一种防治根腐病的药剂、制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种防治根腐病的药剂、制备方法及其应用，属于生物农药技术领域。所述的防治根腐病的药剂，包括以下原料组成：石菖蒲挥发油、艾叶挥发油。本发明制备的防治根腐病的药剂，属于植物源杀菌剂，易挥发，易降解，不污染环境，对人畜安全；挥发油是多种有效成分的混合物，对致病菌具有多靶标作用特效，致病菌不易产生抗药性，可长期使用。本发明石菖蒲挥发油和艾叶挥发油按比例混合与化学农药噁霉灵复配具有协同增效作用。本发明利用沸石吸附挥发油，能使挥发油缓慢长期释放，达到长期防治效果。本发明原料来源广泛，成本低廉，制备方法简单易行，可作为肥料添加剂或者农药使用，广泛应用于防治地下根腐病的发生。

权利要求

1.一种防治根腐病的药剂的应用，其特征在于，所述药剂包括以下原料组成：石菖蒲挥发油、艾叶挥发油，所述药剂的应用是采用沸石吸附药剂，然后按比例与土壤混合均匀后防治黄精根腐病。

2.根据权利要求1所述防治根腐病的药剂的应用，其特征在于，所述石菖蒲挥发油、艾叶挥发油是以石菖蒲和艾叶分别做为原料，采用水蒸气蒸馏法制备，然后以体积比为1:1混合而得。

3.根据权利要求1所述防治根腐病的药剂的应用，其特征在于，所述药剂还包括以下原料组成：溶剂和分散剂。

4.根据权利要求3所述防治根腐病的药剂的应用，其特征在于，所述溶剂为DMSO。

5.根据权利要求4所述防治根腐病的药剂的应用，其特征在于，所述DMSO的用量占石菖蒲挥发油和艾叶挥发油总质量的2％。

6.根据权利要求3所述防治根腐病的药剂的应用，其特征在于，所述分散剂为吐温。

7.根据权利要求6所述防治根腐病的药剂的应用，其特征在于，所述吐温的用量占石菖蒲挥发油和艾叶挥发油总质量的0.1％。

8.根据权利要求3‑7任一项所述防治根腐病的药剂的应用，其特征在于，所述药剂的制备方法，包括以下步骤：步骤一、将阴干的石菖蒲、艾叶分别切成0.5‑0.6cm长度的小段，分别加入10倍水浸泡2小时；放置于5L圆底烧瓶中，用水蒸气蒸馏法蒸馏6h，得到的水油混合物用无水硫酸钠干燥后即分别得到石菖蒲发油和艾叶挥发油；

步骤二：将步骤一制得的石菖蒲发油和艾叶挥发油混合后加入溶剂和分散剂，配置成

0.04mg/mL的溶液，制得防治根腐病的药剂。

9.根据权利要求8所述防治根腐病的药剂的应用，其特征在于，药剂与噁霉灵混合后再采用沸石吸附，然后按比例与土壤混合均匀后防治黄精根腐病。

说明书

一种防治根腐病的药剂、制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种防治根腐病的药剂、制备方法及其应用。

背景技术

[0002] 滇黄精(Polygonati kingianum Coll.et Hemsl.)是《中华人民共和国药典》记载的三个中药黄精基源植物之一，为重要药食两用资源，誉有“血气双补之王”之称。其在云南蕴藏量大，是黄精品种中产量及市场份额最大的，具有广泛的临床应用基础及良好的深入开发前景，为重要的“云药”品种。

[0003] 近年来，随着市场需求量的增加，人们对滇黄精研究的不断深入，滇黄精的应用领域不断拓展，人工栽培滇黄精已成为市场供应的主体。随着滇黄精栽种面积以及连作年限不断增加，导致病虫害问题日益突出，尤其是滇黄精根茎腐病，严重影响了滇黄精的产量和品质，已成为限制滇黄精产业发展的主要因素之一。真菌被认为是根腐病的最主要致病因素，其中镰刀菌(Fusarium spp.)所占比例最高，其寄生性和致病力也较强，是根腐病中危害性最大的病原菌。通过滇黄精根茎刺伤接种，确定滇黄精根茎腐病的致病菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和腐皮镰刀菌(Fusarium solani)，而尖孢镰刀菌致病力更强。

[0004] 目前，防治黄精根腐病的发生主要依靠施用化学农药，如大量使用噁霉灵。噁霉灵是新一代新型农药杀菌剂，内吸性杀菌剂、土壤消毒剂。化学名称：3‑羟基‑5‑甲基异恶唑；分子量：99；分子式：C4H5NO2。噁霉灵是广谱性杀菌剂，对多种病原真菌引起的植物病害有较高的防治结果。噁霉灵作为是一种内吸性杀菌剂和土壤消毒剂，具有独特的作用机理。噁霉灵进入土壤后被土壤吸收并与土壤中的铁、铝等无机金属盐离子结合，有效抑制孢子的萌发和病原真菌菌丝体的正常生长或直接杀灭病菌，药效可达两周。

[0005] 由于化学农药具有毒性大、残留期长、病原菌易产生抗性等，给黄精产业的可持续健康发展带来了潜在的威胁，故寻找植物源农药替代品是我们亟需解决的难题。植物源农药与化学合成农药相比，具有如下特点：1、大多数植物源农药对哺乳动物毒性较低，使用中对人畜比较安全；2、次生代谢产物是植物的内源物，是植物体的一部分，因此，易于在自然界的大循环中降解，不会对环境造成污染；3、许多植物源农药作用方式是非毒杀的，包括调节生长发育、引诱、驱避、拒食等，因而对非靶标生物，特别是鸟类、害虫天敌及有益微生物影响较小；4、植物在进化过程中所经受逆境压力的多样性和复杂性，导致所产生的次生代谢产物的多样性和复杂性，所以植物源农药通常作用方式多样，病原菌和害虫等不易产生抗药性。我国自主研发天然生物农药的基础还比较薄弱，品种匮乏，已有的植物源农药由于生产周期长、成本高等瓶颈问题，制约了其推广应用。

[0006] 石菖蒲气味芳香，可辟秽化浊，有解毒驱邪之功效，自古以来就是劳动人民预防疾病的常用良药。古人每到端午节就有用鲜石菖蒲、鲜艾叶挂在门窗上的习俗，作为预防瘟疫之用，这都是源于石菖蒲、艾叶具有芳香辟浊、解毒驱邪的功效。《神农本草经百种录》言：“香者气之正，正气盛则除邪辟秽也”。芳香药物借其清气之正，鼓舞人体正气，辟除秽浊邪气，从而达到养生防病的目的。近年来，芳香疗法，以萃取自植物的精油，通过吸嗅、按摩、熏蒸等各种方式使身体吸收，杀灭有害微生物，启动身体的自愈能力，在英国、法国、德国、日本，中国被推崇推广，是主流医学的补充和辅助疗法。“芳香”主要由挥发油起效，植物精油属于天然产物类化合物，是环境友好型产物。秽浊邪气于人、于植物一定程度上均多指环境中病原微生物，若此法于病人有效，则对于植物病原微生物防治也当奏效。若将此应用于农业，则可形成“芳香辟秽”理论指导下的中医农业，值得加以实践。

发明内容

[0007] 本发明提供了一种防治根腐病的药剂、制备方法及其应用，以解决目前黄精种植中大量使用化学农药造成黄精品质和影响产业可持续发展的重大问题。

[0008] 为了解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：

[0009] 一种防治根腐病的药剂，包括以下原料组成：石菖蒲挥发油、艾叶挥发油。

[0010] 进一步地，所述石菖蒲挥发油、艾叶挥发油是以石菖蒲和艾叶分别做为原料，采用水蒸气蒸馏法制备，然后以体积比为1∶1混合而得。

[0011] 进一步地，所述药剂还包括以下原料组成：溶剂和分散剂。

[0012] 进一步地，所述溶剂为DMSO。

[0013] 进一步地，所述DMSO的用量占石菖蒲挥发油和艾叶挥发油总质量的2％。

[0014] 进一步地，所述分散剂为吐温。

[0015] 进一步地，所述吐温的用量占石菖蒲挥发油和艾叶挥发油总质量的0.1％。

[0016] 本发明还提供一种防治根腐病的药剂的制备方法，包括以下步骤：

[0017] 步骤一、将阴干的石菖蒲、艾叶分别切成0.5‑0.6cm长度的小段，分别加入10倍水浸泡2小时；放置于5L圆底烧瓶中，用水蒸气蒸馏法蒸馏6h，得到的水油混合物用无水硫酸钠干燥后即分别得到石菖蒲发油和艾叶挥发油；

[0018] 步骤二：将步骤一制得的石菖蒲发油和艾叶挥发油混合后加入溶剂和分散剂，配置成0.04mg/mL的溶液，制得防治根腐病的药剂。

[0019] 本发明还提供药剂在防治黄精根腐病的应用，采用沸石吸附药剂，然后按比例与土壤混合均匀后防治黄精根腐病。

[0020] 本发明还提供药剂在防治黄精根腐病的另外一种应用，药剂与噁霉灵混合后再采用沸石吸附，然后按比例与土壤混合均匀后防治黄精根腐病。

[0021] 本发明的技术原理：

[0022] 1、石菖蒲和艾叶为传统常用中药，气芳香，芳香走窜，善于辟秽。挥发油由于都是由小分子物质组成，土壤里面易扩散。

[0023] 2、用沸石吸附挥发油之后，解决了挥发油易挥发、有效期短的问题，使挥发油有效期大大增加，达到持续抑制病害发生的目的。

[0024] 3、黄精根腐病发生多由于土壤通气性不良造成病害发病率激增，本发明采用沸石吸附挥发油，不但挥发油抑制病原菌生长，同时沸石还能够改良土壤结构，达到一举多得的效果。

[0025] 4、挥发油为中药提取物，且挥发油也是石菖蒲和艾叶的主要药效成分，临床常用药，对人体无害，解决了目前常用化学农药对人体肝肾毒性等威胁。

[0026] 5、石菖蒲和艾叶是临床用药的常用药对，为提高挥发油的有效性，本发明采用了体积比1∶1复配，大大提高了单独使用一种挥发油抑菌的有效性，有利于工厂化生产中成本的节约。

[0027] 6、挥发油易挥发，故本发明解决了化学农药残留降低黄精品质、威胁大健康产业发展的棘手问题。

[0028] 7、本发明提供了石菖蒲艾叶体积比1∶1混合液与化学农药噁霉灵联用产生协同作用的结果，同时石菖蒲和艾叶单独与噁霉灵联用也可产生加和作用，不影响化学农药的使用效果。故本发明为后期降低化学农药使用提供了理论基础和应用前提。

[0029] 本发明具有以下有益效果：

[0030] (1)本发明提供了用沸石吸附挥发油，使得挥发油能缓慢释放，提高挥发油药效期。

[0031] (2)本发明提供了石菖蒲与艾叶复配，提高了防治黄精根腐病效果。

[0032] (3)本发明用DMSO和吐温作为溶剂和分散剂联用溶解石菖蒲和艾叶挥发油，可增加乳化剂的稳定性，与水溶液更易互溶。

[0033] (4)石菖蒲和艾叶挥发油，属于生物农药，对环境友好。

[0034] (5)挥发油是多成分起效，病原菌不易产生抗性，克服了化学农药多次使用病原菌产生抗性的现象。

[0035] (6)本发明发现石菖蒲艾叶挥发油与目前常用防治根腐病的化学农药噁霉灵联用可产生协同作用(石菖蒲艾叶挥发油体积比1∶1混合液与噁霉灵联用)和加和作用(石菖蒲与噁霉灵联用；艾叶与噁霉灵联用)，可大大降低化学农药使用。

[0036] (7)本发明的石菖蒲和艾叶挥发油的制备方法简单，所需试剂成本低，有利于大量生产，便于防治黄精根腐病。

附图说明

[0037] 图1是不同体积比的石菖蒲艾叶挥发油对尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌菌落生长作用图。

[0038] 图2是挥发油作用下病原菌侵染黄精的病斑面积图，其中A.尖孢镰刀菌；B.腐皮镰刀菌。

具体实施方式

[0039] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明。

[0040] 实施例1

[0041] 石菖蒲和艾叶挥发油的制备方法

[0042] 步骤一：将阴干的石菖蒲和艾叶切成0.5‑0.6cm长度的小段，分别加入10倍水浸泡2小时；放置于5L圆底烧瓶中，用水蒸气蒸馏法蒸馏6h，得到的水油混合物用无水硫酸钠干燥后即分别得到石菖蒲和艾叶挥发油；

[0043] 步骤二：挥发油提取后用无水硫酸钠干燥，干燥棕色瓶存放备用。

[0044] 实施例2

[0045] 石菖蒲和艾叶挥发油的GC‑MS分析检测

[0046] 将实施例1制得的石菖蒲和艾叶挥发油进行GC‑MS分析，采用型号为Agilengt Technologies 7890B‑5977B气象色谱仪进行检测。

[0047] 色谱柱：HP‑5MS 30m×250μm×0.25μm。EI源电离源温度：230℃；四级杆温度：150℃，扫描范围：30‑500m/z；进样口温度：285℃，分流比10∶1；进样量：1μL；电子能量：70eV；柱温箱升温程序：50℃保持4min，5℃/min升温至120℃，1℃/min升温至180℃，10℃/min升温至280℃保持16min；其中RI值根据正构烷烃连续碳(C9‑C25)的保留时间计算得到，将化合物的保留时间和质谱与NIST 17.L数据库进行数据比对，并结合有关温馨，确定最终化合物，鉴定结果如表1和表2。

[0048] 表1为石菖蒲挥发油的GC‑MS分析结果

[0049]

[0050]

[0051] 表2为艾叶挥发油的GC‑MS分析结果

[0052]

[0053]

[0054]

[0055]

[0056]

[0057] 从表1、表2中我们可以看到，艾叶精油比石菖蒲精油成分更复杂，艾叶精油中鉴定出98个成分，占精油含量的80.42％，其中石竹素(7.8％)、β‑石竹烯(7.57％)、桉油精(4.74％)、樟脑(4.1％)和桃金娘烯醛(3.44％)是主成分。石菖蒲精油中共鉴定出34个化合物，占精油含量的90.01％，主成分主要有β‑细辛醚(31.06％)、α‑细辛醚(15.14％)、表水菖蒲酮(10.94％)、异水菖蒲二醇(6.11％)和顺式‑甲基异丁香油酚(5.45％)。经分析，萜类化合物是艾叶和石菖蒲挥发油成分的主类群，其中以单帖和倍半萜为主。

[0058] 实施例3

[0059] 石菖蒲和艾叶挥发油不同体积复配对尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌抑菌率测定[0060] 步骤1：将不同体积比(1∶1，1∶2，1∶3，2∶1，3∶1)的石菖蒲和艾叶精油溶解在2％二甲基亚砜(DMSO)‑0.1％吐温‑80(T‑80)水溶液，充分混合，浓度为50mg/mL，0.22μm的有机微孔滤膜滤过，备用；

[0061] 步骤2：在超净工作台中趁热将15mL的PDA培养基倒入培养皿中，冷却，备用。

[0062] 步骤3：将直径为5mm的菌丝体块置于培养皿中央，在菌盘周围等距离放置四个牛津杯(25mm)，然后将配置好的精油溶液(200μL)加入每个牛津杯中，同时加入同等体积的溶剂作为阴性对照。每个处理重复4次。

[0063] 步骤4：将上述培养皿置于28℃的恒温培养箱中培养，通过测量两个垂直直径的平均值进而得到真菌的径向生长，结果见图1和表3。

[0064] 生长抑制率计算如下：

[0065]

[0066] 表3不同体积比石菖蒲艾叶挥发油对尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌的生长影响

[0067]

[0068] 从图1和表3可得，生长同时间段后，体积比为1∶1复配的石菖蒲艾叶挥发油处理，尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌的菌落直径最小，所以可得：石菖蒲和艾叶挥发油体积比为1∶1复配抑菌活性最强。

[0069] 实施例4

[0070] 石菖蒲艾叶挥发油(体积比为1∶1)和化学农药对尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌最低抑菌浓度(MIC)测定

[0071] 步骤1：用1/4PDB液体培养基冲洗菌落，八层纱布过滤菌丝，用血球计数板在显微4
镜下计数，最终配置浓度为1×10个/毫升的孢子悬浮液。

[0072] 步骤2：将石菖蒲挥发油、艾叶挥发油、石菖蒲和艾叶挥发油体积比1∶1混合液以及阳性对照噁霉灵，用20/1000DMSO(二甲基亚砜)和1/1000吐温80(2‑DMSO‑T)混悬液进行溶解，通过0.22μL的有机滤头进行过滤，得到无菌滤液。

[0073] 步骤3：石菖蒲挥发油、艾叶挥发油、石菖蒲与艾叶挥发油体积比1∶1混合液以及噁霉灵(化学农药)分别采用二倍稀释法进行稀释，初始浓度为75mg/mL，通过二倍稀释法稀释得到一系列浓度为75‑0.1465mg/mL。在96‑孔板中，每个孔加入已过滤的挥发油溶液(50μL)和真菌悬浮液(150μL)。其中，以150μL的1/4PDB和50μL的2‑DMSO‑T混悬液作为空白对照，150μL真菌悬浮液和50μL的2‑DMSO‑T混悬液作为阳性对照，96‑孔板在28℃微生物培养箱中恒温培养36h。采用酶标仪(Thermo.Model：1510)在吸光度为595nm处测定每个孔的吸光度，当样品孔吸光度与空白对照孔吸光度差值为0时视为不出现真菌生长，此时对应的挥发油浓度值为MIC值，结果见表4。每个处理设置8个复孔。

[0074] 表4挥发油与噁霉灵对尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌的MIC值

[0075]

[0076]

[0077] 注：MIC是最小抑菌浓度。数据进行了8次重复，每个值代表8个数据用平均值±标准差进行了分析。差异用ANOVA(方差分析)检验显著性，显着性水平为p＜0.05。同一列不同字母字母表示具有显著性差异。

[0078] 表4结果表明，石菖蒲挥发油与艾叶挥发油体积比1∶1混合后，明显提高了抑菌效果，对尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌的抑菌效果都高于其单种挥发油抑菌效果，与化学农药噁霉灵抑菌效果没有显著差异。

[0079] 实施例5

[0080] 艾叶、石菖蒲精油对病原菌联合抑菌效果的测定

[0081] 步骤1：根据上述步骤测得挥发油对尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌的MIC。以MIC的8倍作为最高浓度，采用二倍稀释法依次对石菖蒲挥发油、艾叶挥发油、石菖蒲挥发油和艾叶挥发油1∶1体积比混合液、化学农药噁霉灵进行稀释，每个处理有8个浓度；

[0082] 步骤2：按棋盘设计法分别将不同浓度的挥发油与不同浓度的噁霉灵(各25μL)两两组合加入96孔板的横列和纵列；

[0083] 步骤3：每个孔中均含有不同浓度的2种药物的混合液，再加入菌液150μL，轻微振荡，混匀，28℃培养12‑18h后观察结果。

[0084] 步骤4：通过FICI(fractional inhibitory concentration)评价联合抑菌效果，结果见表5。

[0085] FICI＝(联用时MICA/单用MICA)+(联用时MICB/单MICB)

[0086] FICI≤0.5，协同；0.5＜FICI≤1.0，加和；1.0＜FICI≤4.0，无关；4.0＜FICI，拮抗。

[0087] 表5艾叶精油、石菖蒲精油及噁霉灵之间的联合抑菌效果评定

[0088]

[0089] 由表5可知，石菖蒲和艾叶挥发油分别与噁霉灵联用，均可产生加和作用，也就是“1+1＝2”的效果，而石菖蒲艾叶混合液与噁霉灵联用后，可产生“1+1＞2”的效果。加和作用表示石菖蒲和艾叶分别与噁霉灵联用，不会影响彼此的使用效果，而协同作用表示可使得彼此协同增效，减少使用量，但也可以达到预期的抑菌效果。

[0090] 实施例6

[0091] 沸石对石菖蒲艾叶挥发油的吸附

[0092] 步骤1：石菖蒲挥发油和艾叶挥发油按体积比为1∶1比例混匀后，称重配置0.04mg/mL的溶液。

[0093] 步骤2：将步骤1配置好的溶液按照每200μL与6颗粒径为5mm，分子量为218.24的人造沸石混匀，使得挥发油被沸石吸附。

[0094] 实施例7

[0095] 沸石吸附石菖蒲艾叶挥发油后对黄精切片的抑菌效果

[0096] 步骤1：用无菌水将PDA培养基上的尖孢镰刀菌Fusarium oxysproum和腐皮镰刀菌Fusarium solani冲洗下来，经神奇滤布过滤掉菌丝，用血球计数板在显微镜下调成所需浓6
度的孢子悬浮液(2×10个/mL)，备用；

[0097] 步骤2：在直径为90mm培养皿中放入3张浸透无菌水的滤纸；

[0098] 步骤3：将黄精切成厚薄均匀的圆形切片，直径约为为0.5cm，厚度为0.2‑0.3cm，每个培养皿中放入9片；

[0099] 步骤4：用移液枪吸取上述配置好的20μL孢子悬浮液置于黄精切片表面；

[0100] 步骤5：每个培养皿中放入吸附有浓度为0.04mg/mL挥发油的沸石6颗；对照中仅放入未吸附挥发油，仅吸附溶剂(2‑DMSO‑T)的沸石。每个处理6个平板。

[0101] 步骤6：将培养皿置于温度28℃、相对湿度85％和12h光照/12h黑暗条件下培养10d后查看病斑面积。结果见图2，计算病斑面积所占比率，结果见表6，病斑面积所占比率(％)＝病斑面积/黄精切片总面积*100。

[0102] 表6挥发油作用下病原菌侵染黄精的病斑面积所占比率

[0103]

[0104]

[0105] 由图2可知，沸石吸附挥发油的处理能够大大降低两种真菌菌丝生长速率，培养同样时间后，无挥发油处理的黄精切片，菌丝已经长满整个黄精切片；而挥发油处理后，菌丝生长速率迟缓，仅在少数黄精切片边缘可见少量菌丝的生长。通过表6数据统计表明，挥发油处理后，接种尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌的黄精切片病斑面积在比未处理的分别降低了80％和降低了75％。

[0106] 实施例8

[0107] 石菖蒲艾叶对盆栽黄精根腐病防控作用测定

[0108] 步骤1：吸附挥发油的沸石与营养土拌匀，每400g土壤混有10粒上述吸附了0.04mg/mL挥发油的沸石。对照混有相同数量仅吸附溶剂(2‑DMSO‑T)的沸石。

[0109] 步骤2：将长势均匀的一年生黄精幼苗(株高为10cm左右)根系放入尖孢镰刀菌/腐6
皮镰刀菌菌悬液中，孢子浓度为2*10个/mL，浸泡2h。每个处理40株。

[0110] 步骤3：将接种过菌悬液的黄精幼苗放入步骤1土里，将移栽好的黄精放于24℃的温室中12h光照/12h黑暗培养间中培养，观察发病状况并记录数据，结果见表7。

[0111] 发病率(DI)＝发病株数目/总株数目×100％

[0112] 病情分级如下：

[0113] 0级：植株健康；

[0114] 1级：植株叶片出现病斑；

[0115] 2级：植株萎蔫；

[0116] 3级：植株死亡

[0117] 病情指数(Di)＝∑[(Dn×Dg)/(Tn×Mg)]×100

[0118] Dn表示同一病情等级的植株数目，Dg表示相应的病情等级，Tn表示总植株数目，Mg表示最高病情等级。

[0119] 表7挥发油对黄精接种尖孢镰刀菌防控效果

[0120]

[0121] 注：每个值代表20个数据用平均值±标准差进行了分析。差异用ANOVA(方差分析)检验显著性，显着性水平为p＜0.05。同一列不同字母字母表示具有显著性差异。

[0122] 由表7可知，沸石吸附挥发油与土壤混匀之后，能够大大降低黄精根腐病的发病率和病情指数，同时能提高黄精叶绿素含量。