行酶活的测定。以初始酶活为100％计算各个温度下不同时间点的剩余酶活。测酶体系同表5。结果如图9所示，当温度为40℃时，重组漆酶rLac1较稳定，其半衰期达到82h；将酶放置70℃水浴锅中孵育2h仍有酶活。

[0082] 表5测酶体系

[0083]

[0084] 酒石酸钠缓冲溶液配制方法如下：

[0085] 称取7.16g十二水合磷酸氢二钠溶于去离子水中并定容至1L；称取4.2g柠檬酸溶于去离子水并定容至1L；两者在pH计测量下互调至所需pH。

[0086] 实施例7

[0087] 金属离子及抑制剂对重组漆酶rLac1酶活的影响

[0088] 以愈创木酚为底物，向测酶体系中加入不同的金属离子及抑制剂使其终浓度分别达到5mM、10mM、25mM。以不加金属离子及抑制剂测定的酶活为初始酶活，计算各种金属离子2+ 2+ 2+ 2+ 2+
及抑制剂对rLac1酶活的抑制程度。选择的金属离子和抑制剂有：Cu 、Fe 、Mn 、Zn 、Mg 、SDS、叠氮化钠(NaN3)。结果如表6所示，以愈创木酚为底物时测定的金属离子及抑制剂对
2+
rLac1的影响，叠氮化钠仅0.1mM就完全抑制了重组漆酶rLac1酶活；5mM的Fe 就能让rLac1
2+ 2+ 2+
几乎失活；5mM的SDS能抑制rLac1 50％的酶活力；Mn 、Cu 和Zn 在5mM的浓度下对rLac1酶
2+
活力的抑制程度不超过10％；而Mg 在25mM的浓度下对rLac1的酶活力几乎无抑制。

[0089] 表6金属离子及抑制剂对酶活的影响

[0090]

[0091] 实施例8

[0092] 有机溶剂对重组漆酶rLac1酶活的影响

[0093] 以愈创木酚为底物，向测酶体系中分别加入乙醇和DMSO其终浓度分别达到5mM、10mM、25mM，结果如表7所示。其中，5％的乙醇对rLac1酶活的抑制程度仅为11.9％；5％的DMSO对rLac1酶活的抑制程度为20.5％；而15％的乙醇和DMSO使rLac1酶活力损失一半。

[0094] 表7有机溶剂对rLac1酶活力的影响

[0095]

[0096] 实施例9

[0097] 重组漆酶rLac1氧化还原电势的测定

[0098] 探索重组漆酶rLac1氧化还原电势的大小：按照循环伏安法操作步骤测定漆酶氧化还原电势。rLac1的氧化还原电势0.73V，高于大多数真菌漆酶。

[0099] 实施例10

[0100] 重组漆酶底物特异性的测定

[0101] 选择不同芳香化合物(终浓度为1mM)，在测酶体系中加入酶液，反应24h后，使用酶标仪对反应前后的样品进行全波长扫描，扫描范围为250‑750nm。检测氧化时导致紫外光谱改变的底物。导致明显变化的酶底物组合标记为(+)，没有变化的标记为(‑)；(+)、(‑)分类不清楚的标记为(+/‑)。结果如表8所示。

[0102] 反应体系：980μL(柠檬酸‑磷酸氢二钠缓冲溶液，pH 4.0)+10μL(底物)+10μL(酶液)

[0103] 对照组：980μL(柠檬酸‑磷酸氢二钠缓冲溶液，pH 4.0)+10μL(底物)+10μL(灭活酶液)

[0104] rLac1的底物谱范围较广，能氧化大多数芳香化合物。

[0105] 表8 rLac1底物特异性的测定

[0106]

[0107]

[0108] 实施例11

[0109] 重组漆酶对染料降解作用

[0110] 探索重组漆酶rLac1在室温(25℃)对5种合成染料的脱色效果。本发明测定重组漆酶rLac1对合成染料的降解作用，合成染料包括：靛蓝(λ＝700nm,100mg/L)、结晶紫(λ＝594nm,100mg/L)、活性蓝(λ＝595nm,100mg/L)、孔雀绿(λ＝618nm,100mg/L)、甲基橙(λ＝
618nm,100mg/L)

[0111] 按照上述浓度配置染料溶液，使用去离子水溶解，不加介体的脱色反应体系为1mL，1mL的染料中加入60μL的酶液(200U/L)，每种染料设置一个对照组，对照组以灭活的酶液代替。加介体的脱色反应体系为1mL，1mL的染料中加入60μL的酶液(200U/L)，介体ABTS、HBT的浓度均为100μM，每种染料设置一个对照组，对照组以灭活的酶液代替。室温放置48h测定脱色效果。测定脱色前后染料在其最高吸收波长下的吸光值变化，计算脱色率，公式为：脱色率＝(A0‑A)/A0×100％，其中A0为染料溶液的初始吸光值，A为染料溶液经脱色反应后的吸光值，结果如表9、10所示。在不加任何中间介体时能够有效降解靛蓝和活性蓝，与添加介体时的效果相近。加入介体ABTS、HBT提高对孔雀石的脱色率。

[0112] 表9脱色率的实验

[0113]

[0114] 表10两种介体对染料脱色率对比结果

[0115]

[0116] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。